專(zhuān)利名稱(chēng)：一種用于鑒定純合型轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻克螟稻1的引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種用于鑒定純合型轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻克螟稻I的引物。
背景技術(shù)：
標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是食品、農(nóng)產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，是開(kāi)展轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管的基準(zhǔn)物。開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)原材料的均勻性、穩(wěn)定性、特征量值范圍等方面有嚴(yán)格要求。目前，國(guó)內(nèi)外轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)普遍采用基于核酸的定性、定量檢測(cè)方法。 其中定量檢測(cè)通常采用RealTime-PCR方法對(duì)樣品中靶標(biāo)核酸序列進(jìn)行絕對(duì)定量，即測(cè)定外源DNA插入特征序列的拷貝數(shù)，并以此為基礎(chǔ)計(jì)算樣品中轉(zhuǎn)基因成分的含量。在轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)中，可以將外源DNA看作一個(gè)基因座位，一個(gè)純合體的2倍體基因組中檢測(cè)靶標(biāo)核酸序列，即外源DNA插入特征序列的拷貝數(shù)為2，一個(gè)雜合體的2倍體基因組中外源DNA插入特征序列的拷貝數(shù)為1，非轉(zhuǎn)基因材料中則為O。因而，轉(zhuǎn)基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備原材料的均勻性、穩(wěn)定性、特征量值范圍，主要體現(xiàn)在外源DNA插入所產(chǎn)生的特征序列的雜合或純合狀態(tài)。在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制過(guò)程中，必需對(duì)原材料中靶標(biāo)核酸序列的遺傳特性進(jìn)行確認(rèn)，即確認(rèn)外源DNA插入所產(chǎn)生的特征序列是純合還是雜合狀態(tài)。
目前，已報(bào)道的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)方法，主要包括針對(duì)外源目的基因、調(diào)控元件的篩選檢測(cè)和基因特異性檢測(cè)，針對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化載體的特征建立特異性檢測(cè)，針對(duì)外源DNA插入特征序列的品系特異性檢測(cè)等三類(lèi)。利用以上方法，只能確定樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分或含有何種轉(zhuǎn)基因成分，但無(wú)法直接鑒別樣品中外源DNA插入的純合或雜合狀態(tài)。國(guó)內(nèi)外目前還沒(méi)有針對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻克螟稻I(KMDl)外源基因純合/雜合狀態(tài)檢測(cè)方法的相關(guān)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于鑒定純合型轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻克螟稻I(KMDl)的引物。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種用于鑒定純合型轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻 KMDl的引物，包括正向引物5 ' -GGTTGTTTTTATGCCTCTCGCCGTG-3 '和反向引物 5' CTTCTCTAACTGTCAAGCTAACCTG-3;。該引物對(duì)是根據(jù)轉(zhuǎn)基因克螟稻I在轉(zhuǎn)基因過(guò)程中導(dǎo)致水稻基因組缺失的序列(Seq ID No.1)而設(shè)計(jì)的引物，利用該對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以純合外源基因KMDl基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增沒(méi)有擴(kuò)增片段，以雜合外源基因KMDl基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增可以擴(kuò)增出一條片段(209bp)。
本發(fā)明提供一種鑒定純合型轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻克螟稻I的方法，包括步驟1)提取植物基因組；2)以步驟I)的基因組為模板，利用上述特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。
PCR 反應(yīng)條件優(yōu)選為94 0C 5min ；94 °C 30s, 58 °C 30s, 72 °C lmin, 30 個(gè)循環(huán)； 72 °C 5min。
PCR反應(yīng)體系優(yōu)選為
反應(yīng)試劑 體積100ng/μl DNA 模板1μl5xPCR緩沖液 5μl2.5mMdNTPs 2μl10μM正向引物 0.5μl10μM反向引物 0.5μlDNA聚合酶 1.25UddH20補(bǔ)足至25μl。
本發(fā)明進(jìn)一步提供含有上述特異性引物的檢測(cè)試劑盒及其在檢測(cè)純合型轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻KMDl中的應(yīng)用。
本發(fā)明根據(jù)轉(zhuǎn)基因克螟稻I在轉(zhuǎn)基因過(guò)程中導(dǎo)致水稻基因組缺失的序列(Seq ID No.1)設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增，可以快速區(qū)分KMDl純合體和雜合體。本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻克螟稻I(KMDl)的外源基因純合的鑒定方法，可用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的篩選鑒定。此外，在轉(zhuǎn)基因作物遺傳育種過(guò)程中，需要將轉(zhuǎn)基因材料與其它材料進(jìn)行雜交、轉(zhuǎn)育以獲得適合的栽培品種，利用分子生物學(xué)手段快速、簡(jiǎn)便鑒定純合體/雜合體育種材料，有利于縮短育種進(jìn)程。


圖1為本發(fā)明通過(guò)PCR反應(yīng)在水稻中的擴(kuò)增結(jié)果；其中，M :100bp DNA ladder ；1 空白對(duì)照；2 :外源基因純合的KMDl ；3 :外源基因雜合的KMDl。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
