專利名稱：枸杞番茄紅素β-環(huán)化酶基因及包括該基因的重組載體和宿主細胞及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種枸杞(Lycium chinense Miller)番茄紅素β-環(huán)化酶基因及包括該基因的重組載體和宿主細胞及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物類胡蘿卜素生物合成途徑中，番茄紅素的環(huán)化反應(yīng)是其中最重要的分支點， 在線性番茄紅素的兩端對稱環(huán)化形成兩個紫羅蘭酮環(huán)，則產(chǎn)生類胡蘿卜素。番茄紅素β-環(huán)化酶(Lycopene β-cyclase, LycB)是類胡蘿卜素生物合成途徑中重要的限速酶，催化番茄紅素向β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化[Bartley GE, Scolnik PA, Plant carotenoids pigments for photoprotection, visual attraction, and human health, Plant Cell, 1995,7 :1027-1038] 目前為止，已從大豆、番茄、辣椒、擬南芥、玉米、黃水仙、野生煙草等植物中分離到LycB基因。類胡蘿卜素是C40的碳氫化合物，廣泛存在于植物、一些光合細菌以及藻類中的脂溶性色素，主要包括胡蘿卜素(carotenes)和它們的氧化衍生物葉黃素(xanthophylls) 兩大類。類胡蘿卜素在植物光合作用中起著至關(guān)重要的作用，它們是光合天線和光反應(yīng)中心復(fù)合體不可缺少的結(jié)構(gòu)成分，還可以保護葉綠素免受強光導(dǎo)致的光氧化破壞。類胡蘿卜素是維生素A的前體，具有增強免疫、抗氧化、增進細胞縫間聯(lián)接交流、預(yù)防、延緩及治療癌癥的功能。Aluru等將細菌crtB(pds)和crtl基因串聯(lián)在一起，在玉米胚乳中特異性表達， 胚乳中類胡蘿卜素含量提高34倍，并積累了大量的維生素A的前體β-胡蘿卜素[Aluru Μ, Xu Y, Guo R, et al, Generation of transgenic maize with enhanced provitamin A content,J Exp Bot，2008，59(13) :3551-3562]。生物系統(tǒng)中一旦形成高度活潑的具有損傷能力的自由基后，就會對細胞遺傳物質(zhì)和細胞膜進行強烈的破壞，導(dǎo)致細胞功能下降，機體衰老以及疾病的發(fā)生。類胡蘿卜素，尤其是胡蘿卜素能抑制、清除體內(nèi)自由基，可以延緩衰老和預(yù)防腫瘤、血栓、動脈粥樣硬化等疾病。類胡蘿卜素能增加免疫系統(tǒng)中B細胞的活力、消滅外源入侵的病原菌，能提高淋巴輔助T細胞的活力，協(xié)助B細胞產(chǎn)生抗體，并提高其他免疫組分的活性；還能增加自然殺傷細胞的數(shù)目，以消除機體內(nèi)被感染的細胞或癌細胞。據(jù)報道，除胡蘿卜素外，番茄紅素等也有增加免疫力的功能。隨著人類對類胡蘿卜素藥用價值及醫(yī)療保健作用的不斷發(fā)現(xiàn)，對類胡蘿卜素的種類和產(chǎn)量的需求也將越來越大，然而，類胡蘿卜素很難用化學方法合成?，F(xiàn)代分子生物學研究手段的發(fā)展，使得類胡蘿卜素生物合成途徑中的一系列關(guān)鍵酶的基因被陸續(xù)分離鑒定， 為通過DNA重組技術(shù)和遺傳工程調(diào)控生產(chǎn)類胡蘿卜素開辟了道路，特別是通過類胡蘿卜素基因工程獲得“金色水稻”和“金油菜”，極大地增強了人們開展植物類胡蘿卜素基因工程的信心。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種枸杞番茄紅素β -環(huán)化酶基因。本發(fā)明的第二個目的是提供該基因編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的目的還在于提供含有該基因的重組載體和宿主細胞。本發(fā)明的另一個目的在于提供該基因的用途。本發(fā)明提供了一種枸杞番茄紅素β-環(huán)化酶基因LmLycB，如序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列構(gòu)成。