本發(fā)明涉及一種蛋白制備方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種抗氧化鰱魚肝臟蛋白的制備方法。

背景技術(shù)：

我國(guó)淡水水域廣闊、江河縱橫、湖泊密布，是世界上淡水水面最多的國(guó)家之一。作為全球淡水魚生產(chǎn)消費(fèi)大國(guó)，中國(guó)近幾年在淡水漁業(yè)方面一直處于持續(xù)增長(zhǎng)階段。在淡水養(yǎng)殖魚類產(chǎn)量中，草魚最高為537.68萬(wàn)噸；鰱魚位居第二，為422.60萬(wàn)噸?，F(xiàn)有的淡水魚加工主要集中于魚糜及魚糜制品，切割加工后會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物，如魚腹部、魚頭以及魚內(nèi)臟，約占原料魚的40％～55％，其中含有豐富的蛋白質(zhì)以及大量的脂肪，如果不對(duì)其進(jìn)行及時(shí)有效的加工處理，會(huì)造成資源的浪費(fèi)和環(huán)境的污染。目前加工副產(chǎn)物對(duì)鰱魚肝臟的綜合利用低且品質(zhì)較差，附加產(chǎn)值低。并且大部分的鰱魚肝臟被丟棄，或是加工粗糙，精深加工品相當(dāng)少。鰱魚肝臟加工程度低的主要原因是魚體水分含量高，組織酶活躍，難儲(chǔ)藏，并且?guī)в袧庵氐聂~腥味；將鰱魚肝臟進(jìn)行大批量的深加工目前還存在技術(shù)問(wèn)題。這些問(wèn)題都極大地制約了鰱魚肝臟產(chǎn)品的開發(fā)利用。因此，對(duì)鰱魚肝臟進(jìn)行開發(fā)利用可增加產(chǎn)業(yè)附加值、降低資源損耗，在我國(guó)具有十分重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問(wèn)題，并提供至少后面將說(shuō)明的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種抗氧化鰱魚肝臟蛋白的制備方法，利用超聲輔助緩沖溶液提取和堿提鰱魚肝臟蛋白，操作簡(jiǎn)單，處理時(shí)間短，蛋白得率較高且所得兩種蛋白的抗氧化活性較好。

為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了一種抗氧化鰱魚肝臟蛋白的制備方法，其包括以下步驟：

步驟一，將脫脂處理后的鰱魚肝臟加入磷酸緩沖液進(jìn)行超聲預(yù)處理；超聲頻率24khz，超聲功率50-100w，處理時(shí)間為3-7min；

步驟二，進(jìn)行滅酶處理，之后離心制得上清液和殘?jiān)?/p>

步驟三，取上清液在ph8.0的tris-hcl緩沖液中透析78h，每8-12h更換一次透析液，冷凍干燥得緩沖液提取蛋白；

步驟四，取殘?jiān)尤?0-20倍0.1m的naoh溶液，置于水浴搖床中恒溫振蕩，轉(zhuǎn)速為150-300rmp/min，提取8-16h后，在90-100℃水浴鍋中滅酶15-25min；之后離心制得二次上清液；將二次上清液在ph8.0的tris-hcl緩沖液中透析78h，其中每8-12h更換一次透析液，冷凍干燥得堿提蛋白。

優(yōu)選的是，所述步驟一中脫脂處理具體為：按照體積比為1:5的比例加入10％異丙醇進(jìn)行脫脂，時(shí)間為20-24h。

優(yōu)選的是，所述步驟一中所述超聲預(yù)處理具體為：將脫脂后的鰱魚肝臟按照體積比1：10-20的比例加入磷酸緩沖液，ph7.0～9.0，攪拌均勻，于超聲頻率24khz下，超聲功率50-100w時(shí)，預(yù)處理肝臟3-7min。

優(yōu)選的是，所述滅酶處理具體為：將超聲預(yù)處理后的溶液密封置于集熱式恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速為150-300rmp/min，提取8-16h后，在90-100℃水浴鍋中滅酶15-25min。

優(yōu)選的是，所述步驟三和步驟四中透析時(shí)選用的透析袋的截留分子量為300da。

優(yōu)選的是，所述步驟二中，離心的轉(zhuǎn)速是4000rmp/min；離心時(shí)間為10-20min。

本發(fā)明至少包括以下有益效果：本發(fā)明所述抗氧化鰱魚肝臟蛋白的制備方法利用超聲輔助緩沖溶液提取和堿提鰱魚肝臟蛋白，操作簡(jiǎn)單，處理時(shí)間短，蛋白得率較高且所得兩種蛋白的抗氧化活性較好。本發(fā)明利用超聲波產(chǎn)生空穴現(xiàn)象而形成的剪切力使被處理的鰱魚肝臟組織遭到破壞變的膨松，有利于后續(xù)提取的進(jìn)行；利用超聲適當(dāng)?shù)奈锢眍A(yù)處理能破壞蛋白質(zhì)的凝聚狀態(tài)、改變蛋白質(zhì)分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)，使蛋白更加均勻分布于體系中，蛋白分子變得更加舒展，溶解度增加，疏水基團(tuán)暴露。超聲輔助提取的鰱魚魚肝蛋白在分子量、黏度上都小于傳統(tǒng)緩沖和堿提方法。

