專利名稱：天花粉蛋白誘導(dǎo)的小鼠過敏性哮喘疾病模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及天花粉蛋白在制備小鼠 過敏性哮喘模型中的用途，以及一種由天花粉蛋白誘導(dǎo)的小鼠過敏性哮喘疾病模 型。
背景技術(shù)：
在過去的二十年中，像哮喘等過敏性疾病呈穩(wěn)定的上升趨勢。這不僅影響 人們的生活質(zhì)量，特別是幼兒哮喘，直接影響了兒童身體的正常發(fā)育，還對國 家經(jīng)濟的發(fā)展造成一定阻礙作用。雖然目前國內(nèi)外對過敏性哮喘的研究日益加 深，但是針對過敏性哮喘的有效的特異性治療手段卻相對甚少?，F(xiàn)在國際上通 用的過敏性哮喘動物模型只有雞卵清白蛋白(OVA)誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型。由于 0VA并不是一個在人體引發(fā)疾病的過敏原，通過此模型所獲得的研究結(jié)果，并 不能很好地反映人體內(nèi)哮喘的病理狀態(tài)。因此，建立一種能模擬人體哮喘病理 狀態(tài)的動物模型，可用于抗過敏藥物的篩選以及研究哮喘的發(fā)病機制有重要的 科學(xué)意義和潛在的臨床應(yīng)用價值。
過敏性哮喘是一類肺部的慢性炎癥疾病，它的主要特征有血清中IgE水平 升高，肺部嗜酸性粒細胞等炎癥細胞浸潤，黏液分泌過多，呼吸道非特異性反 應(yīng)增強。過敏性哮喘的發(fā)病機理可以簡單地概括為機體在呼吸道接觸到某種 過敏原而發(fā)生免疫反應(yīng)產(chǎn)生針對該過敏原的特異性IgE類抗體，并且這些抗體 通過受體結(jié)合于肥大細胞表面；當(dāng)機體再次遇到相同過敏原時，該過敏原就能 和特異性的IgE結(jié)合，從而使肥大細胞表面的IgE發(fā)生橋聯(lián)，引起了肥大細胞 的脫顆粒作用，釋放白三烯，組胺等介質(zhì)，招募炎癥細胞浸潤到肺組織，導(dǎo)致 平滑肌收縮，血管擴張，氣管阻塞，肺部炎癥發(fā)生。從免疫學(xué)的層面上來講， 過敏性哮喘是一個典型的Th2反應(yīng)。CD4陽性的輔助性T細胞通過其表面的受 體TCR識別過敏原，并釋放白細胞介素，趨化因子等細胞因子，表達一些共刺 激因子，Th2細胞釋放的Th2類型的細胞因子IL-4和共刺激因子CD40L能夠傳 遞給B細胞進行抗體重鏈轉(zhuǎn)換的信號，從而使B細胞分泌IgE類抗體；它分泌的IL-4, IL-10可以調(diào)節(jié)肥大細胞的功能，同時IL-5又是嗜酸性粒細胞浸潤
和發(fā)揮功能必不可少的因素。
Th2細胞介導(dǎo)的Th2反應(yīng)是過敏性哮喘的免疫學(xué)基礎(chǔ)，樹突狀細胞 (dendritic cell, DC)決定了幼稚型T細胞向Thl或Th2的方向分化，在機體 接觸到抗原的早期階段就決定了隨后所發(fā)生的免疫反應(yīng)呢。樹突狀細胞是由骨 髓造血干細胞分化而來的一類專職抗原遞呈細胞，它分為幾種不同的亞型，分 布于血液，皮膚，黏膜以及各臟器中，在機體的外周起到監(jiān)視作用，可以吞噬 外來病原體，是免疫系統(tǒng)的第一道防線。循環(huán)于外周的DC處在不成熟狀態(tài)， 有很強的吞噬能力，當(dāng)機體感染了微生物或是蛋白等病原體，DC就會吞噬這些 抗原，并把抗原進行加工，呈遞給存在于二級引流淋巴器官的抗原特異性的T 細胞。在負(fù)載抗原的DC向淋巴結(jié)遷移的過程中，DC逐漸成熟，上調(diào)一些細胞 因子和共刺激因子以及MCHII。當(dāng)它把抗原遞呈給T細胞的同時，幼稚型的T 細胞就能被激活，在不同的信號作用下，向Thl或Th2方向分化。這樣，DC的 不同亞型，和它接受到來自抗原的不同信號及其不同的成熟狀態(tài)控制了免疫反 應(yīng)的類型。
近年來，闡述DC和過敏性哮喘之間直接或間接關(guān)系的論證越來越多。有 報道強調(diào)DC不僅在哮喘的致敏階段起啟動性作用，而且在呼吸道慢性炎癥的 發(fā)生和維持也至關(guān)重要。用抗原(OVA)在體外刺激過的DC來致敏小鼠，然后進 行抗原的呼吸道攻擊，可以引發(fā)實驗動物的過敏性哮喘癥狀。該實驗證明了DC 在哮喘發(fā)病中的重要性。然而，盡管現(xiàn)在DC誘導(dǎo)Thl或Th2反應(yīng)的三信號學(xué) 說己基本得到公認(rèn)，即MHCII-TCR途徑；共刺激因子途徑；細胞因子-受體途 徑，但是就某種過敏原所活化的信號通路，從而導(dǎo)致哪些關(guān)鍵性分子發(fā)揮作用， 本領(lǐng)域并不很清楚，其具體機制仍需更加系統(tǒng)深入的研究。
