專利名稱：堿性艷蘭bo在dna檢測中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及堿性艷蘭BO(VPBBO)在瓊脂糖凝膠上對DNA染色的方法，其成本低、步驟簡單、操作時間短、靈敏度高而且染色后的背景顏色淺。另外，本發(fā)明還涉及檢測DNA的方法以及用于這些方法的試劑盒等。
背景技術(shù)：
在生命科學(xué)研究領(lǐng)域中，作為生物體內(nèi)的重要大分子，DNA是研究生命現(xiàn)象與本質(zhì)的物質(zhì)基礎(chǔ)，其主要功能是儲存、傳遞和表達生物體的遺傳信息，DNA與生命的異?，F(xiàn)象的發(fā)生和遺傳性疾病等緊密關(guān)聯(lián)。近年來隨著基因組學(xué)、功能基因組學(xué)和結(jié)構(gòu)基因組學(xué)的快速發(fā)展，它的應(yīng)用范圍越來越廣，幾乎滲透到生命科學(xué)的各個領(lǐng)域。因此，如何進一步研究 和發(fā)展高靈敏度、高選擇性和簡便快捷的DNA測定新體系與新方法，自然成為分析研究工作者關(guān)注的研究方向。目前，瓊脂糖凝膠電泳是高效分離和分析DNA分子的一種常用方法，使得凝膠上DNA的檢測技術(shù)對DNA的相關(guān)研究起著至關(guān)重要的作用。測定DNA含量的方法有多種，目前用于瓊脂糖上DNA研究和測定的方法有熒光染色法、染料染色法、負(fù)染法、銀染法等。DNA熒光檢測法因具有快速便捷、靈敏度高等優(yōu)點而成為常用的DNA檢測方法之一，其使用諸如溴化乙錠(EB)、SYBR green、SYBR gold等熒光染料，如紫外光線(UV)的照射下發(fā)出熒光，可用于檢測瓊脂糖凝膠上的DNA條帶[1-4]。然而，這些熒光染料都具有一些不可克服的缺點，尤其是EB，由于其能嵌入DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)中，可破壞DNA樣品，從而具有較強的致畸致突變作用，對實驗操作者具有潛在危險；此外EB檢測的凝膠需要在紫外燈下進行檢識，而紫外射線常常導(dǎo)致核酸雜交、聚合，對其結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。，同時熒光檢測儀器設(shè)備成本也比較高[5-7]。因此，肉眼可見、操作簡單、無毒、低成本的可視有機染料成為替代熒光染料為DNA染色的選擇之一。已經(jīng)有一些報道公開了可視有機染料用于瓊脂糖凝膠上DNA的染色方法，如亞甲藍[8]、亮甲酚藍[9]、結(jié)晶紫[10]、以及尼羅河藍[11，12]等。但是，這些染料染色和脫色時間長，而且靈敏度較低，普遍不如熒光染料。為此，本發(fā)明人經(jīng)過長期實踐研究，令人驚訝地在發(fā)現(xiàn)成本低的堿性艷蘭BO (Victoria pure blue B0,VPBB0)可用于在瓊脂糖凝膠上對DNA染色，其可以在10分鐘的染色時間內(nèi)檢測出低至0.8-1. 6ng級的DNA，靈敏度是尼羅藍(NB)的四倍，近似EB等熒光染料的靈敏度。另外，本發(fā)明人還發(fā)明了基于上述染色法的檢測DNA的方法以及用于這些方法的試劑盒等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供VPBBO染色法，其能對在瓊脂糖凝膠中的DNA染色，該方法安全、操作方便、成本低，而且靈敏度高。另外，本發(fā)明的目的還在于提供檢測DNA的方法以及用于這些方法的試劑盒等。VPBBO是一種無毒性的萘基二苯甲烷類染料，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，VPBBO的分子結(jié)構(gòu)和DNA分子具有很強的親和力，但是VPBBO分子結(jié)構(gòu)和瓊脂糖結(jié)合的能力則弱得多，從而能夠使DNA (相對于瓊脂糖凝膠基質(zhì))顯出顏色。優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面中，所述染色液中堿性艷蘭BO的濃度為0.001%至0.01%，優(yōu)選為0.003%至0.008%，最優(yōu)選為0.005%。本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，VPBBO濃度過低，則染色后的顏色強度會有下降，而濃度過高，VPBBO會使背景也過多地染上色，從而降低圖像的對比度，如圖2。