一種用鯊魚(yú)醇溶蛋白制備的抗氧化肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用鯊魚(yú)醇溶蛋白制備的抗氧化肽及其制備方法和應(yīng)用，該抗氧化肽的氨基酸序列分別為T(mén)rp-Asp-Arg或者/和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys，ESI-MS檢測(cè)給出分子離子峰m/z?476.40[M+H]+或者/和m/z?668.60[M+H]+；制備時(shí)，以鯊魚(yú)肉為原料，利用乙醇提取鯊魚(yú)醇溶蛋白，然后再以木瓜蛋白酶作為酶解用酶，通過(guò)酶解技術(shù)同時(shí)融合大孔樹(shù)脂脫鹽、超濾分級(jí)和色譜精制得到抗氧化肽。本發(fā)明的制備方法工藝科學(xué)合理，酶解過(guò)程易監(jiān)控，制得的抗氧化肽具有較高的活性，與化學(xué)合成的抗氧化劑相比較，本發(fā)明的抗氧化肽具有安全無(wú)毒副作用、抗氧化活性強(qiáng)和易于消化吸收等優(yōu)點(diǎn)，可以作為藥品、保健食品和食品添加劑等。
【專利說(shuō)明】一種用鯊魚(yú)醇溶蛋白制備的抗氧化肽及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001 ] 本發(fā)明涉及的是一種用鯊魚(yú)醇溶蛋白制備的抗氧化肽及其制備方法和應(yīng)用，是一種利用乙醇提取鯊魚(yú)醇溶性蛋白的方法及利用酶工程技術(shù)和色譜技術(shù)制備高抗氧化活性醇溶蛋白肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，由于化學(xué)抗氧化添加劑的不安全性和食品安全的考慮，化學(xué)抗氧化添加劑如BHA (丁基羥基茴香醚)、BHT (2，6-二叔羥基對(duì)甲酚)和TBHQ (特丁基對(duì)苯二酚)等的應(yīng)用受到了較大限制。因此，高效、低毒的天然食品抗氧化劑的開(kāi)發(fā)成為研究熱點(diǎn)領(lǐng)域。
[0003]目前，已從各種植物、動(dòng)物組織中提取得到了抗氧化活性顯著的物質(zhì)，如茶葉中的茶多酚、大豆中的異黃酮、枸杞中的多糖等物質(zhì)。而已有的研究發(fā)現(xiàn)，生物體內(nèi)天然多肽也具有顯著的抗氧化活性，如存在于肌肉組織中的肌肽不僅可以有效抑制脂肪氧化，而且在肉制品貯藏時(shí)有護(hù)色作用。另外，以生物蛋白為原料，采用酶解技術(shù)得到的酶解物及其組成多肽也具有顯著的抗氧化活性。如張學(xué)忠等發(fā)現(xiàn)大豆酶解多肽具有清除超氧陰離子自由基，減少人體紅細(xì)胞氧化溶血程度以及抑制脂質(zhì)氧化導(dǎo)致的脂質(zhì)體膜的破壞；徐懷德等研究發(fā)現(xiàn)甲魚(yú)蛋白的木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物可清除羥基自由基和超氧陰離子自由基和DPPH自由基。
[0004]醇溶蛋白早在18世紀(jì)末就被人們發(fā)現(xiàn)，是植物種子儲(chǔ)存蛋白的組分之一。不溶于水，可溶于50%~90%乙醇。由于醇溶蛋白為單鏈蛋白，單肽通過(guò)氫鍵和疏水鍵相互作用，這兩種鍵的鍵能較低，容易被“打斷”，所以醇溶蛋白使面筋具有黏性和延伸性，在食品保鮮、藥品緩釋劑、美容護(hù)膚等方面具有較大用途。但是目前尚未有關(guān)于動(dòng)物醇溶蛋白的報(bào)道。
[0005] 申請(qǐng)人:在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，路氏雙髻鯊魚(yú)肉中含有大量的醇溶蛋白，且醇溶蛋白的酶解產(chǎn)物具有較好的抗氧化活性，而文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)以鯊魚(yú)肉為原料提取制備醇溶蛋白，利用酶解技術(shù)和色譜技術(shù)制備醇溶蛋白抗氧化肽的工藝研究處于空白階段，而鯊魚(yú)醇溶蛋白肽在清除自由基和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化方面的應(yīng)用更是未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種用鯊魚(yú)醇溶蛋白制備的抗氧化肽，具有安全無(wú)毒副作用、抗氧化活性強(qiáng)和易于消化吸收等優(yōu)點(diǎn)。
[0007]本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種用鯊魚(yú)醇溶蛋白制備的抗氧化肽的制備方法，利用酶解技術(shù)和色譜技術(shù)進(jìn)行制備，工藝科學(xué)合理、易操作。