本發(fā)明提供了一種上述枸杞番茄紅素β-環(huán)化酶基因LmLycB編碼的蛋白質(zhì)，如序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供了一種上述枸杞番茄紅素β-環(huán)化酶基因LmLycB重組克隆載體 pBS-T-LmLycB。含有上述的枸杞番茄紅素β -環(huán)化酶基因LmLycB的重組載體，這些重組載體包括質(zhì)粒和植物表達載體。所述的質(zhì)粒表達載體大腸桿菌表達載體pMON-LmLycB。所述的重組植物表達載體pCAMBIA2300-LmLycB-Bar。含有上述枸杞番茄紅素β -環(huán)化酶基因LmLycB完整編碼閱讀框序列的宿主細胞， 如含有上述重組載體的宿主細胞也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述的宿主細胞選自大腸桿菌細胞、農(nóng)桿菌細胞或玉米細胞。本發(fā)明提供了兩種含有LmLycB基因工程菌。上述枸杞番茄紅素β -環(huán)化酶基因LmLycB的應(yīng)用包括該LmLycB基因編碼的蛋白在大腸桿菌和植物中的應(yīng)用；用所述的重組載體，如植物表達載體轉(zhuǎn)化玉米細胞；或者用所述含有該基因的農(nóng)桿菌與玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、馬鈴薯、棉花、谷子、大麥以及花卉和蔬菜等細胞共培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)基因的再生植株；或者用所述的枸杞番茄紅素環(huán)化酶基因LmLyc遺傳轉(zhuǎn)化獲得上述物種轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的技術(shù)方案具體概述如下一種枸杞番茄紅素β -環(huán)化酶基因LmLycB，如序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，還包括SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的70%以上同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。一種含有番茄紅素β -環(huán)化酶基因LmLycB的重組載體pMON-LmLycB的大腸桿菌 DH5a。一種含有番茄紅素β -環(huán)化酶基因LmLycB的重組載體pCAMBIA2300-LmLycB_Bar 的農(nóng)桿菌C58。一種番茄紅素β -環(huán)化酶基因LmLycB編碼的蛋白，如序列表中SEQ ID Ν0. 2所示
氨基酸序列。一種番茄紅素β -環(huán)化酶基因LmLycB編碼的蛋白在大腸桿菌中的表達應(yīng)用。一種番茄紅素β -環(huán)化酶基因LmLycB編碼的蛋白在玉米中的應(yīng)用。所述的枸杞番茄紅素β -環(huán)化酶基因還應(yīng)用于制備轉(zhuǎn)基因大豆、水稻、花生、向日葵、馬鈴薯、棉花、谷子、大麥以及花卉和蔬菜等植株。本發(fā)明的克隆方法由下述步驟組成
從枸杞葉片中提取總RNA，根據(jù)GenBank中其他植物中的番茄紅素β -環(huán)化酶的氨基酸序列設(shè)計簡并引物Ρ1，其特征是具有序列表中SEQ ID NO. 3所示的序列。然后利用 3' RACE方法擴增得到完整的基因序列為1506bp。本發(fā)明構(gòu)建含番茄紅素β -環(huán)化酶基因LmLycB的大腸桿菌表達載體pMON-LmLycB 和植物表達載體pCAMBIA2300-LmLycB-Bar，由下述步驟組成1)構(gòu)建含有番茄紅素β -環(huán)化酶基因LmLycB的中間載體pBS-T-LmLycB 設(shè)計由SEQ ID NO. 3所示的上游引物P1，和由SEQ ID NO. 4所示的下游引物P2，以枸杞番茄紅素β -環(huán)化酶基因的cDNA為模板，進行PCR擴增，將PCR擴增產(chǎn)物連接于pBS_T 載體，獲得含有序列表中SEQ ID NO. 1所示的LmLycB基因的中間載體pBS-T-LmLycB。2)構(gòu)建大腸桿菌表達載體pMON-LmLycB 設(shè)計由SEQ ID N0. 