本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過(guò)下面的說(shuō)明體現(xiàn)，部分還將通過(guò)對(duì)本發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說(shuō)明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。

應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術(shù)語(yǔ)并不排除一個(gè)或多個(gè)其它元件或其組合的存在或添加。

本發(fā)明提供一種抗氧化鰱魚肝臟蛋白的制備方法，其包括以下步驟：

步驟一，將脫脂處理后的鰱魚肝臟加入磷酸緩沖液進(jìn)行超聲預(yù)處理；超聲頻率24khz，超聲功率50-100w，處理時(shí)間為3-7min；

步驟二，進(jìn)行滅酶處理，之后離心制得上清液和殘?jiān)?/p>

步驟三，取上清液在ph8.0的tris-hcl緩沖液中透析78h，每8-12h更換一次透析液，冷凍干燥得緩沖液提取蛋白；

步驟四，取殘?jiān)尤?0-20倍0.1m的naoh溶液，置于水浴搖床中恒溫振蕩，轉(zhuǎn)速為150-300rmp/min，提取8-16h后，在90-100℃水浴鍋中滅酶15-25min；之后離心制得二次上清液；將二次上清液在ph8.0的tris-hcl緩沖液中透析78h，其中每8-12h更換一次透析液，冷凍干燥得堿提蛋白。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟一中脫脂處理具體為：按照體積比為1:5的比例加入10％異丙醇進(jìn)行脫脂，時(shí)間為20-24h。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟一中所述超聲預(yù)處理具體為：將脫脂后的鰱魚肝臟按照體積比1：10-20的比例加入磷酸緩沖液，ph7.0～9.0，攪拌均勻，于超聲頻率24khz下，超聲功率50-100w時(shí)，預(yù)處理肝臟3-7min。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述滅酶處理具體為：將超聲預(yù)處理后的溶液密封置于集熱式恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速為150-300rmp/min，提取8-16h后，在90-100℃水浴鍋中滅酶15-25min。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟三和步驟四中透析時(shí)選用的透析袋的截留分子量為300da。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟二中，離心的轉(zhuǎn)速是4000rmp/min；離心時(shí)間為10-20min。

實(shí)施例1

本發(fā)明所述抗氧化鰱魚肝臟蛋白的制備方法，具體包括以下步驟：

1)取冷凍的鰱魚肝臟，4℃下解凍，稱取100g原料于500ml的錐形瓶中，加入10％的異丙醇100ml脫脂24h后；

2)再加入1000ml的磷酸緩沖液(pbs)，ph7.0～9.0，攪拌均勻，先于超聲頻率24khz下，超聲功率50w時(shí)，預(yù)處理肝臟7min；

3)然后用保鮮膜密封置于集熱式恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速為150rmp/min，提取8h后，在100℃水浴鍋中滅酶15min；

4)然后在4000rmp/min離心10min，取上清液，在ph8.0的tris-hcl緩沖液中透析78h每8-12h更換一次透析液，冷凍干燥得緩沖液提取蛋白；透析袋截留分子量為300da。

5)離心后的殘?jiān)偌尤霘堅(jiān)w積的10倍0.1m的naoh溶液，置于水浴搖床中恒溫振蕩，轉(zhuǎn)速為150rmp/min，提取8h后，在100℃水浴鍋中滅酶15min，再在4000rmp/min離心10min，取上清液；

6)在ph8.0的tris-hcl緩沖液中透析78h(透析袋300da)每8h更換一次透析液，冷凍干燥得堿提蛋白，于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例2

本發(fā)明所述抗氧化鰱魚肝臟蛋白的制備方法，具體包括以下步驟：

1)取冷凍的鰱魚肝臟，4℃下解凍，稱取100g原料于500ml的錐形瓶中，加入10％的異丙醇100ml脫脂24h后；得脫脂溶液

2)再加入脫脂溶液體積20倍的磷酸緩沖液(pbs)，ph9.0，攪拌均勻，先于超聲頻率24khz下，超聲功率100w時(shí)，預(yù)處理肝臟3min；

3)然后用保鮮膜密封置于集熱式恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速為300rmp/min，提取16h后，在90℃水浴鍋中滅酶25min；

4)然后在4000rmp/min離心20min，取上清液，在ph8.0的tris-hcl緩沖液中透析78h(透析袋300da)每12h更換一次透析液，冷凍干燥得緩沖液提取蛋白；

5)離心后的殘?jiān)偌尤?0倍0.1m的naoh溶液，置于水浴搖床中恒溫振蕩，轉(zhuǎn)速為300rmp/min，提取16h后，在90℃水浴鍋中滅酶15min，再在4000rmp/min離心20min，取上清液；

6)在ph8.0的tris-hcl緩沖液中透析78h(透析袋300da)每12h更換一次透析液，冷凍干燥得堿提蛋白，于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例3

