本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2009年3月24日的pct國際專利申請(qǐng)pct/tb2009/005114進(jìn)入中國國家階段的中國專利申請(qǐng)?zhí)?00980110215.6、發(fā)明名稱為“用于治療變態(tài)反應(yīng)的主要1類和2類螨變應(yīng)原的低變應(yīng)原性雜合蛋白”的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及生產(chǎn)用于預(yù)防和治療變態(tài)反應(yīng)，特別地由屋塵螨導(dǎo)致的變態(tài)反應(yīng)，和更特別地由塵螨屬(genusdermatophagoides)的螨引起的變態(tài)反應(yīng)和更具體地由于對(duì)1類和2類變應(yīng)原致敏而引起的變態(tài)反應(yīng)的雜合蛋白的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：：變態(tài)反應(yīng)是對(duì)異物反應(yīng)的能力的特異性遺傳性或獲得性障礙，所述異物通常是有害的(變應(yīng)原)。變態(tài)反應(yīng)與受累器官(皮膚，結(jié)膜，鼻，咽，支氣管粘膜，胃腸道)的炎性反應(yīng)有關(guān)。該疾病的即時(shí)癥狀包括鼻炎，結(jié)膜炎，皮炎，哮喘和過敏性休克；而該疾病的慢性表現(xiàn)包括哮喘的遲發(fā)型反應(yīng)和特應(yīng)性皮炎。i型變態(tài)反應(yīng)是發(fā)達(dá)國家中的一個(gè)重要的健康問題。此型變態(tài)反應(yīng)由針對(duì)空氣播散的抗原的ige抗體的形成而導(dǎo)致。這些ige抗體與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞相互作用，釋放生物介質(zhì)諸如組胺，其在發(fā)達(dá)國家25％以上的人群中產(chǎn)生變應(yīng)性鼻炎、結(jié)膜炎和支氣管哮喘。[floistrup,h.,swartz,j.,bergstrom,a.,alm,j.s.,scheynius,a.,vanhage,m.,waser,m.,braun-fahrlander,c.,schram-bijkerk,d.,huber,m.,zutavern,a.,vonmutius,e.,ublagger,e.,riedler,j.,michaels,k.b.,pershagen,g.,theparsifalstudygroup(parsifal研究小組).(2006).allergicdiseaseandsensitizationinsteinerschoolchildren(steiner學(xué)齡兒童中的變應(yīng)性疾病和致敏).jallergyclinimmunol.117,59-66]。目前，對(duì)變態(tài)反應(yīng)僅有的針對(duì)病因的治療方法是變應(yīng)原特異性免疫療法(sit)。sit是由特異性變應(yīng)原導(dǎo)致的變應(yīng)性疾病的有效治療方法，并且基本上包括通過以遞增濃度的產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)的蛋白質(zhì)(變應(yīng)原提取物)規(guī)律地給藥而調(diào)節(jié)患者的免疫應(yīng)答。盡管多個(gè)研究已經(jīng)證明此變應(yīng)原特異性免疫療法的臨床有效性，但其免疫學(xué)機(jī)制沒有完全地闡明。至今已知的是高劑量注射的變應(yīng)原通過抗原呈遞細(xì)胞，例如樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)il-12的合成增加，所述抗原呈遞細(xì)胞優(yōu)先地促進(jìn)天然輔助t細(xì)胞(nth)發(fā)育稱為th1和th0細(xì)胞。這使得與th2細(xì)胞相關(guān)的變應(yīng)性免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)換為th1/th0應(yīng)答，后者誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的ifn-γ[akdis,c.a.和blaser,k.(2000).mechanismsofallergen-specificimmunotherapy(變應(yīng)原特異性免疫療法的機(jī)制).allergy55,522-530]。此免疫轉(zhuǎn)換通過在調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(tr1)的影響下誘導(dǎo)th2記憶細(xì)胞的耐受(克隆無反應(yīng)性或克隆缺失)而被強(qiáng)化，所述調(diào)節(jié)性t細(xì)胞產(chǎn)生免疫抑制性細(xì)胞因子il-10和tgf-β[akdis,c.a.,joss,a.,akdis,m.,和blaser,k.(2001).mechanismofil-10inducedcellinactivationinallergicinflammationandnormalresponsetoallergens(在變應(yīng)性炎癥和對(duì)變應(yīng)原的正常應(yīng)答中il-10誘導(dǎo)的細(xì)胞失活的機(jī)制).int.archallergyimmunol.124；180-182]。th2細(xì)胞的激活和增殖的減少導(dǎo)致b細(xì)胞產(chǎn)生較少的il-4和ige。在鼻和支氣管粘膜中th2細(xì)胞的激活和浸潤減少導(dǎo)致il-5的合成減少，使得嗜酸細(xì)胞的浸潤減少，導(dǎo)致炎性介質(zhì)諸如mbp(主要堿性蛋白)和ecp(嗜酸細(xì)胞陽離子蛋白)的釋放的大量減少。具有優(yōu)勢(shì)表型th0的t細(xì)胞的新變應(yīng)原特異性克隆產(chǎn)生th1和th2細(xì)胞因子的混合物，促進(jìn)b細(xì)胞產(chǎn)生大量的變應(yīng)原特異性igg抗體。