5所示的上游引物P3，和由SEQ ID N0. 6所示的下游引物P4， 以質(zhì)粒pBS-T-LmLycB為模板，進行PCR擴增，將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)BamHI和MlI酶切后，將大腸桿菌表達載體pMON-LmLycB經(jīng)BamHI和MlI酶切，二者進行連接反應(yīng)，得到大腸桿菌表達載體pMON-LmLycB。3)構(gòu)建植物表達載體 pCAMBIA2300-LmLycB_Bar 設(shè)計由SEQ ID N0. 7所示的上游引物P5，和由SEQ ID N0. 8所示的下游引物P6， 以質(zhì)粒pBS-T-LmLycB為模板，進行PCR擴增，將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)BamHI和MlI酶切后，將植物表達載體PCAMBIA2300-35S-0CS經(jīng)BamHI和MlI酶切，二者進行連接反應(yīng)，得到植物表達載體 pCAMBIA2300-LmLycB。然后利用BioI酶切位點，將PCAMBIA2300-LmLycB載體上的NPTII基因去除，從 5'到3'方向插入了抗草胺膦的Bar基因，得到pCAMBIA2300-LmLyCB-Bar植物表達載體。本發(fā)明提供了一種枸杞番茄紅素環(huán)化酶基因及包括該基因的重組載體和宿主細胞及應(yīng)用，首次從枸杞中分離出編碼番茄紅素β-環(huán)化酶的完整cDNA，連接到大腸桿菌表達載體上，利用外源表達系統(tǒng)驗證枸杞LmLycB基因在蛋白水平表達的產(chǎn)物具有酶的活性。然后連接到植物表達載體上，利用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化玉米，獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行 HPLC檢測，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因玉米葉片總類胡蘿卜素含量為165. 70μ g/g Fff,比野生型玉米提高了 12. 76%，其中β-胡蘿卜素含量為80. 17 μ g/g FW，比野生型玉米提高了 54.83%。 見表2。本發(fā)明從枸杞中分離出編碼番茄紅素β-環(huán)化酶的基因LmLycB，該基因的過量表達能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因玉米中胡蘿卜素生物合成量的提高。通過基因工程育種方法改變代謝途徑，來提高胡蘿卜素產(chǎn)量，以更好、更準確地達到農(nóng)作物營養(yǎng)育種的目的，或通過利用微生物作為生物反應(yīng)器來生物合成相關(guān)β-胡蘿卜素，以滿足人們的營養(yǎng)需要。


圖 IpMON-LmLycB 載體示意圖。圖 2pM0N_LmLycB PCR、酶切驗證結(jié)果。圖 3pCAMBIA2300-LmLycB_Bar 載體示意圖。圖 4pCAMBIA2300-LmLycB-Bar PCR、酶切驗證結(jié)果。圖5LmLycB在大腸桿菌中的表達。
圖6表達LmLycB的大腸桿菌HPLC檢測結(jié)果。圖7轉(zhuǎn)基因玉米基因組PCR驗證電泳結(jié)果。圖8轉(zhuǎn)基因玉米RT-PCR驗證電泳結(jié)果。圖9野生型玉米與轉(zhuǎn)基因玉米葉片類胡蘿卜素的HPLC檢測結(jié)果。
具體實施例方式實施例1實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件以及手冊中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。枸杞番茄紅素β -環(huán)化酶基因LmLycB的克隆以 RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN,German)試劑盒，從 IOOmg 新鮮枸杞葉片中提取Total RNA，根據(jù)GenBank中玉米、煙草、擬南芥、胡蘿卜、青椒等物種中的番茄紅素β-環(huán)化酶的氨基酸序列設(shè)計簡并引物Ρ1，如序列表中SEQ ID NO. 3所示的序列。利用3' -FULL RACE Core Set Ver. 2. 