除了以上這種經(jīng)典的Th細胞的分化激活方式，近些年的科學(xué)研究表明， Th2細胞發(fā)育所需要的IL-4來源于先天性免疫細胞，比如嗜堿性粒細胞，因為 Th2早期并不能夠分泌足夠量的IL-4。另外，對于過敏性哮喘，它的發(fā)生也不 僅僅依賴于Th2產(chǎn)生的IL-4， IL-5以及IL-13等細胞因子，還要依賴于其它 細胞來源的這些和其它細胞因子的表達，比如NKT細胞來源的IL-4和IL-13 對哮喘的發(fā)生是必不可少的，還有報道表明，A1(0H)3發(fā)揮佐劑的作用也是通過 活化脾臟當(dāng)中Gr. r的一群細胞以依賴于IL-4的方式激活B細胞來完成的。換 句話說，體內(nèi)還存在非Th2細胞來給造成一個Th2類型免疫反應(yīng)發(fā)生的環(huán)境。綜上，建立典型的模擬人體過敏性哮喘的模型是對于深入研究致敏機制以 及篩選抗過敏藥物是非常有必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種天花粉蛋白(TCS)的用途，用于制備哺乳動物 過敏性哮喘模型。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種由天花粉蛋白誘導(dǎo)的哺乳動物過敏性哮 喘模型及其用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種天花粉蛋白(TCS)的用途，用于制備誘導(dǎo) 非人哺乳動物發(fā)生過敏性哮喘的組合物。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物中不含有佐劑。
在另一優(yōu)選例中，所述的非人哺乳動物是鼠(更佳的是小鼠(mice))。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于增加非人哺乳動物肺組織或呼吸道炎 性細胞或嗜酸性粒細胞的數(shù)量；或用于增加非人哺乳動物肺組織中細胞因子 IL-4、 IL-5或IL-13的水平。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于增加非人哺乳動物血清中抗原特異性 IgE型免疫球蛋白的水平。
在本發(fā)明的第二方面，提供一種過敏性哮喘的非人哺乳動物的用途，所述的 非人哺乳動物是由天花粉蛋白免疫的非人哺乳動物；所述非人哺乳動物用于篩選抗 過敏性哮喘的物質(zhì)。
在另一優(yōu)選例中，所述由天花粉蛋白免疫非人哺乳動物的方法是先對哺乳 動物進行天花粉蛋白系統(tǒng)免疫(或天花粉蛋白輔助其他蛋白共同進行系統(tǒng)免疫)，然 后對哺乳動物進行呼吸道抗原蛋白(如天花粉蛋白)氣霧攻擊。
在另一優(yōu)選例中，所述的系統(tǒng)免疫是指全身性途徑免疫哺乳動物，例如采用 腹腔注射的方式。
在本發(fā)明的第三方面，提供一種篩選抗過敏性哮喘的潛在物質(zhì)的方法，所 述方法包括步驟
(1)將候選物質(zhì)給予過敏性哮喘的非人哺乳動物，所述的非人哺乳動物是由天花粉蛋白免疫的非人哺乳動物；
(2)檢測動物呼吸道或肺組織內(nèi)炎性細胞數(shù)、嗜酸性粒細胞數(shù)、炎癥性細 胞因子的水平、或血清中抗原特異性IgE型免疫球蛋白的水平，若動物呼吸道 或肺組織內(nèi)炎性細胞數(shù)、嗜酸性粒細胞數(shù)、炎癥性細胞因子的水平、或血清中 抗原特異性IgE型免疫球蛋白的水平下降，則表明該候選物質(zhì)是抗過敏性哮喘 的潛在物質(zhì)。
在另一優(yōu)選例中，步驟(l)包括在測試組中，將候選物質(zhì)給予過敏性哮喘 的非人哺乳動物；和/或
步驟(2)包括檢測測試組動物呼吸道或肺組織內(nèi)炎性細胞數(shù)、嗜酸性粒 細胞數(shù)、炎癥性細胞因子的水平、或血清中抗原特異性IgE型免疫球蛋白的水 平，并與對照組比較，其中所述的對照組是不給予候選物質(zhì)的過敏性哮喘的非 人哺乳動物；如果測試組中動物肺組織內(nèi)炎性細胞數(shù)、嗜酸性粒細胞數(shù)、炎癥 性細胞因子的水平、或血清中抗原特異性IgE型免疫球蛋白的水平在統(tǒng)計學(xué)上 低于(優(yōu)選顯著低于，如低20%;優(yōu)選的低40%;更優(yōu)選的低6(^或更低)對照組， 則表明該候選物質(zhì)是抗過敏性哮喘的潛在物質(zhì)。
在另一優(yōu)選例中，所述的炎癥性細胞因子包括IL-4、 IL-5或IL-13。
在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟對獲得的潛在物質(zhì)進行進一步的動
物試驗，以從潛在物質(zhì)中選出對于抗過敏性哮喘有用的物質(zhì)。
在另一優(yōu)選例中，將候選物質(zhì)給予過敏性哮喘的非人哺乳動物的方法包括但
不限于口服，或注射。
在本發(fā)明的第四方面，提供一種引發(fā)過敏性哮喘的組合物，所述的組合物含
有
有效量的雞血清白蛋白；和 有效量的天花粉蛋白。
在另一優(yōu)選例中，所述的雞血清白蛋白和天花粉蛋白的重量比例為
1:100-100:1;優(yōu)選的雞血清白蛋白和天花粉蛋白的重量比例為1:10-10:1。 在另一優(yōu)選例中，所述的組合物中還含有有效量的藥學(xué)上可接受的載體。
在本發(fā)明的第五方面，提供所述的引發(fā)過敏性哮喘的組合物的用途，用于制 備誘導(dǎo)非人哺乳動物發(fā)生過敏性哮喘的組合物。
7本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而 易見的。


圖1A顯示了用TCS或0VA(含佐劑)誘導(dǎo)的動物模型呼吸道灌洗液中浸潤的
