本發(fā)明屬于動物傳染病防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種牛支原體mbovp579蛋白及其應(yīng)用。所述的蛋白可以作為抗原蛋白應(yīng)用于制備牛支原體感染診斷試劑盒中。

背景技術(shù)：

牛支原體(mycoplasmabovis,m.bovis)是一種主要引起任何月齡肉牛和奶牛呼吸系統(tǒng)疾病和關(guān)節(jié)炎的重要病原，主要臨床癥狀為肺炎，還可導(dǎo)致乳腺炎、關(guān)節(jié)炎、生殖道炎癥、結(jié)膜炎、中耳炎等多種癥狀，發(fā)病率為40％，死亡率為10％。牛支原體于1961年首次在美國從患乳房炎奶牛的牛奶中分離得到，1976年證實其是導(dǎo)致肺炎的重要病原體。2008年，湖北省從外地引進肉牛中流行呼吸道疾病，牛群引進后2周左右發(fā)病，表現(xiàn)為發(fā)熱，咳嗽，流鼻涕，犢牛和體質(zhì)弱的牛發(fā)病嚴(yán)重，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室病毒分室于2008年率先確定該病為“傳染性牛支原體肺炎”。由于我國養(yǎng)牛業(yè)向規(guī)?；图s化發(fā)展，牛養(yǎng)殖量大大增加，專門化程度大幅度提高，肉?！爱惖赜省币呀?jīng)成為重要的肉牛養(yǎng)殖模式。不同研究機構(gòu)均證實該病在全國范圍內(nèi)流行，這與近些年的肉牛養(yǎng)殖模式不無關(guān)系。

牛支原體是影響?zhàn)B牛業(yè)健康發(fā)展的重要疾病，大部分感染牛支原體的牛呈亞臨床癥狀或隱形感染，在應(yīng)激條件下可以引起臨床癥狀。目前長距離運輸是“異地育肥”的重要環(huán)節(jié)，作為一種重要的應(yīng)激因素，這無疑將會給肉牛的健康養(yǎng)殖帶來更大的困難。目前國內(nèi)沒有牛支原體的診斷試劑盒，實驗室一般采取包被牛支原體的全菌蛋白檢測臨床血清樣本，這種檢測方法的特異性和靈敏性都不高。目前的診斷方法已經(jīng)不能滿足牛支原體防控的需求，因此迫切需要找到牛支原體診斷的特異性靶標(biāo)，開發(fā)出特異性和敏感性高的檢測試劑盒。本申請人所在的農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室病毒分室通過雙向電泳和免疫印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)牛支原體膜蛋白mbovp579蛋白具有很強的免疫原性，并成功地將mbovp579蛋白作為牛支原體血清抗體檢測的分子靶標(biāo)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一個可以診斷牛支原體感染與否的分子標(biāo)識mbovp579蛋白。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種檢測牛支原體mbovp579蛋白抗體的特異性檢測方法，用于區(qū)分牛支原體感染與否及評價疫苗抗體反應(yīng)。更進一步，本發(fā)明的目的還包括重組mbovp579蛋白(即：rmbovp579)在制備牛支原體感染診斷或疫苗抗體反應(yīng)檢測試劑盒中的應(yīng)用。

為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施和路線：

申請人于2008年6月從湖北省應(yīng)城市某養(yǎng)牛場發(fā)病的黃牛的肺組織中分離得到一株牛支原體本地分離株hb0801，申請人將其命名為牛支原體hb0801，mycoplasmabovishb0801,于2010年2月1日送交中國.武漢.武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為cctccno：m2010040。

根據(jù)大腸桿菌對密碼子的偏愛性，本發(fā)明以牛支原體hb0801(基因組在genbank上的登錄號為cp002058)中mbov_579基因為模板克隆該基因，同時根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏愛性，將mbov_579基因進行克隆修飾，將牛支原體色氨酸密碼子uga突變成大腸桿菌中的色氨酸密碼子ugg進而在大腸桿菌中表達。