本發(fā)明所述抗氧化鰱魚肝臟蛋白的制備方法，具體包括以下步驟：

1)取冷凍的鰱魚肝臟，4℃下解凍，稱取100g原料于500ml的錐形瓶中，加入10％的異丙醇100ml脫脂24h后；

2)再加入3000ml的磷酸緩沖液(pbs)，ph7.0～9.0，攪拌均勻，先于超聲頻率24khz下，超聲功率80w時(shí)，預(yù)處理肝臟6min；

3)然后用保鮮膜密封置于集熱式恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速為150rmp/min，提取10h后，在100℃水浴鍋中滅酶20min；

4)然后在4000rmp/min離心15min，取上清液，在ph8.0的tris-hcl緩沖液中透析78h(透析袋300da)每10h更換一次透析液，冷凍干燥得緩沖液提取蛋白；

5)離心后的殘?jiān)偌尤?5倍0.1m的naoh溶液，置于水浴搖床中恒溫振蕩，轉(zhuǎn)速為150-300rmp/min，提取10h后，在100℃水浴鍋中滅酶20min，再在4000rmp/min離心15min，取上清液；

6)在ph8.0的tris-hcl緩沖液中透析78h(透析袋300da)每10h更換一次透析液，冷凍干燥得堿提蛋白，于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

對(duì)比例1

采用傳統(tǒng)的緩沖和堿提方法制備緩沖液提取蛋白和堿提蛋白。其中加入緩沖液后于恒溫振蕩器中，提取24-48h。

將實(shí)施例1、2、3和對(duì)比例1制得的緩沖液提取蛋白和堿提蛋白，按照下面方法分別進(jìn)行檢測(cè)：

一，按照公式(1)計(jì)算鰱魚肝臟分離蛋白的得率，結(jié)果如下：

二，抗氧化測(cè)定

1)dpph自由基清除率的測(cè)定

蛋白水解物用去離子水溶解后配成濃度為1～6mg/ml。用95％乙醇現(xiàn)配0.1mmol/l的dpph，等量1ml的多肽加入1ml的乙醇，再加入1ml的dpph溶液于比色皿中。振動(dòng)混勻后在37℃水浴中避光反應(yīng)0.5h。于波長(zhǎng)517nm處測(cè)吸光度a1。乙醇作為空白測(cè)定吸光度a2。vc作陽(yáng)性對(duì)照。dpph自由基清除率計(jì)算如式(2)所示：

式中：a1為實(shí)驗(yàn)組吸光度；a2為空白組吸光度。

2)abts自由基清除率的測(cè)定

(1)abts自由基溶液的配制：取0.1gabts和0.029g過(guò)硫酸鉀溶于100ml磷酸鈉緩沖液，混合后于25℃避光反應(yīng)16h備用，實(shí)驗(yàn)時(shí)取2ml該反應(yīng)液，加入18ml磷酸鈉緩沖液，配成abts儲(chǔ)備液，避光保存當(dāng)日備用。abts儲(chǔ)備液再用磷酸鈉緩沖液稀釋，于波長(zhǎng)734nm處測(cè)吸光度在0.85左右，即為abts工作液，當(dāng)日現(xiàn)配使用。

(2)測(cè)定方法：分別取0.1ml樣品液，加入3.9mlabts工作液，混合均勻?；旌弦河谑覝叵蚂o置10min，于波長(zhǎng)734nm處測(cè)定吸光度a1，以試樣溶劑代替樣品溶液測(cè)定空白吸光度a0，以磷酸鈉緩沖液代替abts工作液測(cè)得吸光度a2，實(shí)驗(yàn)平行做三次，vc作陽(yáng)性對(duì)照。abts自由基清除率計(jì)算如式(3)所示：

式中：a1為實(shí)驗(yàn)組吸光度；a2為對(duì)照組吸光度；a0為空白組吸光度。

結(jié)果如下：表1，各實(shí)施例鰱魚肝臟緩沖液蛋白的參數(shù)

由上表可知，本發(fā)明所述抗氧化鰱魚肝臟蛋白的制備方法中，實(shí)施例1中鰱魚肝臟緩沖液提蛋白得率為47.6％，蛋白純度為65.3％。其遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)比例1中的蛋白得率和蛋白純度。而且本發(fā)明鰱魚肝臟緩沖液提蛋白所用時(shí)間更短。

表2，各實(shí)施例鰱魚肝臟堿提蛋白的各參數(shù)

從上表中可以看出，鰱魚肝臟堿提蛋白得率為10.9％，蛋白純度為56.3％。在抗氧化實(shí)驗(yàn)中，兩種魚肝蛋白對(duì)dpph自由基清除率的ec50值分別為1.18mg/ml和1.49mg/ml；對(duì)abts自由基清除率的ec50值分別為1.21mg/ml和3.74mg/ml，結(jié)果表明，兩種魚肝蛋白均具有較好的抗氧化活性。

盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說(shuō)明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的實(shí)施例。