[0008]本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種用鯊魚(yú)醇溶蛋白制備的抗氧化肽的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明為解決上述第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題所采取的技術(shù)方案為:一種用鯊魚(yú)醇溶蛋白制備的抗氧化肽，其特征在于氨基酸序列分別為T(mén)rp-Asp-Arg或者/和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys, ES1-MS 檢測(cè)給出分子離子峰 m/z 476.40 [M+H]+ 或者 / 和 m/z668.60[M+H]+。
[0010]本發(fā)明為解決上述第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題所采取的技術(shù)方案為:一種用鯊魚(yú)醇溶蛋白制備的抗氧化肽的制備方法，其特征在于步驟依次為:
[0011]I)以鯊魚(yú)醇溶蛋白作為原料，按固液比lg:5mL~18:101^，加入？?jī)?cè)~6磷酸鹽緩沖液，用HCl或NaOH調(diào)pH到5~7，得混合液；
[0012]2 )將混合液溫度升至5(T60 °C攪拌預(yù)熱15mirT20min，按照醇溶蛋白質(zhì)量的0.8%~1.2%加入木瓜蛋白酶，酶解溫度為5(T60°C，酶解時(shí)間I~3h ；
[0013]3)將酶解產(chǎn)物先經(jīng)滅酶處理得酶解液，再將酶解液依次脫鹽、超濾和層析，得到抗氧化肽。
[0014]作為優(yōu)選,所述步驟2)中的木瓜蛋白酶的酶活力≥1.5X 106U/go
[0015]作為改進(jìn)，所述步驟3)中的滅酶處理為:將步驟2)所得的酶解產(chǎn)物升溫至90-100?，并于此溫度保持10mirTl5min，再冷卻至1(T20°C以終止酶反應(yīng)，然后離心，取上清液作為酶解液。
[0016]作為改進(jìn)，所述步驟3)的脫鹽、超濾和層析的具體過(guò)程為:
[0017]脫鹽:將得到的酶解液制成濃度為15mg/mL~20mg/mL溶液，加入到大孔樹(shù)脂層析柱進(jìn)行脫鹽，然后用質(zhì)量濃度60-80%乙醇進(jìn)行解析，除去乙醇，濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，得脫鹽酶解物干粉；
[0018]超濾:將脫鹽酶解物干粉溶于ρΗ6.8~7.2磷酸鹽緩沖液配成8~12mg/mL的溶液，于
0.1MPa^0.15MPa的工作壓力和20°C~30°C的工作溫度下采用超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于IkDa部分，得超濾酶解液；
[0019]層析:將超濾酶解液用pH6.8^7.2磷酸鹽緩沖液配成8~12mg/mL的溶液，經(jīng)過(guò)DEAE-52纖維素陰離子交換樹(shù)脂分離，用水、0.09~0.1lmol/L、0.45~0.55mol/L和
0.9~1.lmol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，收集0.45、.55mol/L NaCl的洗脫組分，得離子交換酶解液；將離子交換酶解液用PH6.8~7.2磷酸鹽緩沖液配成8~12mg/mL的溶液，經(jīng)過(guò)凝膠柱層析分離，用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，收集所得的最高活性組，即凝膠制備酶解物；將凝膠制備酶解物用PH6.8^7.2磷酸鹽緩沖液配成0.9^1.lmg/mL的溶液，利用反相高效液相色譜進(jìn)行純化，根據(jù)抗氧化活性得2個(gè)高活性抗氧化肽。
[0020]作為優(yōu)選，所述大孔樹(shù)脂為DlOl
[0021]再優(yōu)選，凝膠為葡聚糖凝膠G-25 ;所述反相高效液相色譜的條件為:色譜柱為Zorbax C18，進(jìn)樣量19~21 μ g ;流動(dòng)相:A水，含質(zhì)量濃度0.09~0.11%三氟乙酸，B乙腈，含質(zhì)量濃度0.09~0.11%三氟乙酸；梯度洗脫:0-10min:100%A ；10-50min:0-100%B ;洗脫速度
0.9~1.lml/min ;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。
[0022]進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟I)的鯊魚(yú)醇溶蛋白的提取方法，包括以下步驟:
[0023]I)鯊魚(yú)的魚(yú)肉按lg:20mL~lg:30mL固液比加入質(zhì)量濃度85%~95%的乙醇溶液，然后勻漿，在30°C~50°C溫度下動(dòng)態(tài)提取80mirTl20min ；
[0024]2)將提取液的pH值用NaOH調(diào)至8.5^10.0，用蒸餾水將乙醇濃度調(diào)至質(zhì)量濃度55%~65%，稀釋后的提取液在 25°C 下放置 30mirT40min，于 400(T5000rpm 離心 20mirT30min，
收集上清液；
[0025]3)上清液中加入NaCl至質(zhì)量濃度為5%~8%，鹽析10h~15h后，于400(T5000rpm離心10min~20min,收集沉淀；
[0026]4)沉淀用乙醚脫脂20h~30h，然后于1000(Tl2000rpm離心10mirTl5min將乙醚去