經(jīng)過人工突變后的牛支原體基因mbov_579的核苷酸序列是序列表seqidno:13的1-2387位堿基所示的序列，其長度為2387bp；其中在該序列的：165位，690位，1455位和1674位發(fā)生等位基因突變。

該牛支原體mbovp579蛋白的蛋白質(zhì)序列如序列表seqidno:14所示，共編碼728個氨基酸。

將本發(fā)明的牛支原體mbov_579基因的核苷酸序列通過構(gòu)建質(zhì)粒載體pet-30-mbov_579轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α得到重組的大腸桿菌菌株，申請人將該重組的大腸桿菌菌株命名為大腸桿菌pet-30-mbov-579；escherichiacolipet-30-mbov-579，于2015年12月18日送交中國.武漢.武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為cctccno：m2015763。該菌株的iptg誘導(dǎo)下，表達mbov-579基因編碼的重組蛋白rmbovp579。

經(jīng)過驗證，本發(fā)明純化的rmbovp579蛋白可以作為診斷抗原在制備牛支原體感染診斷試劑盒中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的牛支原體rmbovp579蛋白在區(qū)分牛支原體感染中的應(yīng)用，包括下列步驟：

使用間接elisa方法診斷牛支原體野毒株感染，以rmbovp579蛋白作為抗原包被酶標(biāo)板于4℃過夜，經(jīng)pbst洗滌后加入5％脫脂乳，然后在37℃封閉1h，pbst洗滌后加入檢測樣本37℃孵育1h，血清樣本稀釋比例為體積比1：1600。pbst洗滌后加入辣根過氧化物酶 標(biāo)記羊抗牛二抗(1：5000，v/v)37℃孵育1h。經(jīng)pbst洗滌后加入底物(tmb/h2o2)顯色，測定od630nm值，大于規(guī)定閾值時判斷為抗體陽性，發(fā)生了牛支原體感染。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

1、本發(fā)明的抗原蛋白mbovp579是發(fā)明人從牛支原體全菌蛋白中篩選出來的新型免疫原性蛋白，目前功能未知。

2、本發(fā)明的抗原蛋白mbovp579檢測牛支原體的特異性是發(fā)明人首次確定的，利用該蛋白抗原建立的間接elisa能有效區(qū)分牛支原體和其它病原體感染。

3、目前國內(nèi)市場上還沒有商品化的牛支原體鑒別診斷試劑盒，與市場上國外商品化試劑盒比較，本發(fā)明的抗原蛋白rmbovp579的檢測靈敏度與特異性顯著高于同類產(chǎn)品，說明以本發(fā)明的蛋白制備的試劑盒更能適應(yīng)基層單位檢測的需求。

更詳細(xì)的發(fā)明方案見《具體實施方式》所述。

附圖說明

序列表seqidno:1是擴增mbov_579基因片段的引物579a1的序列。

序列表seqidno:2是擴增mbov_579基因片段的引物579a2的序列。

序列表seqidno:4是擴增mbov_579基因片段的引物579b1的序列。

序列表seqidno:5是擴增mbov_579基因片段的引物579b2的序列。

序列表seqidno:6是擴增mbov_579基因片段的引物579c1的序列。

序列表seqidno:7是擴增mbov_579基因片段的引物579c2的序列。

序列表seqidno:6是擴增mbov_579基因片段的引物579d1的序列。

序列表seqidno:9是擴增mbov_579基因片段的引物579d2的序列。

序列表seqidno:10是擴增mbov_579基因片段的引物579e1的序列。

序列表seqidno:11是擴增mbov_579基因片段的引物579e2的序列。

序列表seqidno:12是擴增mbov_579基因片段的引物579m1的序列。

序列表seqidno:13是擴增mbov_579基因片段的引物579m2的序列。

序列表seqidno:13是本發(fā)明人工突變牛支原體mbov_579基因的核苷酸序列，序列長度為2187bp。其中在該序列的165位，690位，1455位和1674位發(fā)生等位基因突變。

