本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種水稻孕穗期耐冷性相關蛋白ctb4a及編碼基因與應用。

背景技術：

非生物逆境是影響植物正常生長發(fā)育，限制著作物產量提高的主要脅迫因子之一。水稻是喜溫植物，低溫影響水稻高產、穩(wěn)產、品質以及水稻復種面積的擴大。水稻低溫冷害，通常指水稻遭遇連續(xù)或短期低溫最低臨界溫度以下的低溫影響，使作物生育延遲，甚至發(fā)生生理障礙，嚴重時還造成營養(yǎng)或生殖器官遭到破壞，從而導致水稻不能正常發(fā)育而造成減產。

按照冷害發(fā)生的時期，水稻冷害一般分為芽期冷害、苗期冷害、孕穗期冷害。水稻的花穗是低溫的敏感部位，其中花藥是直接感受低溫影響結實的器官，孕穗期遭遇低溫，會引起花粉敗育，結實率降低，并會導致出穗延遲，器官發(fā)育發(fā)生異常，穗長變短，枝梗及穎花退化，最終影響水稻的產量。

因此，孕穗期冷害是影響水稻產量最嚴重的時期，對水稻孕穗期耐冷性研究具有十分重要的意義。但是利用傳統(tǒng)育種方法培育耐冷水稻品種周期長，進展比較緩慢，而利用基因工程技術可以直接在基因水平上改造植物的遺傳背景，定向改造植物的遺傳性狀。發(fā)掘水稻孕穗期耐冷基因對培育耐冷水稻新品種具有十分重要的理論和實踐意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供一種水稻孕穗期耐冷性相關蛋白ctb4a及編碼基因。

本發(fā)明提供的蛋白，命名ctb4a，是如下1)或2)：

1)序列表中序列2所示的蛋白質；

2)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白質。

上述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

編碼上述蛋白質的dna分子也是本發(fā)明保護的范圍。

上述dna分子是如下1)-4)中任一種的dna分子：

1)編碼區(qū)為序列表中序列3所示的dna分子；

2)編碼區(qū)為序列表中序列1所示的dna分子；

3)在嚴格條件下與1)或2)限定的dna序列雜交且編碼具有相同功能蛋白質的 dna分子；

4)與1)或2)限定的dna序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且編碼具有相同功能蛋白質的dna分子。

序列1是cdna,序列3是基因組。

上述嚴格條件可為在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下雜交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。

含有上述dna分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也是本發(fā)明保護的范圍。

上述重組載體為序列表序列3所示ctb4a基因的基因組dna取代表達載體pmdc32上asci和paci酶切位點間的片段，得到重組載體35s::ctb4a(即為ctb4a過表達重組載體)。

擴增上述dna分子全長或其任意片段的引物對也是本發(fā)明保護的范圍。

上述蛋白、上述dna分子或上述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在調控植物抗逆性中的應用也是本發(fā)明保護的范圍；

或上述蛋白、上述dna分子或上述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在培育抗逆性提高轉基因植物中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。

上述應用中，所述抗逆性為抗低溫；所述低溫具體為15-18℃；

所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；

所述單子葉植物具體為水稻。

本發(fā)明另一個目的是提供一種培育抗逆性提高轉基因植物的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：為將編碼上述蛋白的dna分子導入目的植物，獲得轉基因植物，所述轉基因植物的抗逆性高于所述目的植物。

上述方法中，所述抗逆性為抗低溫。

上述方法中，所述轉基因植物的抗逆性高于所述目的植物體現(xiàn)在孕穗期低溫脅迫下所述轉基因植物的結實率高于所述目的植物；

所述低溫具體為15-18℃；

所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；

所述單子葉植物具體為水稻。

本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明克隆了一個新的正向調控水稻孕穗期耐冷基因ctb4a，將其轉入野生型水稻中，表現(xiàn)出孕穗期耐冷，為水稻的耐冷品種選育提供基因資源。

附圖說明

圖1為親本kmxbg、towada及近等基因系nil1913在北京(正常溫度)和云南(生 育期低溫)的表型圖。

圖2為親本kmxbg、towada及近等基因系nil1913在北京(正常溫度)和云南(生育期低溫)的結實率統(tǒng)計圖。

圖3為ctb4a在親本kmxbg和towada不同組織中的表達模式分析圖，內參為osactin1基因。stem為莖，leaf為葉片，sheath為葉鞘，root為根，yp1為1cm穗，yp3為3cm穗，yp5為5cm穗，yp10為10cm穗，yp15為15cm穗，yp20為20cm穗。