除、凍干，即得醇溶蛋白。
[0027]最后，所述鯊魚(yú)為路氏雙髻鯊。
[0028]本發(fā)明為解決上述第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題所采取的技術(shù)方案為:一種用鯊魚(yú)醇溶蛋白制備的抗氧化肽的應(yīng)用，其特征在于Trp-Asp-Arg或/和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys對(duì)羥基自由基、ABTS自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用，而對(duì)DPPH自由基顯示出中等的清除活性；同時(shí)，Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys亦顯示出良好的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制作用和對(duì)β-胡蘿卜素亞油酸體系中產(chǎn)生的過(guò)氧化氫自由基的良好清除作用；Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys具有安全無(wú)毒副作用、抗氧化活性強(qiáng)和易于消化吸收優(yōu)點(diǎn)，可以作為藥品、保健食品或者食品添加劑上應(yīng)用。
[0029]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明工藝科學(xué)合理，利用乙醇提取醇溶蛋白，選用木瓜蛋白酶作為酶解用酶，通過(guò)生物酶解法同時(shí)融合大孔樹(shù)脂脫鹽、超濾分級(jí)和色譜精制，酶解過(guò)程易監(jiān)控，同時(shí)制得的抗氧化肽具有較高的活性；與化學(xué)合成的抗氧化劑相比較，本發(fā)明制得的抗氧化肽具有安全無(wú)毒副作用、抗氧化活性強(qiáng)和易于消化吸收等優(yōu)點(diǎn)，可以作為藥品、保健食品和食品添加劑等。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0030]圖la、Ib是本發(fā)明的葡聚糖凝膠G-25制備酶解物的RP-HPLC分析:A為葡聚糖凝膠G-25制備酶解物的I到60min的洗脫曲線；B為15到34min的洗脫曲線；
[0031]圖2a、2b是本發(fā)明的Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys的反相高效液相色譜(RP-HPLC)圖:A Trp-Asp-Arg ；B Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys ；
[0032]圖3a、3b 是本發(fā)明的 Trp-Asp-Arg 和 Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys 的質(zhì)譜圖:ATrp-Asp-Arg ；B Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys ；
[0033]圖4是本發(fā)明的Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys的DPPH自由基清除活性；
[0034]圖5是本發(fā)明的Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys的羥基自由基清除活性；
[0035]圖6是本發(fā)明的Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys的ABTS自由基清除活性；
[0036]圖7是本發(fā)明的Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys的超氧陰離子自由基清除活性；
[0037]圖8是本發(fā)明的Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys在β-胡蘿卜素-亞油酸體系中的抗氧化活性；
[0038]圖9是本發(fā)明的Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制活性。【具體實(shí)施方式】
[0039]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0040]鯊魚(yú)醇溶蛋白的提取及其制備抗氧化肽的方法，制備工藝流程如下:鯊魚(yú)肉一醇提一醇溶蛋白一酶解一酶解物一大孔樹(shù)脂脫鹽一超濾一離子交換層析一凝膠過(guò)濾層析一高效液相色譜制備一抗氧化肽。
[0041]實(shí)施例1[0042]I)路氏雙髻鯊去魚(yú)皮和魚(yú)骨，魚(yú)肉按Ig: 25mL固液比加入90%的乙醇溶液，用高速組織搗碎機(jī)將其制成勻漿，在45°C溫度下動(dòng)態(tài)提取90min ；
[0043]2)將提取液的pH值用0.lmol/L的NaOH調(diào)至9.0，用蒸餾水將乙醇濃度調(diào)至60%。稀釋后的提取液在25°C下放置30min,于4500rpm離心20min,收集上清液；
