本發(fā)明屬于輔助生殖領(lǐng)域，涉及一種胚胎分泌型內(nèi)源性多肽pdbcm及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

常規(guī)體外受精-胚胎移植技術(shù)經(jīng)過30多年的發(fā)展和改善，從技術(shù)上解決了不孕不育等長(zhǎng)期困惑的醫(yī)學(xué)難題，然而體外受精-胚胎移植常規(guī)治療中，為了保證一定的臨床妊娠率，實(shí)行2-3枚卵裂期胚胎移植已是慣例。因此，近30年來(lái)人群總體雙胎妊娠率增加了50％-70％，三胎妊娠率增加了400％，而多胎妊娠已嚴(yán)重威脅了母嬰安全，近年來(lái)母體妊娠期并發(fā)癥上升了3-7倍，新生兒死亡率及發(fā)病率上升了4-10倍，大大增加患者及社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此提高ivf臨床妊娠率的同時(shí)又能避免多胎妊娠的問題一直是世界各國(guó)輔助生殖工作者共同面臨的挑戰(zhàn)。

多年研究表明，規(guī)避多胎妊娠風(fēng)險(xiǎn)又能保證臨床妊娠率最公認(rèn)有效的方法就是實(shí)行單囊胚移植。然而由于目前的囊胚培養(yǎng)體系仍不能完全模擬母體生殖道微環(huán)境，造成體外培養(yǎng)胚胎質(zhì)量及發(fā)育潛能降低，胚胎發(fā)育相對(duì)滯后。經(jīng)過多年的發(fā)展，目前人囊胚形成率僅約50％左右，如果全部實(shí)行囊胚培養(yǎng)有2％-40％的患者會(huì)因胚胎沒有發(fā)育到囊胚而取消移植。因此，目前單囊胚移植策略尚未能被大多數(shù)生殖中心所采納，改進(jìn)胚胎體外培養(yǎng)體系提高囊胚形成率和改善囊胚質(zhì)量對(duì)單囊胚移植的普遍開展具有重要的推動(dòng)作用。而在胚胎體外培養(yǎng)系統(tǒng)中，胚胎培養(yǎng)基是其中最重要的組成部分，培養(yǎng)基的成分對(duì)胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育具有關(guān)鍵的作用。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，種植前胚胎可以分泌一些細(xì)胞因子樣物質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為這些分泌因子對(duì)胚胎發(fā)育的明顯促進(jìn)作用主要出現(xiàn)在囊胚形成階段。已知，分泌型acrogranin促進(jìn)囊胚腔的形成與擴(kuò)張；細(xì)胞因子tgf-α和egf能通過自分泌和旁分泌作用促進(jìn)囊胚腔的擴(kuò)張膨大；而在小鼠胚胎培養(yǎng)基中加入外源性tgf-β1可有效提高囊胚形成率、囊胚孵出率和胚胎種植率。盡管近年來(lái)，人們通過已發(fā)現(xiàn)的一些分泌因子不斷改善胚胎培養(yǎng)基，取得了一定的進(jìn)展，但是提高囊胚形成率和改善囊胚質(zhì)量的效果并不能令人滿意。因此尋找并鑒定更簡(jiǎn)單、有效的新型胚胎分泌分子改進(jìn)囊胚培養(yǎng)基，以提高囊胚形成率、改善囊胚質(zhì)量是輔助生殖研究者一直追求的目標(biāo)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種胚胎分泌型內(nèi)源性多肽pdbcm。

本發(fā)明的另一目的是提供該多肽的應(yīng)用。

本發(fā)明的又一目的是提供一種含有該多肽的囊胚培養(yǎng)基。

一種胚胎分泌型內(nèi)源性多肽pdbcm，氨基酸序列如seqidno.1所示。

本發(fā)明所述的胚胎分泌型內(nèi)源性多肽pdbcm在制備促進(jìn)囊胚形成和/或提高囊胚質(zhì)量的藥物或試劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的胚胎分泌型內(nèi)源性多肽pdbcm在制備體外受精-胚胎移植過程中囊胚培養(yǎng)液中的應(yīng)用。

一種囊胚培養(yǎng)液，其特征在于含有所述的胚胎分泌型內(nèi)源性多肽pdbcm。

本發(fā)明所述的胚胎分泌型內(nèi)源性多肽pdbcm在制備體外受精-胚胎移植過程中囊胚質(zhì)量檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。