圖4為ctb4a在親本kmxbg和towada穗部冷誘導下表達模式分析圖，內參為osactin1基因。

圖5為ctb4a過表達載體構建示意圖。

圖6為pcr鑒定t0代ctb4a過表達植株。

圖7為ctb4a過表達植株不同轉基因株系實時熒光定量pcr檢測結果。

圖8為不同的冷處理方式表示圖。

圖9為ctb4a過表達植株孕穗期冷處理后穗部表型圖。

圖10為ctb4a過表達植株及對照植株孕穗期冷水灌溉處理后結實率統(tǒng)計圖。

圖11為ctb4a過表達植株及對照植株孕穗期人工氣候室冷處理后結實率統(tǒng)計圖。

圖12為ctb4a過表達植株及對照植株高海拔地區(qū)種植結實率統(tǒng)計圖。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

水稻品種kmxbg：文獻：戴陸園等.云南稻種昆明小白谷耐冷性指標性狀的遺傳分析.中國水稻科學,1999,13(2):73-76.公眾可從中國農業(yè)大學獲得。

水稻品種towada：文獻：戴陸園等.云南稻種昆明小白谷耐冷性指標性狀的遺傳分析.中國水稻科學,1999,13(2):73-76.公眾可從中國農業(yè)大學獲得。

水稻近等基因系nil1913：本實驗室構建和保存，公眾可從中國農業(yè)大學獲得。

過表達載體pmdc32：文獻:markd.curtisandueligrossniklaus.agatewaycloningvectorsetforhigh-throughput.plantphysiology,october2003,vol.133,pp.462–469.公眾可從中國農業(yè)大學獲得。

根癌農桿菌eha105：文獻：高世武等.影響根癌農桿菌eha105感受態(tài)細胞轉化效率因素的研究.熱帶生物學報.2012年3月第3卷第1期，公眾可從中國農業(yè)大學獲得。

實施例1、ctb4a基因的定位及克隆

1、ctb4a基因的獲得

利用耐冷品種kmxbg和冷敏感品種towada構建的分離群體，考察各個單株在昆明和阿子營的結實率，作為qtl定位的表型數(shù)據(jù)(圖1，圖2)。同時，運用bsa法從均 勻分布在水稻12條染色體上的1513對ssr標記中篩選出的多態(tài)性標記，標記帶型與kmxbg一致，記為a，與towada一致，記為b，雜合記為h。利用mapmaker3.0進行標記連鎖作圖，group命令分組，kosambi方法計算遺傳距離。qtl掃描采用qtlicimapping3.0(王建康等，2009)，以lod值3.0作為qtl存在的閾值，同時計算加性和顯性效應。qtl的命名原則采用mccouch等命名方法。最終在兩個環(huán)境中均能檢測到微效qtlqctb4-1，該qtl位于rm518-rm6770之間，兩個環(huán)境中的lod值分別為14.81和4.15，解釋表型的貢獻率分別為0.9％和3.93％。然后利用qctb4-1兩側標記rm2146和rm6770對3102個單株bc6f2群體篩選，獲得6個純合重組單株，并且利用f3家系進行表型確定。最終將目的基因定位在標記rm16349和sts12之間，物理距離為134.8kb。該區(qū)間內共有4個候選基因，其中基因os04g0132500編碼一個亮氨酸重復的跨膜蛋白激酶。該基因啟動子及編碼區(qū)序列在親本kmxbg和towada中均存在多處差異，是最有可能的候選基因，命名為ctb4a。

ctb4a基因的核苷酸序列為序列表中序列1，開放閱讀框為序列1第1-3447位核苷酸，其編碼的蛋白為ctb4a，該蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。

2、內源ctb4a基因的表達模式

正常處理：取kmxbg和towada正常種植條件下不同組織的樣品，包括根、莖、葉片、葉鞘、1cm穗、3cm穗、5cm穗、10cm穗、15cm穗和20cm穗。取樣后用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

低溫脅迫處理：將正常條件下生長至孕穗期的kmxbg和towada移栽至18度的人工氣候室內，分別取處理1h、2h、4h、8h、12h、16h、24h、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d時葉片和穗部樣品，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

提取上述各種處理的樣品取總rna，利用反轉錄酶m-mlv反轉錄合成cdna第一鏈，以該cdna第一鏈為模板，采用引物進行實時定量分析，以osactin1為內參基因；

ctb4a擴增引物：

ctb4a-rt1f:5-cgccggatcatatggctacatc-3

ctb4a-rt1r:5-cacgtcgctcttctccgtta-3

osactin1擴增引物：

actin1-f:5-acaggtattgtgttggactctgg-3

actin1-r:5-agtaaccacgctccgtcagg-3

實時熒光定量pcr在實時熒光定量pcr儀appliedbiosystems7500realtimepcrsystem(abi,usa)上進行，一次平行試驗設3次重復。利用livakkj和schmittgentd(2001)報道的方法，即2-δδct計算相對表達量。