[0044]3)上清液中加入NaCl至濃度為5%,鹽析12h后，于4500rpm離心15min,收集沉淀；
[0045]4)沉淀用乙醚脫脂24h，然后于IlOOOrpm離心12min將乙醚去除，即得醇溶蛋白，冷凍干燥得粉末，儲(chǔ)存于_20° C備用。
[0046]5)以鯊魚(yú)醇溶蛋白作為原料，按固液比lg:5mL加入磷酸鹽緩沖液(pH5.8)，用
0.lmol/L HCl 或 0.lmol/L NaOH 調(diào)節(jié) pH 到 6，得混合液；
[0047]6)將混合液溫度升至55°C攪拌預(yù)熱15min，按照醇溶蛋白質(zhì)量的1.0%加入木瓜蛋白酶，酶解溫度為55°C，酶解時(shí)間2h ；
[0048]7)將酶解產(chǎn)物先經(jīng)滅酶處理得酶解液，再將酶解液依次經(jīng)脫鹽、超濾和層析，得到抗氧化肽，利用氨基酸序列分析和質(zhì)譜測(cè)定其結(jié)構(gòu)，具體過(guò)程為:
[0049]①滅酶處理:將酶解產(chǎn)物升溫至95°C，并于此溫度下保持IOmin后，冷卻至20°C，離心，得酶解液；
[0050]②大孔樹(shù)脂脫鹽:將得到的酶解液制成濃度為15mg/mL，加入到DlOl大孔樹(shù)脂層析柱進(jìn)行脫鹽，然后用70%乙醇進(jìn)行解析，除去乙醇，濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，得脫鹽酶解物干粉；
[0051]③超濾:將上述脫鹽酶解物干粉溶于磷酸鹽緩沖液(pH7.0)配成10mg/mL的溶液，于0.15MPa的工作壓力和25V的工作溫度下采用超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于IkDa部分，得超濾酶解液；
[0052]④陰離子交換層析:將上述超濾酶解液用磷酸鹽緩沖液(PH7.0)配成10mg/mL的溶液，經(jīng)過(guò)DEAE-52纖維素陰離子交換樹(shù)脂分離，用水、0.1mol/L、0.5mol/L和1.0moI/LNaCl溶液進(jìn)行洗脫，收集0.5mol/L NaCl的洗脫組分，得離子交換酶解液；
[0053]⑤凝膠柱層析:將上述離子交換酶解液用磷酸鹽緩沖液(pH7.0)配成10mg/mL的溶液，經(jīng)過(guò)凝膠柱層析分離，用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，利用DPPH法測(cè)定抗氧化活性，收集所得的最高活性組，即凝膠制備酶解物。
[0054]⑥反相高效液相色譜精制:將上述凝膠制備酶解物用磷酸鹽緩沖液(PH7.0)配成lmg/mL的溶液，利用反相高效液相色譜(RP-HPLC，色譜條件:樣品濃度100 μ g/ml ;進(jìn)樣量20 μ g ;色譜柱為Zorbax C18 (250mmX4.6_，5 μ m);柱溫為室溫；流動(dòng)相:A水(含0.1%三氟乙酸)和B乙腈(含0.1%三氟乙酸);梯度洗脫:0-10min:100%A ；10-50min:0-100%B ;洗脫速度1.0ml/min ;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280nm)進(jìn)行純化，利用DPPH法測(cè)定抗氧化活性，收集活性最高的2個(gè)抗氧化肽(見(jiàn)圖1)。
[0055]⑦結(jié)構(gòu)檢測(cè):收集活性最高的2個(gè)抗氧化肽經(jīng)檢測(cè)為單一峰(見(jiàn)圖2)，利用蛋白/多肽序列分析儀測(cè)定2個(gè)抗氧化肽的氨基酸序列分別為T(mén)rp-Asp-Arg和 Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys, ES1-MS 檢測(cè)給出分子離子峰 m/z 476.40 [M+H]+ 和 m/z668.60[M+H]+ (見(jiàn)圖 3)。
[0056]實(shí)施例2[0057]I)路氏雙髻鯊去魚(yú)皮和魚(yú)骨，魚(yú)肉按Ig: 20mL固液比加入85%的乙醇溶液，用高速組織搗碎機(jī)將其制成勻漿，在30°C溫度下動(dòng)態(tài)提取IOOmin ；
[0058]2)將提取液的pH值用0.lmol/L的NaOH調(diào)至10.0，用蒸餾水將乙醇濃度調(diào)至55%。稀釋后的提取液在25°C下放置35min,于4000rpm離心30min,收集上清液；
[0059]3)上清液中加入NaCl至濃度為7%，鹽析IOh后，于4000rpm離心20min，收集沉淀；
[0060]4)沉淀用乙醚脫脂20h，然后于1000Orpm離心15min將乙醚去除，即得醇溶蛋白，
冷凍干燥得粉末，儲(chǔ)存于_20°C備用。
[0061]5)以鯊魚(yú)醇溶蛋白作為原料，按固液比lg:1OmL加入磷酸鹽緩沖液(pH5.8)，用
0.lmol/L HCl 或 0.lmol/L NaOH 調(diào)節(jié) pH 到 7，得混合液；
[0062]6)將混合液溫度升至50°C攪拌預(yù)熱20min，按照醇溶蛋白質(zhì)量的0.8%加入木瓜蛋白酶，酶解溫度為50°C，酶解時(shí)間3h。
