本發(fā)明涉及具有呈味效果的肽及其制備方法，具體涉及具有厚味的γ-谷氨酰肽及其制備方法。
背景技術(shù)：
：γ-谷氨酰肽廣泛存與多種動(dòng)植物和發(fā)酵食品中，是一種安全天然、安全的食品成分。常見(jiàn)的谷胱甘肽其一級(jí)結(jié)構(gòu)是γ-glu-cys-gly，是一種典型的γ-谷氨酰肽?，F(xiàn)代研究表明γ-谷氨酰肽與生物體的代謝活動(dòng)和生理功能有關(guān)，此外大部分γ-谷氨酰肽具有鎮(zhèn)定減壓、舒緩疲勞、抗癌解毒、絡(luò)合重金屬離子、維持細(xì)胞金屬離子平衡等生理功能。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)γ-谷氨酰肽還具有較強(qiáng)的呈味特性。2002年日本味之素株式會(huì)社公開(kāi)了通過(guò)探索具有casr激動(dòng)劑活性的多種多樣的化合物，發(fā)現(xiàn)具有更優(yōu)異的濃味賦予作用，特別是具有前味型的濃味賦予作用，且具有優(yōu)異的穩(wěn)定性，可以簡(jiǎn)便而低成本地生產(chǎn)的能夠賦予濃味的物質(zhì)，提供包含該物質(zhì)的濃味賦予劑，以及將該物質(zhì)與其他具有casr激動(dòng)劑活性的物質(zhì)組合使用而成的復(fù)合濃味賦予劑。包含γ-glu-abu(l-γ-谷氨酰-l-2-2-氨基丁酸)的濃味賦予劑，以及該物質(zhì)與其他具有casr激動(dòng)劑活性的物質(zhì)組合使用而成的復(fù)合濃味賦予劑(專利申請(qǐng)?zhí)?01080024054.1)。在低濃度條件下的大部分γ-谷氨酰肽具有輕微澀味，隨著濃度的提高，γ-谷氨酰肽開(kāi)始呈現(xiàn)基本味道。例如γ-glu-glu在濃度為10mmol/l時(shí)有鮮味，γ-glu-tyr的苦味閾值是其澀味閾值的兩倍。在鮮味溶液中，γ-谷氨酰肽具有厚味，閾值也在明顯下降。隨著人們對(duì)呈味肽的進(jìn)一步了解，學(xué)者發(fā)現(xiàn)γ-谷氨酰肽具有厚味物質(zhì)的特征：1.在水溶液中基本沒(méi)有味道或只有輕微的味道(澀味或酸味)；2.能夠與體系中的其他呈味物質(zhì)發(fā)生協(xié)同增效作用，添加到含有鮮味物質(zhì)的溶液體系中，不會(huì)改變?nèi)芤旱幕疚队X(jué)強(qiáng)度，但是能協(xié)調(diào)各種味道，顯著增加濃厚感(kokumi)；3.與純水溶液相比，在鮮味溶液中閾值明顯下降。表1已報(bào)道γ-谷氨酰肽呈味特性和閾值一覽表迄今為止，尚未見(jiàn)γ-glu-γ-glu-abu具有濃厚味的報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種利用谷氨酰胺酶合成γ-谷氨酰肽的制備方法。本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。一種寡肽，其氨基酸序列為γ-glu-γ-glu-abu。本發(fā)明提供的濃厚味賦予劑，其特征在于由所述寡肽和如下一種以上的肽組合而成：γ-glu-x-gly(x表示氨基酸或氨基酸衍生物)、γ-glu-val-y(y表示氨基酸或氨基酸衍生物)、γ-glu-abu、γ-glu-ala、γ-glu-gly、γ-glu-cys、γ-glu-met、γ-glu-thr、γ-glu-val、γ-glu-orn、asp-gly、cys-gly、cys-met、glu-cys、gly-cys、leu-asp、d-cys、γ-glu-met(o)、γ-glu-γ-glu-val、γ-glu-val-nh2、γ-glu-val-ol、γ-glu-ser、γ-glu-tau、γ-glu-cys(s-me)(o)、γ-glu-leu、γ-glu-ile、γ-glu-t-leu和γ-glu-cys(s-me)。一種含有所述寡肽的調(diào)味料，其含有60mg/kg以上的γ-glu-γ-glu-abu和。一種含有所述寡肽的調(diào)味料，含有60mg/kg以上的γ-glu-γ-glu-abu。一種含有所述寡肽的調(diào)味料，含有500mg/kg以上的γ-glu-γ-glu-abu。所述寡肽的制備方法，具體是：谷氨酰胺與游離2-氨基丁酸，摩爾比為1-2:1，溶于水中得溶液，調(diào)節(jié)反應(yīng)ph為7.0-10.0，添加谷氨酰胺酶或γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶0.02-1％(w/w)，在25-50℃反應(yīng)3-12小時(shí)，后用4mol/l鹽酸回調(diào)ph至7～8之間，90℃滅酶10min，得到含γ-glu-γ-glu-abu的反應(yīng)液。采用xselecthsst35μm4.6x250mm分析柱，流動(dòng)相a液為0.1％(v/v)甲酸-水溶液；流動(dòng)相b液為0.1％(v/v)甲酸-乙腈溶液，柱溫為40℃，流速為1ml/min，反應(yīng)液的進(jìn)樣量10μl，采用高效液相色譜對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行梯度洗脫，第2個(gè)峰即為寡肽γ-glu-γ-glu-abu。