另外，在本文中如未特別指出，所述“溶液”均為水溶液，即溶劑為水，優(yōu)選明示出其中所含的溶質(zhì)為所述溶液中的全部溶質(zhì)；也優(yōu)選對于液體溶質(zhì)來說，其百分比濃度指的是體積百分比濃度，而對于固體溶質(zhì)來說，其百分比濃度指的是質(zhì)量百分比濃度。在現(xiàn)有的染色方法中，有機溶劑常用來作為染色的介質(zhì)或固定劑，用以提高染色強度，從而提高靈敏度。本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，加入有機溶劑乙醇能更好的溶解VPBBO并能有效提高瓊脂糖凝上的DNA染色強度。所述染色液中乙醇濃度為5%至50%，優(yōu)選5%至·20%，最優(yōu)為10%。優(yōu)選所述有機溶劑選自甲醇、乙醇、甘油和丙二醇之一或多種。在現(xiàn)有的染色方法中，無機鹽常用來降低凝膠背景上染色的程度。本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，加入無機鹽NaHCO3后可使凝膠背景上的染色強度達到最強。所述染色液中NaHCO3濃度為0. 01 %至5%，優(yōu)選0. 05%至I %，最優(yōu)為0.1 %。優(yōu)選所述無機鹽選自NaHC03、NaCl、MgCl2、ZnCl2和(NH4)2SO4之一或多種。最優(yōu)選，本發(fā)明第一方面所述的方法中所述的染色液是VPBBO的溶液，其中溶質(zhì)含VPBBO和NaHCO3,溶劑為含10%乙醇的水溶液。染色后，需將瓊脂糖凝膠進行脫色，以洗去其表面殘留的染色液，然后用于觀察結(jié)果。優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面，所述方法包括在染色后洗滌的步驟。更優(yōu)選本發(fā)明第一方面所述的方法由將瓊脂糖凝膠浸入含堿性艷蘭BO的染色液中染色的步驟和在染色后洗滌的步驟組成。在本文中，“洗滌”指的是用溶劑清洗瓊脂糖凝膠，用以洗去上一步驟殘留在瓊脂糖凝膠上的試劑。其中，優(yōu)選溶劑是醇、水、生理鹽水或緩沖液，如Tris-HCl緩沖液、PBS緩沖液等。洗滌的時間為I至30分鐘，優(yōu)選是I分鐘至10分鐘。優(yōu)選洗滌是先用醇洗然后用水洗。在本發(fā)明的具體實施方式
中，先用40%乙醇溶液，I %冰醋酸水溶液沖洗2-3分鐘，接著用去離子水清洗I分鐘。在本發(fā)明的第一方面中，染色的時間為至少5分鐘。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，染色的時間可以不必過長。因此出于節(jié)約操作時間的考量，優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面中，染色的時間優(yōu)選為5至240分鐘，更優(yōu)選為10至45分鐘，最優(yōu)選為10分鐘。在第二方面，本發(fā)明的目的在于提供用于本發(fā)明第一方面所述方法的試劑盒，其包括分裝的PH為6-8的含堿性艷蘭BO的染色液。所述試劑盒還可以包括分裝的醇，如40%乙醇，I %冰醋酸溶液。更優(yōu)選所述試劑盒中染色液中各組分的含量如本發(fā)明第一方面所優(yōu)選的那樣。盡管不優(yōu)選，但是所述試劑盒還可以包括分裝的水，如去離子水。在本文中，試劑盒具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所能理解的含義，在本文中，其包括分開的容器，分別包裝(即，分裝)不同的溶液。這樣，不同的溶液之間不會發(fā)生混合。其中，容器是任何能夠保存其所儲存的溶液的容器，如玻璃瓶、塑料罐等，優(yōu)選是能夠長期保存其所儲存的溶液的容器。另外，優(yōu)選本發(fā)明第二方面的試劑盒還包括記載有本發(fā)明第一方面所述方法的說明書。說明書可以是獨立的，如紙質(zhì)說明書，其被放入試劑盒中；說明書也可以是直接印刷在試劑盒上的，如可以印刷在試劑盒中的一個或多個容器上。在第三方面，本發(fā)明的目的在于提供在瓊脂糖凝膠上檢測DNA的方法，其包括在瓊脂糖凝膠上進行電泳，然后進行本發(fā)明第一方面所述的方法。瓊脂糖凝膠電泳是本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)，其方法步驟及使用的試劑、設(shè)備可參見《分子克隆實驗指南》(科學(xué)出版社，2002)等書籍或?qū)嶒炇謨裕灿性S多已經(jīng)商品化了。在第四方面，本發(fā)明的目的在于提供用于本發(fā)明第三方面所述方法的試劑盒，其包括分裝的瓊脂糖凝膠電泳試劑和PH為6-8的含堿性艷蘭BO的染色液。