以下實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等的《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中所述的條件，或按照儀器或試劑制造廠商所建議的條件。所用試劑和材料均為市售商品。轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻KMDl和非轉(zhuǎn)基因水稻明恢63可市售獲得。
實(shí)施例
利用引物，其中正向引物為kmdiro-F
5' -GGTTGTTTTTATGCCTCTCGCCGTG-3'，反向引物為 kmdlPD-R
5' -CTTCTCTAACTGTCAAGCTAACCTG-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定KMDl 的外源基因純合狀態(tài)。
1.實(shí)驗(yàn)材料
1.1植物材料
轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻KMD1，非轉(zhuǎn)基因水稻明恢63。
1. 2酶與試劑
分子生物學(xué)試劑，PromegaGo Taq DNA Polymerase, 5XGreen GoTaq緩沖液，dNTP Mixture (2. 5mM)購(gòu)自 Promega 公司。
其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。引物由北京生工生物技術(shù)有限公司合成。
1. 3實(shí)驗(yàn)儀器
DNA處理儀器低溫混合球磨儀MM400 (Retsch)；
PCR 擴(kuò)增儀AB Applied Biosystems veriti 96well Thermal Cycler (AB)；
核酸電泳儀DYY-11型核酸電泳儀(北京六一儀器廠)；
DNA電泳分析系統(tǒng)GeneSnap凝膠成像分析系統(tǒng)；
其它儀器包括恒溫水浴鍋、電子天平、離心機(jī)、渦旋儀、純水儀、恒溫培養(yǎng)箱等。
2.實(shí)驗(yàn)方法
2.1水稻基因組DNA的提取
水稻單粒種植,取幼嫩葉片作為DNA提取材料,依照TianGen Plant Genomic DNA Kit (購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，目錄號(hào)DP320 ;包括緩沖液1^1、1^2、1^3、洗脫緩沖液TE及吸附柱CB3)的操作手冊(cè)，進(jìn)行水稻總DNA的提取。
a.稱(chēng)取水稻新鮮葉片lOOmg，單株分別標(biāo)記，剪刀剪碎裝入2ml離心管中，放入液氮中預(yù)冷，用低溫混合球磨儀充分破碎。加入400 μ I緩沖液LPl和6 μ I RNase A(10mg/ ml),潤(rùn)旋振蕩lmin,室溫放置lOmin。
b.加入130 μ I緩沖液LP2，充分混勻，渦旋振蕩lmin。12，OOOrpm離心5min,將上清移至新的離心管中。
c.加入1. 5倍體積的緩沖液LP3，充分振蕩混勻15s，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。將所得的溶液或者絮狀沉淀加入一個(gè)吸附柱CB3中，12，OOOrpm離心30s，棄廢液，吸附柱CB3 放回收集管中。
d.向吸附柱CB3中加入700 μ I漂洗液Pff, 12，000離心30s,棄廢液，吸附柱CB3 放回收集管中。重復(fù)此步驟如下向吸附柱CB3中加入500 μ I漂洗液PW，12，000離心30s， 棄廢液，吸附柱CB3放回收集管中。14，OOOrpm離心2min，棄廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
e.將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50 μ I 去離子雙蒸水(ΡΗ7. 0-8. 5)，室溫放置2-5min，12，000離心2min，將溶液收集到離心管中。
2. 2DNA濃度和純度測(cè)定
使用NaNoDrop 1000分光光度計(jì)(Thermo Scientific)測(cè)定DNA的純度和濃度， 并用去離子雙蒸水調(diào)節(jié)DNA濃度至IOOng/μ I。
2.3PCR 擴(kuò)增
根據(jù)獲得的外源片段插入?yún)^(qū)缺失水稻序列和缺失區(qū)旁側(cè)水稻序列設(shè)計(jì)引物，其中正向引物kmdiro-F為外源片段插入時(shí)導(dǎo)致的缺失水稻序列，反向引物kmdiro-R為缺失水稻序列鄰近區(qū)的水稻序列，引物序列見(jiàn)表I。
表權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻克螟稻I的特異性引物，其特征在于，包括 正向引物5' -GGTTGTTTTTATGCCTCTCGCCGTG-3'和 反向引物5' CTTCTCTAACTGTCAAGCTAACCTG-3'。
2.一種鑒定純合型轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻克螟稻I的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)提取植物基因組； 2)以步驟I)的基因組為模板，利用權(quán)利要求1的特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)條件為94°C5min ；94°C 30s,58°C 30s, 72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C 5min。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系為
5.含有權(quán)利要求1所述特異性引物的檢測(cè)試劑盒。
6.權(quán)利要求5所述的試劑盒在檢測(cè)純合型轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻克螟稻I中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于鑒定純合型轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻克螟稻1的引物，包括正向引物5′-GGTTGTTTTTATGCCTCTCGCCGTG-3′和反向引物5′-CTTCTCTAACTGTCAAGCTAACCTG-3′。利用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以純合外源基因KMD1基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增沒(méi)有擴(kuò)增片段，以雜合外源基因KMD1基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增可以擴(kuò)增出一條片段(209bp)，從而可以快速準(zhǔn)確地鑒定出純合型轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻KMD1，為后續(xù)的轉(zhuǎn)基因作物遺傳育種奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK103014133SQ201110282188
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2011年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月21日
發(fā)明者金蕪軍, 宛煜嵩, 苗朝華, 張秀杰, 于曉芹 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所