0 (TaKaRa, Japan)試劑盒擴增得到完整的基因序列。具體步驟① 以Total RNA為模板，使用3' RACE Adaptor引物進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成1st Strand cDNA， 反應(yīng)體系如下 RNA 2 μ 1 3 ‘ RACEAdaptor 1 μ 1 5XM-MLV Buffer 2μ 1dNTPMixture 1 μ 1RNase Inhibitor 0. 25 μ 1Reverse Transcriptase M-MLV 0.25 μ 1RNase Free dH20 3. 5 μ 1 反應(yīng)條件:42°C,60min ；70°C，15min。②由SEQ ID NO. 3所示的上游引物Pl，和由SEQ ID NO. 4所示的下游引物P2，以 1st Strand cDNA為模板，進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系如下1st PCR 產(chǎn)物2μ1dNTP Mixture 8 μ 1Pl:2μ 1Ρ2 2 μ 110XLA PCR BufferII 4μ 1MgCl2 3 μ 1TaKaRa LATaq 0. 25 μ 1dH20 28. 75 μ 1反應(yīng)條件94°C，3min；94°C，30sec ；55°C，30sec ；72°C，2min30sec ；72°C, IOmin, 30個循環(huán)。實施例2中間載體pBS-T-LmLycB的構(gòu)建過程將SEQ ID NO. 1所示的LmLycB基因與pBS_T載體連接，反應(yīng)體系如下
目的PCR片段3 μ 1 pBS-T 載體1 μ 1 2XT4DNA Rapid Ligation Buffer 5 μ 1 T4DNA Ligase 1 μ 1 反應(yīng)條件23°C，10min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E-Coli. T0P10，涂布于含氨芐的LB平板。以目的基因為引物進行PCR (反應(yīng)條件94°C，3min ；94°C，30sec ；54 °C, 30sec ；72 °C，
2min30sec ；72°C，lOmin，30個循環(huán)。)得到1800bp產(chǎn)物，提取質(zhì)粒分別經(jīng)BamHI和PstI 雙酶切37°C，16hrs，酶切(15 μ 1 質(zhì)粒 DNA, 3 μ 1 R buffer，0. 5 μ IBamHI 外切酶，0. 5 μ 1 PstI外切酶，13 μ 1 ddH20)得到目的條帶，最后送華大基因測序公司測序，結(jié)果表明載體構(gòu)
建正確。實施例3大腸桿菌表達載體pMON-LmLycB的構(gòu)建過程首先，以pBS-T-LmLycB為模版，P3和P4分別為上下游引物擴增LmLycB片段，其反應(yīng)條件為 94°C，3min ； 94°C，30sec ；55°C，30sec ；72 °C，2min30sec ；72 °C，lOmin，30 個循環(huán)。在P3中引入BamHI酶切位點(GGATCC)和一個堿基A，在P4中引入Mil酶切位點 (GTCGAC)。然后，PCR產(chǎn)物與ρΜ0Ν38201質(zhì)粒分別經(jīng)BamHI和Mil雙酶切，將二者酶切產(chǎn)物連接16°C，16hrs，連接 Ομ 1 10 X T4buffer, 0. 5 μ 1 T4DNA 連接酶，5 μ 1 載體 DNA，7. 5 μ 1 外源DNA, 5 μ 1 (MH2O)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ecoli. DH5 α，涂布于含Amp的LB平板，如圖1所示， 為所構(gòu)建的PMON-LmLycB載體示意圖。以目的基因為引物進行PCR得到1500bp產(chǎn)物，酶切鑒定得到目的條帶，最后送華大基因測序公司測序，結(jié)果表明載體PMON-LmLycB構(gòu)建正確， 如圖2，為pMON-LmLycBPCR和酶切驗證結(jié)果。