序列表seqidno:14是本發(fā)明的牛支原體mbovp579蛋白的蛋白質(zhì)序列，編碼728個氨基酸。

圖1：是本發(fā)明實施例涉及空質(zhì)粒pet-30a的質(zhì)粒圖譜。pet-30a為商業(yè)化質(zhì)粒，購自novagen 公司。

圖2：是本發(fā)明制備的重組質(zhì)粒pet-30-mbov_579的圖譜。重組質(zhì)粒pet-30-mbov_579是由pet-30a質(zhì)粒和突變后的mbov_579基因全長經(jīng)過限制性內(nèi)切酶消化后連接重組而成。

圖3：是本發(fā)明純化的牛支原體rmbovp579蛋白膠圖。附圖標(biāo)記說明：泳道m(xù)：蛋白質(zhì)marker；1：純化的牛支原體rmbovp579重組蛋白。

圖4：包被rmbovp579蛋白通過間接elisa診斷牛支原體感染的結(jié)果。牛支原體自然感染和疫苗株免疫檢測及閾值的確定，當(dāng)閾值為0.442時，臨床樣本檢測的敏感性為90.2％，特異性為97.8％。

具體實施方式

實施例1：牛支原體mbov579蛋白的表達

1.1牛支原體mbov_579基因克隆表達

由于大腸桿菌對密碼子的偏愛性，在本發(fā)明中牛支原體中編碼色氨酸的密碼子uga在大腸桿菌被用作終止子，因此，用大腸桿菌表達牛支原體基因時，需要對支原體基因進行突變，使密碼子uga突變?yōu)槟茉诖竽c桿菌中表達色氨酸的密碼子ugg。

申請人于2008年6月從湖北省應(yīng)城市某養(yǎng)牛場發(fā)病的黃牛的肺組織中分離得到牛支原體地方分離株，將其命名牛支原體hb0801，mycoplasmabovishb0801,于2010年2月1日送交中國.武漢.武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為cctccno：m2010040。本發(fā)明利用自行設(shè)計的pcr引物對該基因進行了突變，具體步驟是：以牛支原體hb0801(基因組genbank登錄號為cp002058)中的mbov_579基因為模板，利用如下設(shè)計的5對引物(編號分別為：579a1/579a2，579b1/579b2，579c1/579c2，579d1/579d2，579e1/579e2)分別擴增出突變后的mbov_579基因的5個片段，然后，以突變后的5個片段為模板，利用579m1/579m2引物對擴增得到突變后的mbov_579基因的全序列，序列長度為2187bp(見序列表seqidno：13中1-2187位堿基所示的序列，其編碼區(qū)也是1-2187位堿基對應(yīng)的序列)。

擴增mbov_579基因的引物序列如下所示：

(1)579a1/579a2擴增片段在mbov_579基因中的位置為683802-683980堿基處，pcr擴增產(chǎn)物長度為179bp。

正向引物579a1:5’atgagtaagaaaaataaattaatgattgggctttcatctactgct3’，(即序列表seqidno：1所示的序列)。

反向引物579a2:5’gaagccatagtattccattgtggctgacca3’，(即序列表seqidno：2所示的序列；下劃線部分為突變位點，即由t突變?yōu)閏)

(2)579b1/579b2擴增片段在mbov_579基因中的位置為683952-684510堿基處，pcr擴增產(chǎn)物長度為559bp。

正向引物579b1:5’ggtcagccacaatggaatactatggctt3’(其中：下劃線部分為突變位點，即由a突變?yōu)間；即序列表seqidno：3所示的序列)。

反向引物579b2:5’gtgaactttcaaattcaccccataatttttgtacttcact3’(下劃線部分為突變位點，即由t突變?yōu)閏；即序列表seqidno：4所示的序列)。