進(jìn)一步地，所述溶液中谷氨酰胺和游離2-氨基丁酸的濃度在400-1000mmol/l。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)：1)本發(fā)明首次公開(kāi)了γ-glu-γ-glu-abu具有厚味特性。2)首次公開(kāi)了利用谷氨酰胺酶或γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶催化制備γ-glu-γ-glu-abu。附圖說(shuō)明圖1為2-氨基丁酸與谷氨酰胺混合物添加谷氨酰胺酶對(duì)呈味特性的差異圖；圖2為反應(yīng)后混合物的液相色譜圖；圖3為γ-glu-γ-glu-abu的呈味特性分析圖；圖4為γ-glu-γ-glu-abu的二級(jí)質(zhì)譜圖；圖5a、圖5b分別是γ-glu-γ-glu-abu對(duì)醬油和雞湯的呈味增效作用。具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖和實(shí)例對(duì)本發(fā)明的具體是實(shí)施作進(jìn)一步舉例，但本發(fā)明的實(shí)施和保護(hù)不限于此。實(shí)施例1將400mm谷氨酰胺與400mm2-氨基丁酸溶于100g水中，調(diào)節(jié)溶液的ph值至10.0，加入0.4g谷氨酰胺酶(日本天野株式會(huì)社，活力為100gtu/g)，在25℃分別反應(yīng)12h，后用4mol/l鹽酸回調(diào)ph至7.0后，90℃滅酶10min，對(duì)產(chǎn)物呈味特性進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，其反應(yīng)前后呈味特性如圖1。由圖1可見(jiàn)，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液的厚味、鮮味和咸味都顯著提高了，甜味顯著降低。谷氨酰胺呈甜味，反應(yīng)后溶液中谷氨酰胺含量降低，導(dǎo)致反應(yīng)液的甜味減弱。hplc液相對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定量呈味分析：分析柱：xselecthsst35μm4.6x250mm；流動(dòng)相：a液：0.1％(v/v)甲酸-水溶液；b液：0.1％(v/v)甲酸-乙腈溶液；柱溫：40℃，流速：1ml/min。進(jìn)樣量10μl。其液相色譜圖見(jiàn)圖2，流動(dòng)相進(jìn)行梯度變化洗脫如表2所示。表2time/min05101520a/％9080209090圖2中，與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)照，經(jīng)驗(yàn)證，出峰時(shí)間為5.267對(duì)應(yīng)的峰2為γ-glu-γ-glu-abu，對(duì)峰2進(jìn)行收集，冷凍干燥得到γ-glu-γ-glu-abu單體。稱取0.01gγ-glu-γ-glu-abu，以及0.5g食鹽和0.3g味精，溶解于100g水中，并和空白樣(0.5g食鹽和0.3g味精溶于100g水中)進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。感官評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)由30-41歲有感官評(píng)價(jià)經(jīng)驗(yàn)的7位男性和9位女性組成，感官評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，添加0.01g的γ-glu-γ-glu-abu的樣品與對(duì)照相比，溶液的鮮味和咸味明顯提高。uplc-ms/ms對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定性分析：包括：anagilent1290seriesuplcsystem(agilenttechnologies)用于各γ-glu-peptides,帶有anelec-trosprayionization(esi)的質(zhì)譜系統(tǒng)(q-tofms/ms，brukerdaltonics)進(jìn)行定性分析。色譜柱為：agilentzorbaxrrhdsb-c18(2.1x50mm,1.8μm)。進(jìn)樣量為5μl。液相條件為：溶液a為0.1％甲酸-水溶液，和溶液b為0.1％甲酸-乙腈溶液，梯度洗脫程序?yàn)椋?–10％b,0-5.0min；10-15％b,5.0-10.0min；然后100％b,10.0-12.0min。