[0063]下面步驟同實(shí)施例1。
[0064]實(shí)施例3
[0065]I)路氏雙髻鯊去魚(yú)皮和魚(yú)骨，魚(yú)肉按Ig: 30mL固液比加入95%的乙醇溶液，用高速組織搗碎機(jī)將其制成勻漿，在50°C溫度下動(dòng)態(tài)提取SOmin ；
[0066]2)將提取液的pH值用0.lmol/L的NaOH調(diào)至10.0，用蒸餾水將乙醇濃度調(diào)至65%。稀釋后的提取液在25°C下放置40min,于5000rpm離心20min,收集上清液；
[0067]3)上清液中加入NaCl至濃度為8%,鹽析15h后，于5000rpm離心IOmin,收集沉淀；
[0068]4)沉淀用乙醚脫脂20h，然后于12000rpm離心IOmin將乙醚去除，即得醇溶蛋白，
冷凍干燥得粉末，儲(chǔ)存于_20°C備用。
[0069]5)以鯊魚(yú)醇溶蛋白作為原料，按固液比lg:8mL加入磷酸鹽緩沖液(pH5.8)，用
0.lmol/L HCl 或 0.lmol/L NaOH 調(diào)節(jié) pH 到 5，得混合液；
[0070]6)將混合液溫度升至60°C攪拌預(yù)熱15min，按照醇溶蛋白質(zhì)量的1.2%加入木瓜蛋白酶，酶解溫度為60°C，酶解時(shí)間lh。
[0071]下面步驟同實(shí)施例1.[0072]將制得的鯊魚(yú)醇溶蛋白抗氧化肽進(jìn)行DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)圖4)、羥基自由基清除實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)圖5)、ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)圖6)、超氧陰離子自由基清除實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)圖7)、β -胡蘿卜素一亞油酸體系實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)圖8)和脂質(zhì)過(guò)氧化抑制實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)圖9)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:Trp_Asp_Arg 和 Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys 對(duì)羥基自由基(EC50 0.15mg/mL 和 0.24mg/mL)、ABTS (EC50 0.34mg/mL 和 0.12mg/mL)和超氧陰離子自由基(EC5tl 0.09mg/mL 和 0.12mg/mL)具有良好的清除作用，而對(duì)DPPH自由基(ECki 3.63mg/mL和4.llmg/mL)顯示出中等的清除活性；同時(shí)，Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys亦顯示出良好的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制作用和對(duì)胡蘿卜素亞油酸體系中產(chǎn)生的過(guò)氧化氫自由基的良好清除作用。
[0073]最后，尚需注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種用鯊魚(yú)醇溶蛋白制備的抗氧化肽，其特征在于該抗氧化鈦的氨基酸序列分別為T(mén)rp-Asp-Arg或者/和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys, ES1-MS檢測(cè)給出分子離子峰m/z476.40 [M+H] + 或者 / 和 m/z 668.60 [M+H]+。
2.—種權(quán)利要求1所述的抗氧化肽的制備方法，其特征在于步驟依次為: 1)以鯊魚(yú)醇溶蛋白作為原料，按固液比lg:5mL~18:101^，加入？?jī)?cè)飛磷酸鹽緩沖液，用HCl或NaOH調(diào)pH到5~7，得混合液； 2)將混合液溫度升至5(T60°C攪拌預(yù)熱15mirT20min，按照醇溶蛋白質(zhì)量的0.8%~1.2%加入木瓜蛋白酶，酶解溫度為5(T60°C，酶解時(shí)間l~3h ； 3)將酶解產(chǎn)物先經(jīng)滅酶處理得酶解液，再將酶解液依次脫鹽、超濾和層析，得到抗氧化肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟2)中的木瓜蛋白酶的酶活力≥1.5X106U/g。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)中的滅酶處理為:將步驟2)所得的酶解產(chǎn)物升溫至9(Tl00°C，并于此溫度保持IOmin~15min，再冷卻至1(T20°C以終止酶反應(yīng)，然后離心，取上清液作為酶解液。