(3)579c1/579c2擴增片段在mbov_579基因中的位置為684472-685274堿基處，pcr擴增產(chǎn)物長度為803bp。

正向引物579c1:5’gtgaagtacaaaaattatggggtgaatttgaaagttcaca3’(下劃線部分為突變位點，即由a突變?yōu)間；即序列表seqidno：5所示的序列)。

反向引物579c2:5’ttctcttaagaataatagccattgtttattatcactagcttc3’(下劃線部分為突變位點，即由t突變?yōu)閏；即序列表seqidno：6所示的序列)。

(4)579d1/579d2擴增片段在mbov_579基因中的位置為685235-685490堿基處，pcr擴增產(chǎn)物長度為256bp。

正向引物579d1:5’agctagtgataataaacaatggctattattcttaagagaagat3’(下劃線部分為突變位點，即由a突變?yōu)間；即序列表seqidno：7所示的序列)。

反向引物579d2:5’ttcattagatttattccatttaccaggcacagc3’(下劃線部分為突變位點，即由t突變?yōu)閏；即序列表seqidno：8所示的序列)。

(5)579e1/579e2擴增片段在mbov_579基因中的位置為685458-685988堿基處，pcr擴增產(chǎn)物長度為531bp：

正向引物579e1:5’gctgtgcctggtaaatggaataaatctaatga3’，(下劃線部分為突變位點，即由a突變?yōu)間；即序列表seqidno：9所示的序列)。

反向引物579e2:5’ttatttaagaatttgactgcttgatgcaataattgatccaata3’，(即序列表seqidno：10所示的序列)。

(6)579m1/579m2擴增片段在mbov_579基因中的位置為683802-685988堿基處，pcr擴增產(chǎn)物長度為2205bp

正向引物579m1:5’ggtaccatgagtaagaaaaataaattaatgattgg3’，(下劃線部分為kpni酶切位點，波浪線部分為保護性堿基；即序列表seqidno：11所示的序列)。

反向引物579m2:5’gaattcttatttaagaatttgactgcttgatgc3’，(下劃線部分為ecori酶切位點，波浪線部分為保護性堿基；即序列表seqidno：9所示的序列)。

上述5個片段的pcr反應(yīng)體系如下：

模板dna2.5μl，pfu酶(thermo)1.5μl，pfubufferwithmgso4(thermo)5μl，10倍dntpmix(thermo)1μl，引物各2μl，超純水36μl。

回收以上五個片段的pcr擴增產(chǎn)物，以此為模板，使用引物579m1/579m2擴增突變后的mbov_579基因，其pcr反應(yīng)體系如下：每個片段2.5μl，pfu酶(thermo)1.5μl，pfubufferwithmgso4(thermo)5μl，10倍dntpmix(thermo)1μl，引物各2μl，超純水36μl。上述引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

回收mbov_579基因的擴增產(chǎn)物，用kpni和ecori酶切，同時將pet-30a質(zhì)粒(購自默克中國有限公司)用kpni和ecori進行雙酶切。將酶切后的mbov_579基因和pet-30a質(zhì)粒用dna連接酶(t4dnaligase)連接，得到重組質(zhì)粒pet-30-mbov_579。用該重組質(zhì)粒pet-30-mbov_579轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α后，置于37℃搖床在180r/min下培養(yǎng)12小時，提取質(zhì)粒經(jīng)過測序正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21，將該大腸桿菌在lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至od＝0.6時取1ml菌液作為誘導(dǎo)前對照，同時加入異丙基硫代半乳糖苷(iptg)至終濃度為0.8mm，37℃搖床誘導(dǎo)表達3小時。取1ml菌液進行下一步處理：樣品處理方法為12000r/min離心1min后棄掉上清加入1ml磷酸鹽緩沖液即pbs(配方：kcl0.2g，nacl8g，na2hpo41.44g，kh2po40.24g，1000ml蒸餾水，ph＝7.6)溶液重懸后再以12000r/min離心1min棄掉上清，然后加入30ul的pbs和30ul上樣緩沖液【1mtris-hcl(ph＝6.8)1ml，200mmddt0.31g，4％sds0.4g，0.2％溴酚藍0.02g，20％甘油2ml，7ml超純水】重懸。100℃沸水中煮沸10min。用sds-page凝膠電泳鑒定是否表達。