瓊脂糖凝膠電泳試劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，其可以通過商業(yè)渠道容易地購買。所述試劑盒還可以包括分裝的醇，如40%乙醇，I %冰醋酸溶液。更優(yōu)選所述試劑盒中染色液中各組分的含量如本發(fā)明第一方面所優(yōu)選的那樣。盡管不優(yōu)選，但是所述試劑盒還可以包括分裝的水，如去離子水。另外，優(yōu)選本發(fā)明第四方面的試劑盒還包括記載有本發(fā)明第三方面所述方法的說明書。說明書可以是獨立的，如紙質(zhì)說明書，其被放入試劑盒中；說明書也可以是直接印刷在試劑盒上的，如可以印刷在試劑盒中的一個或多個容器上。在第五方面，本發(fā)明的目的在于提供堿性艷蘭BO在制備用于在瓊脂糖凝膠上對 DNA染色的染色液中的應(yīng)用。本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，VPBBO的分子結(jié)構(gòu)和DNA分子具有很強的親和力，但是VPBBO分子結(jié)構(gòu)和瓊脂糖結(jié)合的能力則弱得多，從而能夠使DNA(相對于瓊脂糖凝膠基質(zhì))顯出顏色。因此，VPBBO作為對瓊脂糖凝膠中DNA染色的有效成分可以配制入染色液中，從而制備形成用于在瓊脂糖凝膠上對DNA染色的染色液。為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發(fā)明進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例和附圖僅是為了說明，尤其是權(quán)利要求書和說明書中位于括號內(nèi)的附圖標(biāo)記僅僅是為了方便閱讀時的理解，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，本發(fā)明引用了公開文獻，這些文獻也是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本發(fā)明進行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本發(fā)明說明書中重復(fù)敘述過一樣。


圖1顯示了 VPBBO的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。 圖2顯示了本發(fā)明的VPBBO染色法中以不同VPBBO濃度的效果變化曲線，以不同的VPBBO濃度染色得到的強度變化.圖3顯示了本發(fā)明的VPBBO染色法與其他2種比較例的方法的染色照片，其中，(A)本發(fā)明的VPBBO染色法，(B)現(xiàn)有的EB染色法，(C)現(xiàn)有的NB染色法。泳道從左至右上樣的入 DNA/HindIII 分子量標(biāo)記的量分別為(1)100，(2)50，(3)25，(4)12.5，(5)6.4，
(6)3. 2，(7)1. 6，(8)0. 8ng。圖4顯示了本發(fā)明的VPBBO染色法與與其他2種比較例的方法在自提的CKGF質(zhì)粒中的比較圖，其中，(A)本發(fā)明的VPBBO染色法，(B)現(xiàn)有的EB染色法，(C)現(xiàn)有的NB染色法。泳道最左邊是50ng A DNA/HindIII，依次從左往右是進行倍倍稀釋的自提的CKGF質(zhì)粒。
具體實施例方式以下通過具體的實施例進行說明，其中未特別詳細說明的材料、步驟均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，如可參見《分子克隆實驗指南》(科學(xué)出版社，2002)等書籍或?qū)嶒炇?br> nn
/ttr o I，實驗材料堿性艷蘭BO (VPBBO)、溴化乙錠(EB)、尼羅藍(NB)、EDTA、Tr i s和冰醋酸購自Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis,MO,美國)。入 DNA/HindIII 購自碧云天生物技術(shù)有限公司(上海，中國)。其他化學(xué)產(chǎn)物均通過市售渠道購買。2，電泳和圖像分析根據(jù)常規(guī)的瓊脂糖電泳法進行，簡要過程如下用TAE緩沖液(ImM EDTA，40mMTris-acetate,pH 8.0))溶解瓊脂糖并聚合成0. 8%瓊脂糖凝膠(60_X60_X3mm)。