ms條件：ionization(離子化)：正離子模式；dryinggas(干燥氣體)：350℃下10l/min；nebulizer(噴霧器壓力)：25psig；fragmentor(毛細(xì)管電壓)：30v。對(duì)峰2進(jìn)行uplc-ms/ms分析，其檢測(cè)結(jié)果如圖4。由圖4知，其一級(jí)結(jié)構(gòu)分別γ-glu-γ-glu-abu。實(shí)施例2將雞胸肉放入15倍重量清水中，煮沸后保溫60min，冷凍祛除湯面油脂，過(guò)濾得雞湯。加入雞湯0.5％(％為占雞湯的質(zhì)量的百分比，下同)的食鹽,添加0.01％γ-glu-γ-glu-abu于雞湯中，評(píng)價(jià)其呈味特性變化。感官評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)由30-41歲有感官評(píng)價(jià)經(jīng)驗(yàn)的7位男性和9位女性組成，感官評(píng)價(jià)結(jié)果表明，添加0.01％的γ-glu-γ-glu-abu的雞湯的雞湯的感覺(jué)、鮮味、甜味和厚味均有明顯增加，見(jiàn)圖5b。醬油為市售海天金標(biāo)醬油，添加0.01％γ-glu-γ-glu-abu于醬油中。感官評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)由30-41歲有感官評(píng)價(jià)經(jīng)驗(yàn)的7位男性和9位女性組成，感官評(píng)價(jià)結(jié)果表明，添加0.01％的γ-glu-γ-glu-abu的醬油的咸味有所降低，但鮮味、甜味和厚味增加明顯，見(jiàn)圖5a。實(shí)施例3將解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)swjs22(中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為cgmccno.8425)以1％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：4％豆粕、2％麩皮、2％玉米粉)中，37～39℃發(fā)酵培養(yǎng)30h。將發(fā)酵液于4℃，10000r/min條件下高速離心10min，過(guò)濾得上清液，即谷氨酰胺酶粗酶液。將600mm谷氨酰胺和300mm2-氨基丁酸溶于100g水中，調(diào)節(jié)溶液的ph值至7.0，加入1g粗酶液，在50℃分別反應(yīng)3h后，用4mol/l鹽酸回調(diào)ph至7.0后，90℃滅酶10min，得到富含γ-glu-γ-glu-abu的反應(yīng)液。采用xselecthsst35μm4.6x250mm分析柱，流動(dòng)相a液為0.1％(v/v)甲酸-水溶液；流動(dòng)相b液為0.1％(v/v)甲酸-乙腈溶液，柱溫為40℃，流速為1ml/min，反應(yīng)液的進(jìn)樣量10μl，采用高效液相色譜對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行梯度洗脫，第2個(gè)峰即為寡肽γ-glu-γ-glu-abu。實(shí)施例4將枯草芽胞桿菌atcc6633以1％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：4％豆粕、2％麩皮、2％玉米粉)中，37～39℃發(fā)酵培養(yǎng)48h。將發(fā)酵液于4℃，10000r/min條件下高速離心10min，過(guò)濾得上清液，即γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶粗酶液。將600mm谷氨酰胺和400mm2-氨基丁酸溶于100g水中，分別調(diào)節(jié)溶液的ph值至8.0，加入1gγ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶粗酶液，在40℃分別反應(yīng)6h后，用4mol/l鹽酸回調(diào)ph至7.0后，90℃滅酶10min，得到富含γ-glu-γ-glu-abu的反應(yīng)液。采用xselecthsst35μm4.6x250mm分析柱，流動(dòng)相a液為0.1％(v/v)甲酸-水溶液；流動(dòng)相b液為0.1％(v/v)甲酸-乙腈溶液，柱溫為40℃，流速為1ml/min，反應(yīng)液的進(jìn)樣量10μl，采用高效液相色譜對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行梯度洗脫，第2個(gè)峰即為寡肽γ-glu-γ-glu-abu。表3a:酸味(mg/l),b:厚味.溶液ph值調(diào)到6.5表3γ-谷氨酰肽在不同溶液中的刺激呈味閾值，其中百分比為占水的質(zhì)量百分比。由表3可見(jiàn)，γ-glu-γ-glu-abu和乳酸有較強(qiáng)的呈味相互作用，添加味精和乳酸可明顯降低γ-glu-γ-glu-abu的刺激呈味閾值。當(dāng)前第1頁(yè)12