炎性細胞總數(shù)比較。
圖1B顯示了用TCS或0VA(含佐劑)誘導(dǎo)的動物模型呼吸道灌洗液中嗜酸性 粒細胞數(shù)比較。
圖lC顯示了用TCS或OVA(含佐劑)誘導(dǎo)的動物模型的血清中抗原特異性IgE 的水平比較。
圖1D顯示了用TCS或0VA(含佐劑)誘導(dǎo)的動物模型的肺組織切片。 圖1A-D中，均以采用同樣的誘導(dǎo)處理方法，以同樣體積PBS溶液+鋁佐劑 處理的小鼠作為陰性對照(PBS對照組)。
圖2A顯示了用TCS或0VA(不含佐劑)誘導(dǎo)的動物模型呼吸道灌洗液中浸潤 的炎性細胞總數(shù)比較。
圖2B顯示了用TCS或0VA(不含佐劑)誘導(dǎo)的動物模型呼吸道灌洗液中嗜酸 性粒細胞數(shù)比較。
圖2C顯示了用TCS或0VA(不含佐劑)誘導(dǎo)的動物模型的血清中抗原特異性 IgE的水平比較。
圖2D顯示了用TCS或0VA(不含佐劑)誘導(dǎo)的動物模型的肺組織切片。
圖3A顯示了用含佐劑或不含佐劑的TCS誘導(dǎo)的動物模型呼吸道灌洗液中 細胞因子IL-4的水平。
圖3B顯示了用含佐劑或不含佐劑的TCS誘導(dǎo)的動物模型呼吸道灌洗液中 細胞因子IL-5的水平。
圖3C顯示了用含佐劑或不含佐劑的TCS誘導(dǎo)的動物模型呼吸道灌洗液中 細胞因子IL-13的水平。
圖3D顯示了用含佐劑或不含佐劑的TCS誘導(dǎo)的動物模型呼吸道灌洗液中 細胞因子IFN-y的水平。
8圖3E顯示了用含佐劑或不含佐劑的TCS誘導(dǎo)的動物模型肺引流淋巴結(jié)細 胞體外經(jīng)TCS重新刺激后的細胞因子IL-4的水平。
圖3F顯示了用含佐劑或不含佐劑的TCS誘導(dǎo)的動物模型肺引流淋巴結(jié)細 胞體外經(jīng)TCS重新刺激后的細胞因子IFN- y的水平。
圖3G顯示了用含佐劑或不含佐劑的TCS誘導(dǎo)的動物模型血清中的IgE水平。
圖3H顯示了用含佐劑或不含佐劑的TCS誘導(dǎo)的動物模型血清中的IgG2a 水平。
圖3A-H中，均以采用同樣的誘導(dǎo)處理方法，以同樣體積PBS溶液處理的小 鼠作為陰性對照(PBS對照組)。
圖4A顯示了以0VA或TCS + 0VA或鋁佐劑(alum)十OVA誘導(dǎo)的動物模型呼吸 道灌洗液中浸潤的炎性細胞總數(shù)比較。
圖4B顯示了以O(shè)VA或TCS + OVA或鋁佐劑(alum) +(^八誘導(dǎo)的動物模型呼吸
道灌洗液中嗜酸性粒細胞數(shù)比較。
圖4C顯示了以O(shè)VA或TCS + OVA或鋁佐劑(alum) + OVA誘導(dǎo)的動物模型的血 清中抗原特異性IgE的水平比較。
圖4D顯示了以O(shè)VA或TCS + OVA或鋁佐劑(alum) +OVA誘導(dǎo)的動物模型的 肺組織切片。
圖4A-D中，均以采用同樣的誘導(dǎo)處理方法，以同樣體積PBS溶液處理的小 鼠作為陰性對照(P B S對照組)。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛且深入的研究，出乎意料地發(fā)現(xiàn)，以天花粉蛋白(TCS) 免疫哺乳動物，可誘導(dǎo)哺乳動物發(fā)生過敏性哮喘，并且無需佐劑參加即可發(fā)生。 這種過敏性哮喘動物具有過敏性哮喘的典型特征，可作為動物模型，良好地模 擬體內(nèi)過敏性哮喘的發(fā)生發(fā)展。同時，所述動物模型還可應(yīng)用于篩選抗過敏性 哮喘的藥物。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
所述的"過敏性哮喘"是指一種哺乳動物的疾病，通常由過敏原引起，其主 要特征表現(xiàn)為以下的部分或全部血清中IgE水平升高，呼吸道或肺部炎性細胞增
9多，肺部嗜酸性粒細胞增多，黏液分泌過多，呼吸道非特異性反應(yīng)增強；此外，"過 敏性哮喘"還可表現(xiàn)為呼吸道或肺組織一類白細胞介素(如IL-4、 IL-5或IL-13) 的量增加。此外，"過敏性哮喘"還可表現(xiàn)為肺組織一類白細胞介素(如IL-4、 IL-5 或IL-13)的量增加。具有上述部分或全部特征的動物可被認(rèn)為患"過敏性哮喘"。 "過敏性氣道炎"是"過敏性哮喘"的主要癥狀之一。
天花粉蛋白
天花粉蛋白 (trichosanthin ; TCS)分離自中藥天花粉(/fe心x 7yyc力o幼力中，以往天花粉被作為一種用于引產(chǎn)的中藥。
臨床實驗證明天花粉蛋白不僅可以引產(chǎn)，還有抗腫瘤和抗艾滋病毒作用。 已發(fā)現(xiàn)臨床上天花粉蛋白能夠引起患者的過敏反應(yīng)，嚴(yán)重的可以造成過敏性休 克而致死。天花粉蛋白過敏的個體，血清中的天花粉蛋白特異的IgE水平顯著 上升，并且在幾年內(nèi)，可以維持在一個較高的水平。盡管目前已知天花粉蛋白 是一個較強的過敏原，可引起機體免疫反應(yīng)和產(chǎn)生抗體，然而目前還沒有人發(fā) 現(xiàn)其可特異地誘導(dǎo)過敏性哮喘哮喘并將之用于建立過敏性哮喘模型。也即目前 已經(jīng)知道天花粉蛋白可系統(tǒng)性地引起免疫反應(yīng)，但沒有技術(shù)人員發(fā)現(xiàn)其對特定 器官是否有典型的影響。