分子量標(biāo)記用Tris-EDTA(TE)緩沖液(IOmM EDTA, IOOmM Tris-Cl, pH 8.0)稀釋成各個濃度并上樣到凝膠的各個泳道上對于上樣的是X DNA/HindIII分子量標(biāo)記來說，使得每個泳道的入DNA/HindIII分子量標(biāo)記的上樣量分別為100,50,25,12.8,6.4,3. 2，1. 6和0. 8ng ;溴酹藍和二甲苯胺FF(xylene cyanol FF)作為電泳過程中指示前沿的標(biāo)記。用Miniprotean III dual slab cells (BioRad, Hercules, CA,美國)和 PAC 300 (BioRad)進行電泳，電泳直至溴酚藍到達凝膠底部邊緣，一般需要30分鐘。電泳完成后的凝膠分別用以下染色法進行染色并觀察顯色結(jié)果。用VPBB0、NB染色的凝膠利用掃描儀(Epson Perfection V700 Photo，美國)以600dpi的分辨率掃描成圖像；用EB染色的凝膠在302nm波長的紫外燈照射下用Molecular Imager Gel Doc XR成像系統(tǒng)(BioRad)拍成照片(圖像)，然后用計算機定量分析DNA條帶的顯色結(jié)果，其中圖像定量分析軟件為 Multi Gauge software of Science Lab 2006 (FUJIFILM Corporation,日本)。3，本發(fā)明的VPBBO染色法的實施例VPBBO溶解于50%乙醇溶液中配成0.5%的VPBBO溶液。然后，用去離子水將VPBBO溶液稀釋成不同濃度的VPBBO溶液，最終溶液中VPBBO的濃度分別為0. 0005%至0. 01% ;同時，將VPBBO溶液通過加入甲醇、乙醇、甘油、丙二醇來調(diào)節(jié)成含不同有機溶劑種類和濃度的VPBBO溶液，使最終溶液中的有機溶劑的含量分別為0(最初溶解VPBBO的50%乙醇溶液可以忽略不計)或5%至40%;同時，將VPBBO溶液通過加入NaHCO3、NaCl、MgCl2、ZnCl2, (NH4) 2S04來調(diào)節(jié)成含不同無機鹽種類和濃度的VPBBO溶液，使最終溶液中的無機鹽濃度分別為0% (調(diào)節(jié)pH時加入的酸或堿可以忽略不計)至10%。此外，我們還對脫色液進行優(yōu)化，在脫色液中加入醇、水、生理鹽水或緩沖液，如Tris-HCl緩沖液、PBS緩沖液等來調(diào)節(jié)成含不同有機溶劑種類和濃度的脫色液，使最終溶液中的有機溶劑的含量分別為0或5%至100%。同時加入檸檬酸，蘋果酸，冰醋酸，草酸，酒石酸等不同的酸調(diào)節(jié)成含不同酸種類和濃度的脫色液溶液，使最終溶液中的酸濃度分別為0%至10%。這一系列實驗的結(jié)果比較如下(I)VPBBO的濃度對染色的影響溶液中以0. 0005% -0. 01% VPBBO的濃度分別進行染色，其結(jié)果如圖2所示，綜合DNA條帶的檢測靈敏度以及DNA和背景之間的圖像對比度，發(fā)現(xiàn)0. 005%的VPBBO濃度是最佳的。盡管濃度低至0. 004%, VPBBO仍舊能對凝膠上的DNA進行染色，但是染色后的顏色強度會有下降，而高于0. 006%的VPBBO濃度會使背景也過多地染上色，從而降低圖像的對
(2)溶液中的有機溶劑對染色的影響在染色中，甲醇、乙醇、甘油、丙二醇等有機溶劑常用來作為染色的介質(zhì)或固定劑，用以提高染色強度，從而提高靈敏度。經(jīng)過實驗，發(fā)現(xiàn)加入10 %乙醇溶液更能有效溶解VPBBO并能有效提高瓊脂糖凝上DNA的染色強度。(3)溶液中的無機鹽對染色的影響在染色中，NaHCO3、NaCl、MgCl2、ZnCl2、(NH4)2SO4等無機鹽常用來降低凝膠背景上染色的程度。經(jīng)過實驗，發(fā)現(xiàn)加入0.1 % NaHCO3后DNA條帶的染色強度最好，但是當(dāng)無·機鹽濃度過高或過低時，對其染色強度影響不大或使其降低，故在染色液選用重量體積比為0. 1% NaHCO30(4)染色時間對染色的影響用含0.005% VPBB0，10%乙醇，0.1 % NaHCO3的溶液對不同凝膠分別染色5、10、