δδct＝(ct.target－ct.actin)timex－(ct.target－ct.actin)time0

timex表示任意時間點，time0表示經actin1校正后1倍量的目標基因表達。

ctb4a組織表達模式如圖3，可以看出，ctb4a基因是一個在不同組織中均表達的基因，尤其在莖、葉鞘和穗中表達豐度最高。

ctb4a冷誘導表達分析如圖4，可以看出，在耐冷親本kmxbg中被低溫誘導的強度要顯著高于冷敏感親本towada，說明ctb4a基因是一個與低溫脅迫相關的基因。

實施例2、ctb4a基因的功能驗證

一、ctb4a過表達重組載體的構建

提取水稻kmxbg的基因組dna為模板，用cb1f和cb1r進行pcr擴增，得到4676bp的pcr產物，經過測序，該pcr產物為ctb4a基因的基因組dna，為序列表序列3所示。

cb1f:gcaactagtctcccattgtcagtgcca(限制性內切酶asci)

cb1r:ccttaattaattcacaacaaactcgcatca(限制性內切酶paci)。

將上述序列表序列3所示ctb4a基因的基因組dna取代表達載體pmdc32上asci和paci酶切位點間的片段，得到重組載體35s::ctb4a(即為ctb4a過表達重組載體，結構示意圖如圖5)，其中ctb4a基因插入雙煙草花葉病毒啟動子35s下游。

二、轉ctb4a水稻的獲得

1、重組菌

將上述一制備的重組載體35s::ctb4a凍融法轉化根癌農桿菌eha105，得到重組菌eha105/35s::ctb4a，用于侵染轉基因受體品種的愈傷。

2、轉ctb4a水稻

采取經典的農桿菌介導的愈傷侵染方法，具體步驟如下：

(1)胚性愈傷的獲得：將成熟的towada種子(以下也稱為野生型水稻)去殼后用75％酒精消毒2min，再用20％naclo消毒40min，無菌水漂洗3-5次，風干。接種于誘導培養(yǎng)基，28℃暗培養(yǎng)2周，將胚性愈傷剝下，繼代至新的誘導培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)2周(繼代兩次)。

(2)制備侵染液：吸取保存的農桿菌液20μl，涂布到y(tǒng)ep(含20mg/l利福平和相應抗生素)固體培養(yǎng)基上，28℃倒置暗培養(yǎng)2d，刮取少量農桿菌至aam液體培養(yǎng)基中(含10mm乙酰丁香酮)，菌液濃度od600約為0.3。

(3)共培養(yǎng)：挑選自然分散、顏色鮮黃、直徑約為3～5mm的顆粒狀愈傷組織至三角瓶中，加入制備好的侵染液，侵染10min，用無菌濾紙吸取多余的侵染液，置于鋪有一層濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，19℃共培養(yǎng)2-3d。

(4)抗性愈傷組織的篩選：將共培養(yǎng)后的愈傷組織取出，用無菌水快速搖動清洗5～6次，再用含250mg/l頭孢霉素和250mg/l羧芐青霉素的無菌水清洗20min，最 后置于無菌濾紙上瀝干3h。然后移到篩選培養(yǎng)基上。兩周一次，篩選兩次。

(5)分化：將篩選獲得的抗性愈傷組織接入預分化培養(yǎng)基中，26℃，暗培養(yǎng)2周，然后轉移至分化培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)2-3周，得到再生轉基因幼苗植株。

(6)將幼苗移至生根培養(yǎng)基上，待幼苗生根長成后，移出培養(yǎng)瓶，洗凈根上的培養(yǎng)基，煉苗7d，移至大田栽種，直至成熟，得到t0代轉ctb4a水稻。

上述轉基因過程中所用培養(yǎng)基配方如下：

(1)胚性愈傷誘導及繼代培養(yǎng)基：nb基本培養(yǎng)基(含2mg/l2,4-d)。

(2)共培養(yǎng)培養(yǎng)基：nb基本培養(yǎng)基(含2mg/l2,4-d，10g/l葡萄糖，10mm乙酰丁香酮,ph5.6)。

(3)篩選培養(yǎng)基：nb基本培養(yǎng)基(含2mg/l2,4-d，400mg/l特美汀和50mg/l潮霉素，ph5.8)。

(4)預分化培養(yǎng)基：nb基本培養(yǎng)基(含1mg/l6-ba，2mg/lnaa，5mg/laba，50mg/l潮霉素，ph5.8)。

(5)分化培養(yǎng)基：nb基本培養(yǎng)基(含2mg/l6-ba，1mg/lnaa，1mg/lkt，50mg/l潮霉素，ph5.8)。

(6)生根培養(yǎng)基：1/2ms培養(yǎng)基基本成分(含0.5mg/lnaa,0.25mg/l多效唑，ph5.8)。

(7)nb培養(yǎng)基基本成分包括n6大量元素，b5微量元素，b5有機成分，150mg/l肌醇，300mg/l水解酪蛋白，500mg/l谷氨酰胺，600mg/l脯氨酸，30g/l蔗糖，3g/l植物凝膠。