在本發(fā)明中，所用的天花粉蛋白可以是天然存在的，比如其可被純化和分 離自中草藥(如天花粉)中。優(yōu)選的，所述天然存在的天花粉蛋白的氨基酸序列 可以與GenBank登錄號AY669811所記載的序列基本上相同。此外，所述的天花 粉蛋白也可以是人工制備的，比如可以根據(jù)常規(guī)的基因重組技術(shù)來生產(chǎn)重組的 天花粉蛋白。
本發(fā)明還包括天花粉蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語"片 段"、"衍生物"和"類似物"是指基本上保持本發(fā)明的天花粉蛋白相同的生 物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是有一個或 多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，在一 個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或附加的氨基酸序列融合到此多 肽序列而形成的多肽。
本發(fā)明也可采用經(jīng)修飾或改良的天花粉蛋白，比如，可采用為了促進其半 衰期、有效性、代謝、和/或蛋白的效力而加以修飾或改良的天花粉蛋白。也即， 任何不影響天花粉蛋白的生物活性的變化形式都可用于本發(fā)明中。
10本發(fā)明提供一種天花粉蛋白(TCS)的用途，用于制備誘導(dǎo)非人哺乳動物發(fā) 生過敏性哮喘的組合物。優(yōu)選地，所述的組合物中不含有佐劑。
此外，天花粉蛋白還可用于增加非人哺乳動物肺組織炎性細胞或嗜酸性粒 細胞的數(shù)量；或用于增加非人哺乳動物肺組織中細胞因子IL-4、 IL-5或IL-13 的水平；或用于增加非人哺乳動物血清中IgE型免疫球蛋白的水平。
此外，所述的天花粉蛋白還可用于作為雞卵清白蛋白(OVA)的佐劑，來誘 導(dǎo)過敏性氣道炎。本發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)，天花粉蛋白可取代鋁佐劑，并且比鋁 佐劑的效果更優(yōu)異。
天花粉蛋白是個自然狀態(tài)下的過敏原，能夠引起人類的過敏反應(yīng)，不同于 現(xiàn)有的雞卵清白蛋白(OVA)只能通過佐劑的輔助才能引起過敏且其本身不是一 個在人體引發(fā)疾病的過敏原，所以用天花粉蛋白誘導(dǎo)的過敏性哮喘模型能更好 的模擬人類疾病的發(fā)生。因此，由天花粉蛋白誘導(dǎo)的哮喘模型有別于雞卵清白 蛋白誘導(dǎo)的模型，且天花粉蛋白誘導(dǎo)的病理損傷，更接近于臨床，可良好地用 于抗過敏性哮喘藥物的篩選和更好地研究過敏反應(yīng)的發(fā)病機制。
并且，以往建立小鼠過敏性哮喘模型都是需要在免疫佐劑(如氫氧化鋁)的 輔助免疫下才能完成模型的誘導(dǎo)，而本發(fā)明釆用天花粉蛋白進行誘導(dǎo)，不需要 免疫佐劑的輔助即可獨立完成疾病模型的誘導(dǎo)，這也更類似于人類的發(fā)病過 程。
動物模型的構(gòu)建及其用途
本發(fā)明中，所述的"非人哺乳動物"包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、 猿猴。所述的非人哺乳動物在基因組的組成、器官解剖、個體的發(fā)育、代謝方 式、疾病發(fā)病機制等方面和人類接近，可良好地應(yīng)用于人類疾病發(fā)病機制、藥 物藥理學(xué)研究等方面。優(yōu)選的，所述的非人哺乳動物是鼠(如小鼠)。
本發(fā)明的過敏性哮喘動物模型是采用天花粉蛋白免疫非人哺乳動物而制備 的。免疫的方法是非人哺乳動物腹腔注射天花粉蛋白，和/或用含天花粉蛋白的 氣霧劑攻擊非人哺乳動物。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，先對哺乳動物進行天花粉蛋白 系統(tǒng)免疫，然后對哺乳動物進行呼吸道天花粉蛋白氣霧攻擊，從而建立過敏性哮喘 模型。
11在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，采用天花粉蛋白在第1、 14天兩次進行系統(tǒng)免 疫(腹腔注射天花粉蛋白)；然后在第21-23天連續(xù)3天用超聲霧化的天花粉蛋白溶 液進行呼吸道途徑攻擊，從而建立過敏性哮喘動物模型。在構(gòu)建模型過程中，不需 要佐劑的參與即可完成。
在利用天花粉蛋白誘導(dǎo)后，本發(fā)明人利用多種過敏性哮喘疾病相關(guān)的指標(biāo) 來驗證建立模型成功與否。驗證發(fā)現(xiàn)，采用天花粉蛋白誘導(dǎo)后，動物的肺組織 中炎癥細胞總數(shù)顯著上升，嗜酸性細胞總數(shù)顯著上升，動物的血清中IgE的含 量顯著上升。此外，從細胞因子來看，采用天花粉蛋白誘導(dǎo)后，動物的肺組織 中IL-4、 IL-5、 IL-13的含量均顯著升高，且還高于天花粉蛋白和佐劑聯(lián)合應(yīng) 用的情況。綜合這些指標(biāo)可知，本發(fā)明人利用天花粉蛋白成功構(gòu)建了過敏性哮 喘動物模型。