將本發(fā)明的蛋白的核苷酸序列通過構(gòu)建質(zhì)粒載體pet-30-mbov_579轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α中得到重組大腸桿菌，申請人將該重組的大腸桿菌命名為大腸桿菌pet-30-mbov-579；escherichiacolipet-30-mbov-579，于2015年12月18日送交中國.武漢.武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為cctccno：m2015763。

1.2牛支原體rmbovp579重組蛋白的純化

將重組的大腸桿菌bl21按上述方法誘導(dǎo)表達后，取菌液8000r/min離心10min后棄掉上清，用500ml的pbs洗一次后在8000r/min離心10min，再重復(fù)用500ml的pbs洗一次。 棄掉上清后加入30ml的pbs重懸，加入蛋白酶抑制劑(購自羅氏公司)，使用液壓破碎儀破碎。破碎后以12000r/min離心30min，取30μl上清加入30μl上樣緩沖液，在沸水中煮沸10min作為上清組。取少許沉淀加入30μl的pbs和30μl上樣緩沖液煮沸10min作沉淀組。經(jīng)過sds-page凝膠電泳后，確定rmbovp579蛋白大部分表達于上清中。

rmbovp579蛋白具體純化步驟如下：

(1)向親和層析柱中加入1mlni-nta金屬螯合his蛋白純化介質(zhì)填料(購自ge公司)；

(2)向親和層析柱中加入12mlddh2o洗滌；

(3)加入12ml的bindingbuffer(20mmna3po4，0.5mnacl，20mm咪唑，ph＝7.4)平衡柱子；

(4)加入經(jīng)過0.45μm孔徑濾器過濾的蛋白表達上清，收集前幾滴濾出的液體，編號為1；

(5)加入50mlbindingbuffer緩沖液平衡柱子，收集前幾滴液體，編號為2；

(6)加入50mlwashingbuffer緩沖液(20mmna3po4，0.5mnacl，60mm咪唑，ph＝7.4)洗去雜蛋白，收集前幾滴，編號為3；

(7)加入12mlelutebuffer緩沖液(20mmna3po4，0.5mnacl,1m咪唑，ph＝7.4)洗脫目的蛋白，收集前幾滴，編號為4；

(8)將編號為1到4的管中各加入50μl上樣緩沖液煮沸10min；

(9)配置sds-page聚丙酰胺凝膠，將處理好的樣品加入孔中(20μl/每孔)，電泳(濃縮膠電泳條件為直流電壓為80伏特，分離膠電泳條件為直流電壓為120伏特)，電泳完成后，取下凝膠用考馬斯亮藍染色過夜。然后脫色，確定得到純化的目的蛋白。

實施例2：牛支原體mbovp579蛋白在診斷牛支原體野毒株自然感染中的應(yīng)用

2.1以牛支原體rmbovp579重組蛋白為抗原，通過間接elisa方法診斷牛支原體野毒株自然感染

elisa方法的具體操作程序：

(1)抗原包被：用包被液(na2co31.59g，nahco32.93g，加ddh2o至1000ml)稀釋濃縮后rmbovp579蛋白，按每孔100ng的比例加入稀釋rmbovp579蛋白后的包被液100μl每孔加入96孔酶標(biāo)板，4℃包被過夜。棄去包被液，每孔加300μlpbst(pbs:nacl8.0g，kcl0.2g，na2hpo4·12h2o2.9g，nah2po40.2g，加ddh2o至1000ml。pbst:加入0.05％比例的 tween-20到pbs中)洗滌3次，每次2分鐘。

(2)封閉：每孔加入100μl5％脫脂牛奶(5g脫脂牛奶加pbst至100ml)，置于37℃溫箱中封閉1h，甩干封閉液，加入300μlpbst洗3次，每次2分鐘。