20、60、120、和240分鐘，發(fā)現(xiàn)染色時間超過10分鐘并不會顯著增強DNA條帶相對于背景的染色強度，超過10分鐘后靈敏度基本保持平穩(wěn)，而低于10分鐘則會時間長度依賴性地降低染色強度。(5)脫色液中的有機溶劑對染色的影響在脫色時，優(yōu)選脫色液溶劑是醇、水、生理鹽水或緩沖液，如Tris-HCl緩沖液、PBS緩沖液等。經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)，用40% -60%乙醇溶液洗滌能使DNA在瓊脂糖凝膠上的脫色效果達到最好，為了節(jié)約成本，我們選用40%乙醇。(6)脫色液中酸對染色的影響在脫色時，加入不同的酸進行優(yōu)化，優(yōu)選檸檬酸，蘋果酸，冰醋酸，草酸，酒石酸等。經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)，在脫色液中加入I %冰醋酸能使DNA在瓊脂糖凝膠上的脫色效果達到最好。(7)脫色時間對染色的影響用含40%乙醇，I %冰醋酸的洗滌液對不同凝膠分別洗滌0. 5，1,3,5,8,10和15分鐘，發(fā)現(xiàn)脫色時間過長超過3分鐘則DNA條帶相對于背景的染色強度大幅度降低，而低于3分鐘則染色液不能被洗脫，使得染色背景太深，也會降低染色強度。4，比較例1:現(xiàn)有的EB染色法根據(jù)Samtoook J等[13]的手冊進行染色?；具^程如下電泳后，瓊脂糖凝膠浸在0. 5 ii g/mL的EB溶液中染色15分鐘。5，比較例2 現(xiàn)有的NB染色法根據(jù)Yong-1I Yang等[12]的論文進行染色。基本過程如下NB溶解于甲醇配成0.1 %的NB溶液，然后用去離子水將其稀釋成0. 0015% NB溶液。電泳后，瓊脂糖凝膠浸在IOOmLO. 0015% NB溶液中染色40分鐘，并用50%乙醇洗脫。整個染色過程均在搖床上操作。6，結(jié)果比較本發(fā)明的用VPBBO對在瓊脂糖凝膠中的DNA染色的方法能以約20分鐘完成，其可以檢測到低至0. 8ng的入DNA/HindIII分子量標(biāo)記，接近于現(xiàn)有的EB染色法的0. 5ng的檢測效果，超過現(xiàn)有的NB染色法的檢測極限(參見圖3)。參考文獻
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權(quán)利要求
1.在瓊脂糖凝膠上對DNA染色的方法，其特征在于，所述方法包括將瓊脂糖凝膠浸入PH為6-8的含堿性艷蘭BO的染色液中染色。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其包括染色及在染色后洗滌的步驟。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述染色液中堿性艷蘭BO的濃度為O.001%至O.01%，優(yōu)選為 O. 003% 至 O. 008%，最優(yōu)選為 O. 005%。
4.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述染色液含有10%乙醇，優(yōu)選所述有機溶劑選自甲醇、乙醇、甘油和丙二醇之一或多種。
5.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述染色液含O.1 % NaHCO3,優(yōu)選所述無機鹽選自NaHC03、NaCUMgCl2, ZnCl2 和(NH4)2SO4 等之一或多種。
6.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中染色的時間為至少5分鐘，優(yōu)選為5至240分鐘，更優(yōu)選為10至45分鐘，最優(yōu)選為10分鐘。
7.用于權(quán)利要求1-6之任一所述方法的試劑盒，其包括分裝的pH為6-8的含堿性艷蘭BO的染色液。
8.堿性艷蘭BO在制備用于在瓊脂糖凝膠上對DNA染色液中的應(yīng)用。
9.在瓊脂糖凝膠上檢測DNA的方法，其包括在瓊脂糖凝膠上進行電泳，然后進行權(quán)利要求1-6之任一所述方法。
10.用于權(quán)利要求9所述方法的試劑盒，其包括分裝的瓊脂糖凝膠電泳試劑和pH為6-8的含堿性艷蘭BO的染色液。
全文摘要
本發(fā)明涉及堿性艷蘭BO(Victoria pure blue BO，VPBBO)在瓊脂糖凝膠上對DNA染色的方法，其中染色液為pH為6-8的含堿性艷蘭BO的溶液。另外，本發(fā)明還涉及基于上述方法的在瓊脂糖凝膠上檢測DNA的方法以及用于這些方法的試劑盒等。本發(fā)明具有靈敏度高、操作簡單迅速、重現(xiàn)性好、染色背景低、線性范圍廣、可逆性強、使用安全、成本低廉等優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK102994626SQ20111028216
公開日2013年3月27日 申請日期2011年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月15日
發(fā)明者金利泰, 叢維濤 申請人:溫州安得森生物科技有限公司