本發(fā)明的過敏性哮喘模型，可用于研究和闡述過敏性哮喘的細胞乃至分子 水平上的發(fā)病機制。研究和闡述天花粉蛋白引起Th2類型免疫反應(yīng)的機制，為 開發(fā)治療過敏性哮喘的藥物提供途徑。另一方面，還可用于尋找樹突狀細胞(DC) 在天花粉蛋白作用下發(fā)生表型和功能改變過程中的關(guān)鍵分子和信號通路，來進 一步研究DC在調(diào)控Th細胞分化過程中所發(fā)生的生物學(xué)事件和起重要作用乃至 決定性作用的分子。
篩選新藥
本發(fā)明利用天花粉蛋白成功建立了過敏性哮喘模型，所述模型可應(yīng)用于抗 過敏性哮喘藥物的篩選。
因此，本發(fā)明提供了一種篩選抗過敏性哮喘的潛在物質(zhì)的方法，所述方法 包括步驟(1)將候選物質(zhì)給予過敏性哮喘的非人哺乳動物(測試組)，所述的非 人哺乳動物是由天花粉蛋白免疫的非人哺乳動物；(2)檢測動物呼吸道或肺組織 內(nèi)炎性細胞數(shù)、嗜酸性粒細胞數(shù)、炎癥性細胞因子的水平、或血清中IgE型免 疫球蛋白的水平，若呼吸道或肺組織內(nèi)炎性細胞數(shù)、嗜酸性粒細胞數(shù)、炎癥性 細胞因子的水平、或血清中IgE型免疫球蛋白的水平下降，則表明該候選物質(zhì) 抗過敏性哮喘的潛在物質(zhì)。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，還設(shè)置對照組，所述的對照組是不給予候選物質(zhì)
且其它條件與測試組相同的過敏性哮喘的非人哺乳動物。通過比較，如果測試組 呼吸道或肺組織內(nèi)炎性細胞數(shù)、嗜酸性粒細胞數(shù)、炎癥性細胞因子的水平、或
12血清中IgE型免疫球蛋白的水平在統(tǒng)計學(xué)上低于(優(yōu)選顯著低于，如低20%;優(yōu) 選的低40%;更優(yōu)選的低60%或更低)對照組，則表明該候選物質(zhì)是抗過敏性哮
喘的潛在物質(zhì)。
上述篩選出的潛在物質(zhì)可構(gòu)成一個篩選庫，可對這些物質(zhì)進行進一步的細 胞實驗、動物試驗、和/或臨床試驗，以進一步確證所述潛在物質(zhì)的抗炎癥作 用。
由于本發(fā)明采用天花粉蛋白進行誘導(dǎo)而沒有免疫佐劑的參與，所構(gòu)建的模 型更類似于人類的發(fā)病過程，因而在藥物的篩選上比以往的模型(如利用雞卵 清白蛋白構(gòu)建的模型)更為精準(zhǔn)，效率更高。
組合物
本發(fā)明的天花粉蛋白還可用于輔助雞卵清白蛋白，從而可用于建立雞卵清 白蛋白特異性的過敏性哮喘模型(如過敏性氣道炎模型)。該模型同樣可被用于 篩選抗過敏性哮喘的藥物，因此該模型也被包含在本發(fā)明中。利用該模型篩選 藥物的方法基本同利用天花粉誘導(dǎo)的過敏性哮喘動物模型的方法，所述方法也 被包括在本發(fā)明中。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用天花粉蛋白輔助雞卵清白蛋白建立過敏性氣道炎動物 模型，效果比利用鋁佐劑輔助更為優(yōu)異，可產(chǎn)生更多的炎性細胞。
因此，本發(fā)明還提供一種引發(fā)過敏性哮喘的組合物，所述的組合物含有有 效量(如0.5-50%;較佳的1-20%;更佳的1-10%)的雞血清白蛋白和有效量(如 0.5-50%;較佳的1-20%;更佳的1-10%)的天花粉蛋白。
可隨免疫動物的種類不同調(diào)節(jié)雞血清白蛋白和天花粉蛋白的使用劑量以及它 們之間的使用比例。最佳使用量以能引起動物明顯的過敏性哮喘癥狀且無其它過度
不良反應(yīng)為準(zhǔn)。所述的雞血清白蛋白和天花粉蛋白的比例通常在1:100-100:1; 1:10-10:1;優(yōu)選的雞血清白蛋白和天花粉蛋白的重量比例為1:5-5:1。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，當(dāng)用于免疫小鼠時，天花粉蛋白通常的用量在1-1000 Ug之間，較佳的在5ug-500ug之間，更佳的在5ug-50ug之間；雞血清白蛋 白通常的用量在lu g-1000ii g之間，較佳的在lOu g-500ix g之間。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物中還含有有效量的藥學(xué)上或免疫學(xué)上可接受 的載體，所述的載體是適用于哺乳動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變 態(tài)反應(yīng))的物質(zhì)，包括各種賦形劑和稀釋劑。它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。 本發(fā)明的主要優(yōu)點在于
(1) .本發(fā)明首次揭示以天花粉蛋白免疫哺乳動物，在沒有佐劑參加的情 況下即可誘導(dǎo)哺乳動物發(fā)生過敏性哮喘，更類似于人類的發(fā)病過程。
(2) .本發(fā)明的動物模型具有過敏性哮喘的典型特征，可極好地模擬體內(nèi) 過敏性哮喘的發(fā)生發(fā)展，從而可良好地應(yīng)用于篩選抗過敏性哮喘的藥物。