(3)加樣：用pbst按1:1600(v/v)比例稀釋待檢血清和對照血清,每孔加100μl稀釋后的樣本，37℃孵育1h。甩干孔中溶液，加入300μlpbst洗3次，每次2分鐘。

(4)加酶標(biāo)二抗：用pbst按(500μl吐溫-20加入1000mlpbs(按v/v1:5000的比例稀釋酶標(biāo)二抗(購自southernbiotech公司)，每孔加入100μl稀釋后的二抗，置于37℃溫箱培養(yǎng)60分鐘。甩干孔中溶液，加入300μlpbst洗5次，每次2分鐘。

(5)加底物顯色：每孔加入tmb底物顯色液a液和tmb底物顯色液b液(購自武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司)各50μl，避光顯色10min，每孔加50μl終止液(購自武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司)終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在630nm波長下測定od630值。使用在線工具(http://epitools.ausvet.com.au/content.php？page＝roc_curves)軟件確定閾值。

2.2基于rmbovp579蛋白抗原的間接elisa與商品elisa試劑盒的比較

選取123份通過牛肺臟組織分菌及分離培養(yǎng)確定為牛支原體感染的病牛陽性血清作為比較實驗的陽性檢測樣本。商品化試劑盒(mycoplasmaboviselisakit,references:biok302；購自比利時bio-xdiagnostics公司)。具體步驟如下：

rmbovp579蛋白的包被、檢測方法及條件按3.1中所述進行，商品化試劑盒的操作按照試劑盒的說明書進行。檢測結(jié)果見表1，用本發(fā)明的rmbovp579蛋白抗原對牛支原體感染樣本的檢出率為90.24％(111/123)，顯著高于商品化試劑盒的31.7％(39/123)(p<0.01)。

表1:商業(yè)化牛支原體抗體elisa試劑盒和rmbovp579間接elisa檢測比較

實施例3：牛支原體rmbovp579蛋白診斷牛支原體自然感染試劑盒的組裝

本發(fā)明的試劑盒包括牛支原體rmbovisp579抗原包被板2塊(96孔/塊，100ng/孔)，牛支原體抗體elisa陰性、陽性對照各1管(0.5ml/管)，樣品稀釋液1瓶(40ml/瓶)，羊抗牛酶標(biāo)記二抗(iggfc-hrp)(購自southernbiotech公司)1管(200μl/管)，20倍濃縮洗滌液1瓶(30ml/瓶)，tmb底物顯色液a液，tmb底物顯色液b液各1瓶(10ml/瓶；購自武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司))，終止液1瓶(10ml/瓶，購自武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司)。

(1)20倍濃縮洗滌液的配制：nacl160g、kcl4g、na2hpo4·12h2o58g、kh2po44g，tween-2010ml定容至1000ml純化水中。

(2)羊抗牛(iggfc-hrp)酶標(biāo)二抗(購自southernbiotech公司)的配制：用保護劑(含1％bsa的pbst溶液)稀釋至(單位)1:500倍中間濃度。

(3)封閉液：含5％脫脂乳的磷酸鹽緩沖液。

(4)樣品稀釋液：含0.05％tween-20的磷酸鹽緩沖液。

(5)tmb底物顯色液：包括

tmb底物顯色液a液：na2hpo414.6g，檸檬酸9.33g，過氧化氫脲0.52g，加純化水至1000ml，調(diào)至ph值5.0～5.4；

tmb底物顯色液b液：tmb20mg，無水乙醇10ml，加純化水至1000ml。

(6)終止液：0.25％氫氟酸。

名詞術(shù)語說明：

在本說明書中：

牛支原體mbovp579重組蛋白以rmbovp579表示；

牛支原體mbovp579蛋白基因以mbov_579表示；

牛支原體本地分離株，牛支原體野毒株，野毒株以牛支原體hb0801或m.bovishb0801表示。