一種囊胚質(zhì)量檢測(cè)試劑，其特征在于含有所述的胚胎分泌型內(nèi)源性多肽pdbcm。

有益效果：

胚胎分泌型內(nèi)源性多肽pdbcm(lgpsvgfdtlrgilisq)，為herc2來(lái)源肽，由17個(gè)氨基酸組成，目前尚無(wú)其相關(guān)功能報(bào)道。生物信息學(xué)分析及實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:①pdbcm來(lái)源于herc2蛋白c端的4378-4394位氨基酸，該區(qū)域同樣存在于鼠、牛、豬等herc2蛋白上，所以pdbcm的序列在哺乳動(dòng)物中高度保守。我們?cè)谛∈竽遗吲囵B(yǎng)液中同樣也檢測(cè)到該肽段的存在；②protparam在線分析發(fā)現(xiàn)，pdbcm的不穩(wěn)定系數(shù)(instabilityindex)為38.16，屬于穩(wěn)定型多肽，可穩(wěn)定存在；脂肪系數(shù)(aliphaticindex)為131.76，平均親疏水性(grandaverageofhydropathicity)為0.635，表現(xiàn)為疏水親脂性，容易通過擴(kuò)散或胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；③fitc標(biāo)記的pdbcm加入合子和2細(xì)胞胚胎培養(yǎng)液中，2小時(shí)后通過激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)熒光分布于合子和2細(xì)胞透明帶內(nèi)細(xì)胞膜表面，表明pdbcm能夠穿過胚胎透明帶發(fā)揮功能。

小鼠胚胎培養(yǎng)液中加入pdbcm，有促進(jìn)囊胚形成的生物學(xué)功能；pulldown實(shí)驗(yàn)證實(shí)pdbcm與birc6相結(jié)合；birc6是一種凋亡抑制蛋白，在牛胚胎中通過調(diào)節(jié)凋亡蛋白降解而促進(jìn)囊胚形成；pdbcm處理后的小鼠囊胚中birc6表達(dá)增加、而凋亡蛋白smac和caspase-9表達(dá)降低用，從而促進(jìn)囊胚形成。因此，pdbcm可以在制備促進(jìn)囊胚形成和/或提高囊胚質(zhì)量的藥物、制備囊胚培養(yǎng)液中應(yīng)用。

借助pdbcm多肽標(biāo)準(zhǔn)品，我們比較了優(yōu)質(zhì)囊胚的培養(yǎng)液與非優(yōu)質(zhì)囊胚的培養(yǎng)液中pdbcm的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pdbcm在優(yōu)質(zhì)囊胚培養(yǎng)液中含量顯著高于非優(yōu)質(zhì)囊胚，可見，pdbcm可在制備體外受精-胚胎移植過程中囊胚質(zhì)量檢測(cè)試劑中應(yīng)用。

說(shuō)明書附圖

圖1、胚胎培養(yǎng)液中囊胚形成相關(guān)分泌型內(nèi)源性多肽的基本特征。

a：內(nèi)源性多肽的大小分布；b：內(nèi)源性多肽的等電點(diǎn)分布；c：內(nèi)源性多肽的氨基酸數(shù)目分布。

圖2、差異多肽前體蛋白的功能分析

圖3、6條多肽對(duì)小鼠囊胚形成的影響(*p<0.05；**p<0.01vscontrol)

圖4、pdbcm多肽在優(yōu)質(zhì)囊胚培養(yǎng)液和非優(yōu)質(zhì)囊胚培養(yǎng)液中的含量比較(*p<0.05)。

a:pdbcm多肽的質(zhì)譜圖；b:pdbcm多肽在高評(píng)分囊胚中含量明顯高于低評(píng)分囊胚。

圖5、fitc標(biāo)記的pdbcm加入胚胎培養(yǎng)液后在小鼠合子和2細(xì)胞胚胎上的分布(bar＝20μm)

圖6、pdbcm對(duì)小鼠囊胚形成的影響。

a:pdbcm處理后促進(jìn)小鼠囊胚形成(將2細(xì)胞小鼠胚胎放在單個(gè)液滴中進(jìn)行培養(yǎng)，拍照時(shí)放到一個(gè)液滴進(jìn)行拍照；)b:與對(duì)照組相比，pdbcm處理后形成的囊胚中birc6表達(dá)升高，而caspase9和smac的表達(dá)降低。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1.1人囊胚培養(yǎng)液中與囊胚形成相關(guān)的分泌型內(nèi)源性多肽的篩選