(3) .本發(fā)明還揭示天花粉蛋白可作為佐劑輔助雞卵清白蛋白，用于建立 過敏動物模型。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說 明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方 法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠 商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟 悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于 本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
實施例l小鼠過敏性哮喘模型的建立
1. 建立由天花粉蛋白和鋁佐劑誘導(dǎo)的小鼠過敏性哮喘模型(模型l)
C57BL/6小鼠(雌性，6-8周)，在第1天、14天腹腔注射天花粉蛋白(TCS， 純度99°/。的天花粉提取物，購自上海金山制藥有限公司)的PBS溶液，劑量為 5ug/200ul PBS/鼠，跟lmg的鋁佐劑(Al咖，氫氧化鋁在PBS中的懸濁液，其中 含氫氧化鋁10%)混合。從第21天到第23天，連續(xù)3天對小鼠進行抗原的呼吸道 攻擊，每天30分鐘，用超聲霧化器霧化含TCS的PBS溶液，劑量為2mg/ml。最后 一次抗原攻擊24小時后，解剖小鼠以進行測試。采用同樣的處理方法，以不含 TCS的同樣體積含鋁佐劑(lmg)的PBS溶液處理小鼠，以作為陰性對照(PBS十 Alum對照組)。
2. 建立由天花粉蛋白誘導(dǎo)的小鼠過敏性哮喘模型(模型2)C57BL/6小鼠(雌性，6-8周)，在第1天、第14天腹腔注射含天花粉蛋白的 PBS溶液(注這里不加任何佐劑)，劑量為5ug/200ul PBS/鼠。從第21天到第 23天，用超聲霧化器霧化天花粉溶液，連續(xù)3天對小鼠進行抗原的呼吸道攻擊， 劑量為2mg/ml，每天攻擊30分鐘。最后一次抗原攻擊24小時后，解剖小鼠以進 行測試。
3. 建立由雞卵清白蛋白和鋁佐劑誘導(dǎo)的小鼠過敏性哮喘模型(模型3)
C57BL/6小鼠(雌性，6-8周)，在第1天，第14天腹腔注射含雞卵清白蛋白 (OVA，購自Sigma公司)的PBS溶液，劑量為10ug/200y 1 PBS/鼠，跟lmg的鋁佐 劑混合。從第21天到第23天，連續(xù)3天對小鼠進行抗原的呼吸道攻擊，每天30 分鐘，用超聲霧化器霧化TCS的PBS溶液，劑量為W(m/v)。最后一次抗原攻擊 24小時后，解剖小鼠以進行測試。采用同樣的處理方法，以不含OVA的含鋁佐 劑的PBS溶液處理小鼠，以作為陰性對照(PBS+Alum對照組)。
4. 建立由雞卵清白蛋白誘導(dǎo)的小鼠過敏性哮喘模型(模型4)
C57BL/6小鼠(雌性，6-8周)，在第1天，第14天腹腔注射含雞卵清白蛋白 的PBS溶液，劑量為10ug/200ul PBS/鼠(注這里沒加佐劑)。從第21天到第 23天，連續(xù)3天對小鼠進行抗原的呼吸道攻擊，每天30分鐘，用超聲霧化器霧 化TCS的PBS溶液，劑量為iy。(m/v)。最后一次抗原攻擊24小時后，解剖小鼠進 行測試。
實施例2小鼠過敏性哮喘模型測試
對實施例l制備的各小鼠模型進行測試，測試的指標(biāo)包括浸潤到氣道中 炎癥細胞的總數(shù)、嗜酸性細胞的數(shù)量、以及血清中IgE的水平和肺組織的病理
切片。肺部支氣管灌洗液浸潤的總炎癥細胞量和嗜酸性粒細胞含量可驗證TCS 是否引起過敏性呼吸道炎癥。
檢測方法如下小鼠眼球取血，血液凝集取血清；小鼠處死，結(jié)扎左肺， 分離氣管，用9號針頭插入小鼠氣管，分3次注射0.5ml的PBS溶液灌洗氣道并吸 出，灌洗液待測浸潤細胞數(shù)和細胞因子。分離左肺進行病理切片。血清中IgE 量的檢測釆用ELISA方法。
對呼吸道灌洗液中的細胞總數(shù)進行計數(shù)，測得各模型浸潤的炎性細胞總數(shù)
15見圖1A(模型1和模型3)和2A(模型2和模型4)。可見，在佐劑存在的情況下，雞
卵清白蛋白和天花粉蛋白誘導(dǎo)的小鼠模型中炎性細胞總數(shù)接近，且顯著高于 PBS+佐劑對照組。而在佐劑不存在的情況下，雞卵清白蛋白誘導(dǎo)的小鼠模型中 炎性細胞總數(shù)遠低于天花粉蛋白誘導(dǎo)的小鼠模型，幾乎沒有炎性細胞。
用呼吸道灌洗液取20u l涂片，進行常規(guī)的H&E染色，然后隨機取200個細 胞/載玻片進行統(tǒng)計，計數(shù)其中嗜酸性粒細胞，結(jié)果見圖1B(模型1和模型3)和 圖2B(模型2和模型4)?？梢姡谧魟┐嬖诘那闆r下，雞卵清白蛋白和天花粉蛋 白誘導(dǎo)的小鼠模型中嗜酸性粒細胞總數(shù)接近，且顯著高于PBS對照組。而在佐 劑不存在的情況下，雞卵清白蛋白誘導(dǎo)的小鼠模型中嗜酸性粒細胞總數(shù)遠低于 天花粉蛋白誘導(dǎo)的小鼠模型。