采用同樣的方法將空載體pmdc32轉入野生型水稻中，得到t3代轉pmdc32水稻。

3、分子鑒定

提取t0代轉ctb4a水稻基因組dna，用引物為5′-aaaagttcgacagcgtctccgacc-3′和5′-tctacacagccatcggtccagacg-3′進行pcr擴增，得到919bp的pcr產物(靶基因為hyg)為陽性t0代轉ctb4a水稻，不含有目的片段的植株為陰性，部分陽性樣本的鑒定結果如圖6所示(t-1、t-3、t-5、t-6、t-9、t-12)。

陽性t0代收種、播種，得到t3代。

提取t3代轉ctb4a水稻株系t-1、t-5、t-9、t-12的rna，反轉錄得到cdna，以ctb4a擴增引物進行擴增，以osactin1為內參基因。

ctb4a擴增引物：

ctb4a-rt2f:tccgcaacctcaccaagc

ctb4a-rt2r:cgagccggtttcctcctag

osactin1擴增引物：

actin1-f:5-acaggtattgtgttggactctgg-3

actin1-r:5-agtaaccacgctccgtcagg-3

結果如圖7所示，可以看出，與野生型水稻(towada)相比，t-1、t-5、t-9、t-12株系中ctb4a基因表達量均提高5倍以上。

采用同樣的方法鑒定t3代轉pmdc32水稻，結果與野生型水稻無顯著差異。

后續(xù)選用表達較高的t3代轉ctb4a水稻株系t-1和t-12進行進行耐冷鑒定實驗。

三、轉ctb4a水稻的耐冷性鑒定

耐冷性鑒定采用三種方法，分別是孕穗期大田50cm深冷水池(18℃)7天，孕穗期人工氣候室18℃處理7天和云南自然鑒定等方法多方驗證ctb4a的孕穗期耐冷功能(圖8)。

選取nil1913、野生型水稻(冷敏感品種towada)、t3代轉ctb4a水稻株系t-1、t3代轉ctb4a水稻株系t-12、t3代轉pmdc32水稻正處于孕穗期的主穗掛牌，做上記號。脅迫結束后，將參試材料復種到大田，恢復水稻生長，成熟后考察掛牌主穗的結實率，以正常生長的植株結實率為對照，計算相對結實率(相對結實率＝處理后的結實率/正常條件下結實率*100％)，作為耐冷性鑒定指標。云南自然鑒定則在云南黑龍?zhí)兜貐^(qū)，海拔1916米，常年氣溫19-22℃，從播種至孕穗期均處在自然低溫狀態(tài)下生長，成熟后考察主穗結實率。上述每個材料設置3個重復，每個重復10株。

孕穗期大田50cm深冷水池(18℃)7天結果如圖9和10所示，可以看出，在大田冷水灌溉7天的脅迫下，在孕穗期處理的參試材料的農藝性狀發(fā)生顯著變化，t3代轉ctb4a水稻株系t-1、t3代轉ctb4a水稻株系t-12的生長顯著好于野生型水稻；統(tǒng)計結實率如圖10所示，towada的相對結實率為50.40％，而nil1913的相對結實率為77.72％，t-1和t-12的相對結實率為77.08％和87.27％,均顯著高于towada。

孕穗期人工氣候室18℃處理7天結果如圖11所示，towada的相對結實率為55.40％，nil1913的相對結實率為85.47％，t-1和t-12的相對結實率為73.80％和85.42％，也是顯著高于towada。

在云南全生育期的自然低溫處理下結果如圖12所示，ni1913l與過表達株系的結實率均顯著超過towada。

t3代轉pmdc32水稻結果與野生型水稻無顯著差異。

上述結果表明，孕穗期遭遇低溫主要影響了結實率的高低，不同地點、不同方式處理方式下，nil1913和過表達株系的主穗結實率都顯著高于冷敏感親本towada，說明基因cbt4a具有孕穗期耐低溫的功能，是一個起正向長效作用的基因，能夠在低溫脅迫下降低低溫對結實率的影響。