將構(gòu)建好的植物表達載體pMON-LmLycB轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α 實施例4植物表達載體pCAMBIA2300-LmLycB_Bar的構(gòu)建過程首先，以pBS-T-LmLycB為模版，P5和P6分別為上下游引物擴增LmLycB片段，其反應(yīng)條件為 94°C，3min ；94°C，30sec ；55°C，30sec ；72 °C，2min30sec ；72 °C，lOmin，30 個循環(huán)。在P5中引入BamHI酶切位點(GGATCC)，在P6中引入Mil酶切位點(GTCGAC)。然后， PCR產(chǎn)物與pCAMBIA2300-35S-0CS質(zhì)粒分別經(jīng)BamHI和Mil雙酶切，將二者酶切產(chǎn)物連接 16°C，16hrs，連接 O μ 110XT4buffer,0. 5 μ 1 T4DNA3i^g|,5y 1 載體 DNA，7. 5μ 1 外源 DNA, 5 μ 1 ddH20)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E-Coli.TOPIO，涂布于含卡那霉素的LB平板，。以目的基因為引物進行PCR得到1500bp產(chǎn)物，酶切鑒定得到目的條帶，最后送華大基因測序公司測序,結(jié)果表明載體pCAMBIA2300-LmLycB構(gòu)建正確，如圖3所示，為pCAMBIA2300_LmLycB PCR 和酶切驗證結(jié)果。利用)(hoI (CTCGAG)酶切位點，將pCAMBIA2300_LmLycB載體上的NPTII基因去除， 從5'到3'方向插入了抗草胺膦的Bar基因，得到pCAMBIA2300-LmLyCB-Bar植物表達載體，如圖4。將構(gòu)建好的植物表達載體pCAMBIA2300-LmLycB_Bar轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌C58，具體步驟為①將_80°C取出的C58感受態(tài)細胞置于冰上，使其緩慢融化；②加入2 μ L質(zhì)粒，混勻；③ 轉(zhuǎn)移至電擊杯中，以上操作均在冰上進行；④設(shè)置電擊轉(zhuǎn)化儀參數(shù)25μ F，400olm，1500V,5ms,電擊轉(zhuǎn)化；⑤室溫靜置anin后加入ImL YEB液體培養(yǎng)基，28°C，180r/min振蕩培養(yǎng)4h ；
⑥取50μ L菌液涂布于含100mg/L Ka抗性的YEB平板上，倒置平板，培養(yǎng)48h，直至看到清晰的單菌落。實施例5LmLycB基因在大腸桿菌中的功能驗證在大腸桿菌中共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pACCRT_EBIEu(氯霉素抗性)和表達載體 PMON-LmLycB(氨芐霉素抗性)，具體步驟為①向E. coli(DH5a)感受態(tài)細胞中加入兩種質(zhì)粒DNA各1 μ L，混勻，冰上放置30min ；②42°C熱激90s，然后冰上放置2_;3min ；③加 800 μ L，37°C預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基(不含抗生素)，37°C，150r/min振蕩培養(yǎng)45min ；④吸取50 μ L上述培養(yǎng)液于含相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，涂板；⑤倒置平板，37°C，培養(yǎng) 12hrs。枸杞LmLycB編碼的酶可以將紅色的番茄紅素轉(zhuǎn)化為黃色的β-胡蘿卜素，表現(xiàn)為大腸桿菌菌落顏色由紅色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，如圖5。LB液體培養(yǎng)基組成為10g/L蛋白胨，IOg/ LNaCl，5g/L酵母提取物。大腸桿菌類胡蘿卜素的提?、匐x心收集菌體，菌體質(zhì)量不超過0. Sg ；②加20ml 甲醇到菌體中，重懸；③加^ι1，60% Κ0Η，重懸；④60°C溫浴20min，再將樣品冷卻至室溫； ⑤將樣品與20ml含有10%乙醚的石油醚(bp. 40-60°C )轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，充分混合，萃取；⑥若樣品與乙醚/石油醚分層效果不好，可以加入適量的飽和NaCl溶液和少量乙醇；