用ELISA的方法測定血清中抗原特異性IgE的水平，結(jié)果測得的IgE的量見 圖1C和圖2C?？梢?，在佐劑存在的情況下，雞卵清白蛋白誘導(dǎo)的小鼠模型中IgE 的量明顯低于天花粉蛋白誘導(dǎo)的模型，但兩者均高于PBS對照組。而在佐劑不 存在的情況下，雞卵清白蛋白誘導(dǎo)的小鼠模型中IgE的量遠低于天花粉蛋白誘 導(dǎo)的小鼠模型，幾乎不存在。
肺組織的病理切片方法為常規(guī)方法，主要如下分離左肺，固定，脫水， 石蠟包埋，切片，服E染色觀察，拍照。結(jié)果見圖1D(模型1和模型3)和圖2D(模 型2和模型4)。
綜上可見，天花粉蛋白在佐劑存在與不存在的情況下都能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生 過敏性呼吸道炎癥。而血清白蛋白在佐劑不存在的情況下難以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生過 敏性呼吸道炎癥。
實施例3天花粉蛋白在體內(nèi)引起的是Th2類型免疫反應(yīng)
本實施例中，通過檢測天花粉蛋白誘導(dǎo)的動物模型肺部灌洗液中Th2類型 細胞因子IL-4， IL-5和IL-13的含量，確定TCS誘導(dǎo)的過敏性哮喘的類型。 以PBS對照組作為對照。
IL-4， IL-5、 IL-13、 INF-Y、 IgE、 IgGl、 IgG2a的檢測根據(jù)常規(guī)的方法 進行。
結(jié)果見圖3，其中，支氣管灌洗液(BALF)中測定細胞因子IL-4(A)，IL-5(B)， IL-13(C)， INF-Y (D)的表達；肺引流淋巴結(jié)細胞在體外經(jīng)TCS重新刺激后(LNs)
16測定細胞因子IL-4(E), INF-y (F)的表達。血清中免疫球蛋白的水平測定指標(biāo) 為總的IgE水平(G)， TCS特異的IgG2a(H)?？梢?，在天花粉蛋白(存在或不存 在佐劑)誘導(dǎo)的動物模型的支氣管灌洗液(BALF)中，IL-4， IL-5和IL-13含量 顯著高于PBS組，且天花粉蛋白單獨誘導(dǎo)的小鼠模型中這些因子的含量明顯高 于天花粉蛋白+佐劑誘導(dǎo)的小鼠模型；在肺引流淋巴結(jié)細胞體外經(jīng)TCS重新刺 激后，IL-4含量顯著高于PBS組。并且，在天花粉蛋白(存在或不存在佐劑) 誘導(dǎo)的動物模型中IgE含量顯著高于PBS組，且天花粉蛋白單獨誘導(dǎo)的小鼠模 型中這些因子的含量明顯高于天花粉蛋白+佐劑誘導(dǎo)的小鼠模型。而IFN-y以 及IgG2a在天花粉蛋白單獨誘導(dǎo)的小鼠模型中均沒有顯著升高。
通過檢測肺組織局部的細胞因子，以及血清中代表Th2免疫反應(yīng)的兩類免 疫球蛋白類型IgE和IgGl，確定經(jīng)TCS處理過的小鼠發(fā)生的是Th2類型免疫反 應(yīng)。
實施例4 TCS可以作為佐劑輔助OVA誘導(dǎo)OVA特異性的過敏性氣道炎
在經(jīng)典方式OVA致敏小鼠時，用TCS可以替代Alum，用作佐劑輔助OVA致 敏(圖4)。
C57BL/6小鼠(雌性，6-8周)，在第1天，第14天腹腔注射含雞卵清白蛋白 的PBS溶液，劑量為10ug/200u 1 PBS/鼠(注這里不加佐劑)。在雞卵清白 蛋白注射的前一天，分別用PBS(陰性對照)或者天花粉蛋白(5u g/200u 1 PBS / 鼠)或者鋁佐劑.(lmg/鼠)注射小鼠(也可將10ug雞卵清白蛋白與5!xg天花粉蛋 白混合，加入PBS后免疫小鼠)。從第21天到第23天，連續(xù)3天對小鼠進行抗原 的呼吸道攻擊，每天30分鐘，用超聲霧化器霧化雞卵清白蛋白的PBS溶液，劑 量為1%( m/V)。最后一次抗原攻擊24小時后，解剖小鼠進行測試。測定包括 浸潤到氣道中炎癥細胞的總數(shù)、嗜酸性細胞的數(shù)量以及血清中IgE的水平。測 定方法同前述。
對呼吸道灌洗液中的細胞總數(shù)進行計數(shù)，測得浸潤的炎性細胞總數(shù)見圖 4A?？梢姡锰旎ǚ鄣鞍缀碗u卵清白蛋白(TCS + OVA)誘導(dǎo)的小鼠模型中炎性細 胞數(shù)量明顯高于陰性對照組和單用雞卵清白蛋白組(OVA)，且還高于雞卵清白 蛋白+佐劑組(alum+0VA)。
用呼吸道灌洗液取20u l涂片，進行服E染色，然后隨機取200個細胞/載玻 片進行統(tǒng)計，計數(shù)其中嗜酸性粒細胞，結(jié)果見圖4B。可見用天花粉蛋白和雞卵
17清白蛋白誘導(dǎo)的小鼠模型中嗜酸性粒細胞數(shù)量明顯高于陰性對照組和單用雞 卵清白蛋白組，且略高于雞卵清白蛋白+佐劑組。
用ELISA的方法測定血清中抗原特異性IgE的水平(用OVA包板)，結(jié)果見圖 4C?？梢娪锰旎ǚ鄣鞍缀碗u卵清白蛋白誘導(dǎo)的小鼠模型中炎性細胞數(shù)量明顯高 于陰性對照組和單用雞卵清白蛋白組。肺組織切片見圖3D。
因此可見，天花粉蛋白可以作為佐劑輔助雞卵清白蛋白誘導(dǎo)雞卵清白蛋白 特異性的過敏性氣道炎。
此外，采用如前所述相同的方法，利用20wg雞卵清白蛋白與8ug天花 粉蛋白混合，加入PBS后腹腔注射小鼠，之后采用同樣方法進行呼吸道攻擊， 結(jié)果提示也可以誘導(dǎo)顯著的過敏性氣道炎。
實施例5藥物篩選