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)的脫鹽、超濾和層析的具體過(guò)程為: 脫鹽:將得到的酶解液制成濃度為15mg/mL~20mg/mL溶液，加入到大孔樹(shù)脂層析柱進(jìn)行脫鹽，然后用質(zhì)量濃度60-80%乙醇進(jìn)行解析，除去乙醇，濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，得脫鹽酶解物干粉； 超濾:將脫鹽酶解物干粉溶于ΡΗ6.8^7.2磷酸鹽緩沖液配成8~12mg/mL的溶液，于0.1MPa^0.15MPa的工作壓力和20°C~30°C的工作溫度下采用超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于IkDa部分，得超濾酶解液； 層析:將超濾酶解液用PH6.8^7.2磷酸鹽緩沖液配成8~12mg/mL的溶液，經(jīng)過(guò)DEAE-52纖維素陰離子交換樹(shù)脂分離，用水、0.09~0.1lmol/L、0.45~0.55mol/L和0.9~1.lmol/LNaCl溶液進(jìn)行洗脫，收集0.45、.55mol/L NaCl的洗脫組分，得離子交換酶解液；將離子交換酶解液用PH6.8^7.2磷酸鹽緩沖液配成8~12mg/mL的溶液，經(jīng)過(guò)凝膠柱層析分離，用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，收集所得的最高活性組，即凝膠制備酶解物；將凝膠制備酶解物用PH6.8^7.2磷酸鹽緩沖液配成0.9^1.lmg/mL的溶液，利用反相高效液相色譜進(jìn)行純化，根據(jù)抗氧化活性得2個(gè)高活性抗氧化肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述大孔樹(shù)脂為DlOl。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述凝膠柱層析分離中采用的凝膠為葡聚糖凝膠G-25 ;所述反相高效液相色譜的條件為:色譜柱為Zorbax C18，進(jìn)樣量19~21 μ g;流動(dòng)相:A水，含質(zhì)量濃度0.09~0.11%三氟乙酸，B乙腈，含質(zhì)量濃度0.09~0.11%三氟乙酸；梯度洗脫:0-10min:100%A ；10-50min:0-100%B ;洗脫速度 0.9~1.lml/min ;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟I)的鯊魚(yú)醇溶蛋白的提取方法，包括以下步驟: O鯊魚(yú)的魚(yú)肉按lg:20mL~lg:30mL固液比加入質(zhì)量濃度85%~95%的乙醇溶液，然后勻漿，在30°C~50°C溫度下動(dòng)態(tài)提取80mirTl20min ； 2)將提取液的pH值用NaOH調(diào)至8.5^10.0,用蒸餾水將乙醇濃度調(diào)至質(zhì)量濃度55%~65%，稀釋后的提取液在 25°C 下放置 30mirT40min，于 400(T5000rpm 離心 20mirT30min，收集上清液； 3)上清液中加入NaCl至質(zhì)量濃度為5%~8%，鹽析10tTl5h后，于400(T5000rpm離心IOmin~20min,收集沉淀； 4)沉淀用乙醚脫脂20h~30h,然后于10000~12000rpm離心IOmin~15min將乙醚去除、凍干，即得醇溶蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于所述鯊魚(yú)為路氏雙髻鯊。
10.一種權(quán)利要求1所述的抗氧化肽的應(yīng)用，其特征在于Trp-Asp-Arg或/和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys對(duì)羥基自由基、ABTS自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用，而對(duì)DPPH自由基顯示出中等的清除活性；同時(shí)，Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys亦顯示出良好的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制作用和對(duì)β_胡蘿卜素亞油酸體系中產(chǎn)生的過(guò)氧化氫自由基的良好清除作用；Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys具有安全無(wú)毒副作用、抗氧化活性強(qiáng)和易于消化吸收優(yōu)點(diǎn)，`可以作為藥品、保健食品或者食品添加劑上應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K5/097GK103524597SQ201210230801
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2012年7月3日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月3日
【發(fā)明者】王斌, 羅紅宇, 李忠瑞, 栗麗 申請(qǐng)人:浙江海洋學(xué)院