⑦收集上層有機相；⑧通氮氣，吹干樣品。大腸桿菌類胡蘿卜素的HPLC檢測將樣品溶于40yL丙酮，使用nucleosil 100-3c250 X 4. 6mm (MN, Germany)色譜柱，蘭博(進口 SSI)四元梯度泵。按照 Sander (Lane C. Sander, Katherine Epler Sharpless,et al, Development of Engineered Stationary Phases for the Seperation of Carotenoid Isomers, Anal. Chem,1994,66 :1667-1674) 等(1994)的方法進行高效液相色譜分析。流動相為乙腈甲醇異丙醇=85 10 5， 流速為1. OmL/min，同時用Thermo 二極管陣列(diode-array detector,DAD)檢測器，全波長掃描類胡蘿卜素譜圖，如圖6，為表達LmLycB的大腸桿菌HPLC檢測結(jié)果。實施例6農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化1.玉米II型愈傷組織的獲得所用玉米幼胚來自本實驗室試驗田中的玉米自交系7922，授粉10-15d后，取幼雌穗，剝?nèi)グ~，在超凈臺中先用75 %乙醇消毒表面，再用 0. 的氯化汞浸泡消毒15min，無菌水清洗3次。挑取雌穗中部大小約l_2mm的完整幼胚， 盾片朝上分別接種在4種愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基成分見表1所示)，暗培養(yǎng)，3-4周誘導(dǎo)出II型愈傷組織。將誘導(dǎo)出的長勢良好的II型愈傷組織分成2-3mm的組織塊，在繼代培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分見表1所示)上暗培養(yǎng)，約2-3周繼代一次，進行II型愈傷組織的擴
增O2.農(nóng)桿菌的培養(yǎng)將含有植物表達載體pCAMBIA2300-LmLycB-Bar的農(nóng)桿菌C58 劃平板，分離單菌落；挑取單菌落，在含100mg/L Ka的5mL Y^液體培養(yǎng)基中，28°C，180r/ min培養(yǎng)12hrs ；將上述菌液按1 100比例接種于新鮮的含100mg/L Ka的30mL YEB液體培養(yǎng)基中，28°C，180r/min，振蕩培養(yǎng)至0D600值約為0. 6-0. 8左右；用50mL離心管收集菌液，4000r/min離心IOmin ；用侵染液重懸、清洗菌體2次，加入乙酰丁香酮至終濃度為ΙΟΟμπιοΙ/L，侵染備用。3.玉米的遺傳轉(zhuǎn)化將長勢良好的玉米自交系7922的II型愈傷組織切成3_5mm 小塊，置于培養(yǎng)皿中，向培養(yǎng)皿中加入適量重懸液(N6大量+B5微量+鐵鹽+N6有機+1. 5mg/ L2，4-D+0. 7g/L L-Pro+36g/L葡萄糖+68. 4g/L蔗糖)。步驟2中所準備菌液倒入培養(yǎng)皿中， 侵染結(jié)束后將菌液倒掉，愈傷組織置于濾紙上，吸干多余菌液。將侵染過的幼胚愈傷組織盾面朝上，接種到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分見表1所示)上，28°C，暗培養(yǎng)3-4d。經(jīng)過共培養(yǎng)之后的幼胚愈傷組織接種到(培養(yǎng)基成分見表1所示)上，28°C，暗培養(yǎng)7d。在脫菌的同時，使剛轉(zhuǎn)入植物中的外源載體在植物細胞中充分表達。延遲培養(yǎng)之后，轉(zhuǎn)入含有PPT 5mg/L的篩選培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分見表1所示)上， 25°C，暗培養(yǎng)2周，然后繼代到提高了篩選壓力的篩選培養(yǎng)基上，2周繼代一次。6周之后，便有新的愈傷組織產(chǎn)生，同時大多數(shù)幼胚褐化死亡。這些新的愈傷可視為轉(zhuǎn)化子，繼續(xù)繼代。挑取胚性愈傷組織接種到再生培養(yǎng)基I (培養(yǎng)基成分見表1所示)上，25°C，暗培養(yǎng)2-3周，在此過程中，大多數(shù)體細胞胚腫脹、變白，有些已經(jīng)形成胚芽鞘，將這些愈傷組織長根的部分切掉，再將其接種到再生培養(yǎng)基II上(培養(yǎng)基成分見表1所示)，25°C光培養(yǎng) (光照強度為5000LUX，光周期為16h/ !)