以實施例1制備的過敏性哮喘模型2為受試對象，檢測候選物質(zhì)刺激前后 動物肺組織中炎性細胞數(shù)、嗜酸性細胞數(shù)以及細胞因子IL-4、 IL-5、 IL-13的 量，從而判斷候選物質(zhì)是否對于抗過敏性哮喘是有效的。
測試組給予候選物質(zhì)的模型2;
對照組不給予候選物質(zhì)的模型2。
如果與對照組相比，測試組中的炎性細胞數(shù)、嗜酸性細胞數(shù)以及細胞因子 IL-4、 IL-5或IL-13的量下降，則說明該候選物質(zhì)可抑制過敏性哮喘。
利用患過敏性哮喘動物，對經(jīng)篩選能夠下調(diào)肺組織中炎性細胞數(shù)、嗜酸性 細胞數(shù)以及細胞因子IL-4、 IL-5或IL-13的量的物質(zhì)進行進一步的動物試驗， 進一步驗證治療效果。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻 被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后， 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申 請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1. 一種天花粉蛋白的用途，其特征在于，用于制備誘導(dǎo)非人哺乳動物發(fā)生過敏性哮喘的組合物。
2. 如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的非人哺乳動物是鼠。
3. 如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于增加非人哺乳動物肺組織或呼吸道炎性細胞或嗜酸性粒細胞的數(shù)量；或用于增加非人哺乳動物肺組織中細胞因子IL-4、 IL-5或IL-13的水平。
4. 如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于增加非人哺乳動物血清中抗原特異性IgE型免疫球蛋白的水平。
5. —種過敏性哮喘的非人哺乳動物的用途，所述的非人哺乳動物是由天花粉蛋白免疫的非人哺乳動物；所述非人哺乳動物用于篩選抗過敏性哮喘的物質(zhì)。
6. 如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述由天花粉蛋白免疫非人哺乳動物的方法是先對哺乳動物進行天花粉蛋白系統(tǒng)免疫，然后對哺乳動物進行呼吸道天花粉蛋白氣霧攻擊。
7. —種篩選抗過敏性哮喘的潛在物質(zhì)的方法，其特征在于，所述方法包括步驟(1) 將候選物質(zhì)給予過敏性哮喘的非人哺乳動物，所述的非人哺乳動物是由天花粉蛋白免疫的非人哺乳動物；(2) 檢測動物呼吸道或肺組織內(nèi)炎性細胞數(shù)、嗜酸性粒細胞數(shù)、炎癥性細胞因子的水平、或血清中抗原特異性IgE型免疫球蛋白的水平，若動物呼吸道或肺組織內(nèi)炎性細胞數(shù)、嗜酸性粒細胞數(shù)、炎癥性細胞因子的水平、或血清中抗原特異性IgE型免疫球蛋白的水平下降，則表明該候選物質(zhì)是抗過敏性哮喘的潛在物質(zhì)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(l)包括在測試組中，將 候選物質(zhì)給予過敏性哮喘的非人哺乳動物；和/或步驟(2)包括檢測測試組動物呼吸道或肺組織內(nèi)炎性細胞數(shù)、嗜酸性粒細胞數(shù)、炎癥性細胞因子的水平、或血清中抗原特異性IgE型免疫球蛋白的水平，并與對照組比較，其中所述的對照組是不給予候選物質(zhì)的過敏性哮喘的非人哺乳動物；如果測試組中動物肺組織內(nèi)炎性細胞數(shù)、嗜酸性粒細胞數(shù)、炎癥 性細胞因子的水平、或血清中抗原特異性IgE型免疫球蛋白的水平在統(tǒng)計學(xué)上 低于對照組，則表明該候選物質(zhì)是抗過敏性哮喘的潛在物質(zhì)。
9. 一種引發(fā)過敏性哮喘的組合物，其特征在于，所述的組合物含有 有效量的雞血清白蛋白；和有效量的天花粉蛋白。
10. 權(quán)利要求9所述的引發(fā)過敏性哮喘的組合物的用途，其特征在于，用于 制備誘導(dǎo)非人哺乳動物發(fā)生過敏性哮喘的組合物。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了天花粉蛋白在制備小鼠過敏性哮喘模型中的用途，所述的天花粉蛋白不需要佐劑的輔助即可發(fā)揮作用。本發(fā)明還公開了一種由天花粉蛋白誘導(dǎo)的小鼠過敏性哮喘疾病模型。本發(fā)明建立的過敏性哮喘動物模型具有過敏性哮喘疾病的典型特征，可良好地模擬體內(nèi)過敏性哮喘的發(fā)生發(fā)展。同時，所述動物模型還可應(yīng)用于篩選抗過敏性哮喘的藥物。
文檔編號A61K49/00GK101496904SQ20081003325
公開日2009年8月5日 申請日期2008年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月30日
發(fā)明者兵 孫, 毛開睿, 媛 王 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院