為了避免胚胎間的相互干擾，我們對(duì)人卵裂期胚胎進(jìn)行單胚胎培養(yǎng)，根據(jù)囊胚形成的結(jié)局分別收集胚胎培養(yǎng)液(分為形成囊胚組和未形成囊胚組)，對(duì)形成囊胚的胚胎培養(yǎng)液與未形成囊胚的胚胎培養(yǎng)液進(jìn)行多肽組學(xué)分析。質(zhì)譜分析結(jié)果共計(jì)鑒定多肽3228條，其中差異顯著的有201條(t-test，p<0.05)。分析發(fā)現(xiàn)，這些多肽主要由5-21個(gè)氨基酸組成，分子大小在500-2500da間，pi位于3-10(圖1)。

1.2差異多肽的蛋白前體功能分析

鑒于細(xì)胞內(nèi)源性多肽主要來(lái)源于胞內(nèi)蛋白酶體途徑對(duì)蛋白前體的降解，因此采用ipa軟件，對(duì)差異多肽的蛋白前體進(jìn)行功能分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些蛋白前體的功能涉及細(xì)胞黏附、細(xì)胞成形、脂質(zhì)代謝、糖代謝、蛋白水解等，與胚胎發(fā)育和植入密切相關(guān)(圖2)。

實(shí)施例2多肽pdbcm對(duì)小鼠植入前胚胎發(fā)育的影響

采用化學(xué)合成法合成herc2來(lái)源肽即pdbcm，氨基酸序列如seqidno.1所示，對(duì)小鼠受精卵進(jìn)行單胚胎培養(yǎng)，在胚胎培養(yǎng)液(ksom)中加入不同濃度(2μg/ml、20μg/ml)的pdbcm多肽刺激：取6-8周icr小鼠，注射pmsg，48h后注射hcg，16h后取材；在顯微鏡下于輸卵管壺腹部取得卵團(tuán)透明質(zhì)酸酶消化顆粒細(xì)胞，在體外操作液m2中清洗裸卵，放置事先于37度，5％co2中平衡好的ksom培養(yǎng)液中，發(fā)育至二細(xì)胞。次日上午，將二細(xì)胞加入到添加有不同濃度pdbcm的ksom培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚。觀察其對(duì)小鼠囊胚形成率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多肽pdbcm可顯著提高小鼠囊胚形成率，并且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性(圖3)。

實(shí)施例3多肽pdbcm在優(yōu)質(zhì)囊胚培養(yǎng)液中與非優(yōu)質(zhì)囊胚培養(yǎng)液中的含量比較

借助pdbcm多肽標(biāo)準(zhǔn)品，我們通過質(zhì)譜比較了優(yōu)質(zhì)囊胚的培養(yǎng)液與非優(yōu)質(zhì)囊胚的培養(yǎng)液中pdbcm的含量，結(jié)果見圖4，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pdbcm在優(yōu)質(zhì)囊胚培養(yǎng)液中含量顯著高于非優(yōu)質(zhì)囊胚(囊胚評(píng)分使用gamder囊胚分級(jí)法，第五天囊胚3bb以上級(jí)別的囊胚為優(yōu)質(zhì)囊胚，3bb以下級(jí)別的囊胚為非優(yōu)質(zhì)囊胚)。

實(shí)施例4fitc標(biāo)記的pdbcm加入胚胎培養(yǎng)液后在小鼠合子和2細(xì)胞胚胎上的分布

采用化學(xué)合成法合成pdbcm的fitc熒光標(biāo)記肽段，添加到ksom培養(yǎng)液中(20μg/ml)，將正常發(fā)育的合子、二細(xì)胞加入培養(yǎng)液中，培養(yǎng)2h后，收集合子與二細(xì)胞。2％pfa固定樣本細(xì)胞20min，washingbuffer清洗后，透膜15min，hoechst(1:1000)染細(xì)胞核1min。dabco封片，2小時(shí)后通過激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)熒光分布于透明帶內(nèi)細(xì)胞膜表面(圖5)。

實(shí)施例5

將添加到不同濃度組中發(fā)育至d5天的囊胚進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)囊胚形成率，結(jié)果見圖6a，發(fā)現(xiàn)2細(xì)胞胚胎培養(yǎng)液中加入pdbcm進(jìn)行單胚胎培養(yǎng)后，小鼠囊胚形成率升高；并且，收集囊胚提取蛋白，通過westenblot方法發(fā)現(xiàn)birc6在pdbcm添加組中表達(dá)明顯升高，而凋亡蛋白caspas－9和smac明顯降低(圖6b)。

<110>南京市婦幼保健院

<120>一種胚胎分泌型內(nèi)源性多肽pdbcm及其應(yīng)用

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<223>胚胎分泌型內(nèi)源性多肽pdbcm

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