。一周之內(nèi)，體胚便能長葉，IOd左右便可移栽。當玉米小苗長到5cm大小時，將培養(yǎng)瓶蓋子打開，培養(yǎng)室內(nèi)煉苗3-5d。然后用鑷子小心將小苗從瓶中取出，清水沖洗掉瓊脂，此過程中避免弄傷根與葉片。將植株移入小花盆，填充培養(yǎng)土，澆透水，移入溫室。表1植物培養(yǎng)基成分AgNO3+100 μηιοΙ/L AS N6 大量+B5 微量+鐵鹽+N6 有機+1.5 mg/L2,4-D+0.7 g/L L-Pro +0.25 mg/L CH+0.5 g/L MES+30 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂+5 μιηοΙ/L AgNO3
+400 mg/L Cef
權(quán)利要求
1.一個枸杞番茄紅素β-環(huán)化酶基因，其特征在于選自以下核苷酸序列之一1)具有SEQID No. 1所示的核苷酸序列；2)SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的70%的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的枸杞番茄紅素環(huán)化酶基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于所述的蛋白質(zhì)具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
3.—種重組載體，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的枸杞番茄紅素環(huán)化酶基因全序列或部分片段。
4.一種權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于它是質(zhì)粒表達載體大腸桿菌表達載體 PMON-LmLycB 或重組植物表達載體 pCAMBIA2300-LmLycB_Bar。
5.一種權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于它是重組載體的大腸桿菌DH5 α。
6.一種宿主細胞，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的枸杞番茄紅素β-環(huán)化酶基因全序列或部分片段。
7.—種權(quán)利要求6所述的宿主細胞，其特征在于它是大腸桿菌細胞、農(nóng)桿菌細胞或玉米細胞。
8.—種權(quán)利要求1所述的枸杞番茄紅素β-環(huán)化酶基因應(yīng)用于制備轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、 水稻、花生、向日葵、馬鈴薯、棉花、谷子、大麥以及花卉和蔬菜等植株。
全文摘要
一種枸杞番茄紅素β-環(huán)化酶基因及包括該基因的重組載體和宿主細胞及應(yīng)用。通過提取新鮮枸杞葉片總RNA，用3′RACE技術(shù)克隆了番茄紅素β-環(huán)化酶基因LmLycB，得到完整的基因序列為1506bp。構(gòu)建了大腸桿菌表達載體pMON-LmLycB，應(yīng)用大腸桿菌異源表達系統(tǒng)，對克隆的LmLycB基因編碼的酶的活性進行了鑒定，LmLycB能夠在番茄紅素末端添加兩個β-紫羅蘭酮環(huán)而生成β-胡蘿卜素。并對玉米自交系幼胚遺傳轉(zhuǎn)化體系進行優(yōu)化，將含有目的基因的植物表達載體pCAMBIA2300-LmLycB-Bar轉(zhuǎn)化玉米愈傷，最終獲得了轉(zhuǎn)基因陽性植株，經(jīng)HPLC檢測，轉(zhuǎn)基因玉米葉片總類胡蘿卜素含量為165.70μg/g FW，比野生型玉米提高了12.76％，其中β-胡蘿卜素含量為80.17μg/g FW，比野生型玉米提高了54.83％。
文檔編號C12N15/82GK102321649SQ201110282128
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月22日
發(fā)明者關(guān)春峰, 季靜, 王罡, 馬然 申請人:天津大學