另外，高水平的il-10誘導(dǎo)變應(yīng)原特異性igg4抗體的合成增加。這兩種類型的特異性抗體可用作阻斷抗體，阻止錨定在肥大細(xì)胞上的ige結(jié)合受體的交聯(lián)，并且由此抑制脫顆粒和組胺的釋放[moverare,r.(2003).immunologicalmechanismsofspecificimmunotherapywithpollenvaccines:implicationsfordiagnosticsandthedevelopmentofimprovedvaccinationstrategies(使用花粉疫苗的特異性免疫治療的免疫學(xué)機(jī)制：對(duì)診斷學(xué)和開發(fā)改進(jìn)的疫苗接種策略的潛在意義).expertrev.vacc.2,85-97；wachholz,p.a.,soni,n.k.,till,s.,和durham,s.r.(2003).inhibitionofallergen-igebindingtobcellsbyiggantibodiesaftergrasspollenimmunotherapy(在青草花粉免疫治療后igg抗體抑制變應(yīng)原-ige與b細(xì)胞的結(jié)合).j.allergyclin.immunol.112；915-922]。它們還通過抗原呈遞細(xì)胞阻斷ige介導(dǎo)的抗原捕獲，并且這抑制對(duì)變應(yīng)原的免疫反應(yīng)。分離自天然來源的變應(yīng)原提取物是蛋白質(zhì)和其他分子的復(fù)雜混合物。該組成并且因此其變應(yīng)原性取決于使用的材料，其在花粉的情況下根據(jù)環(huán)境條件、在真菌的情況下根據(jù)成熟期、螨的生長條件等而變化。另外，一些提取物可含有不充足濃度的主要變應(yīng)原，它們可被不需要的成分污染，患者對(duì)這些成分不過敏，或兩種問題均可存在。目前的免疫治療使用專門的完全變應(yīng)原提取物，并且此具有一些缺點(diǎn)如：-由于疫苗與錨定在效應(yīng)器細(xì)胞上的ige抗體的反應(yīng)性而導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)。-免疫治療開始后，對(duì)疫苗中存在的其他變應(yīng)原出現(xiàn)新的致敏。-難以標(biāo)準(zhǔn)化地生產(chǎn)一些變應(yīng)原提取物。所有這些均導(dǎo)致免疫治療不是如所期望的那樣安全和有效的治療方法。對(duì)變態(tài)反應(yīng)的發(fā)病機(jī)制和特異性免疫治療的機(jī)制的較好理解已經(jīng)使得能夠?qū)ι厦嫣岬降膯栴}獲得解決方案。對(duì)ige介導(dǎo)抗原的呈遞在變應(yīng)原特異性th2應(yīng)答中的影響的理解已經(jīng)增加了產(chǎn)生不結(jié)合ige的變應(yīng)原的嘗試。此變應(yīng)原將通過基于吞噬作用/胞飲作用的抗原捕獲機(jī)制而針對(duì)t細(xì)胞，避免ige交聯(lián)和ige依賴性抗原的呈遞。這誘導(dǎo)t細(xì)胞產(chǎn)生的th0或th1細(xì)胞因子的平衡，并且誘導(dǎo)b細(xì)胞產(chǎn)生較少的ige和較多的igg；這都將導(dǎo)致誘導(dǎo)th2型t細(xì)胞的耐受，而沒有過敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。獲得變應(yīng)原和變應(yīng)原衍生物的重組技術(shù)的進(jìn)展已經(jīng)促進(jìn)了開發(fā)用于治療變態(tài)反應(yīng)的新型疫苗的能力的極大增加。面對(duì)此領(lǐng)域中那些工作的困難是減少抗原的ige結(jié)合，同時(shí)保留其被t細(xì)胞的識(shí)別。具有較低ige結(jié)合能力但保持其對(duì)t細(xì)胞的反應(yīng)性的變應(yīng)原分子，可以較高的劑量施用，使得能夠進(jìn)行使用較少次注射的更快的和更安全的免疫治療。另外，可在發(fā)酵罐中使用微生物表達(dá)系統(tǒng)大規(guī)模地生產(chǎn)重組變應(yīng)原，并且其純化比其天然等效物更有效。螨屬于節(jié)肢動(dòng)物類群，并且具有小于0.3mm的大?。凰鼈兛梢砸娪诓煌沫h(huán)境中，包括屋塵。自二十世紀(jì)60年代后期它們就已經(jīng)被認(rèn)為是屋塵變態(tài)反應(yīng)的原因。負(fù)責(zé)產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)癥狀的主要螨類包括在無氣門目(orderastigmata)中，并且其分類學(xué)的分布如下：動(dòng)物界節(jié)肢動(dòng)物門蛛形綱蜱蹣亞綱無氣門目·食甜螨科食甜螨亞科無爪螨屬(genusblomia)弗氏無爪螨(b.freemani)b.kulagini熱帶無爪螨(b.tropicalis)食甜螨屬家甜食螨(g.domesticus)嗜鱗螨屬(genuslepidoglyphus)害鱗嗜螨(l.destructor)鉗爪螨亞科(subfamilylabidophorinae)脊足螨屬(genusgohieria)棕脊足螨(g.fusca)·蚍螨科(familypyroglyphidae)塵螨亞科(subfamilydermatophagoidinae)塵螨屬(genusdermatophagoides)伊凡塵螨(d.evansi)粉塵螨(d.farinae)微角塵螨(d.microceras)歐洲塵螨(d.pteronyssinus)絲泊塵螨(d.siboney)新熱帶塵螨(d.neotropicalis)多毛螨屬(genushirstia)舍赫塵螨(h.domicola)馬塵螨屬(genusmalayoglyphus)卡美馬塵螨(m.carmelitus)蚍螨亞科(subfamilypyroglyphinae)歐塵螨屬(genuseuroglyphus)埋內(nèi)歐螨(e.maynei)·粉螨科(familyacaridae)粉螨屬(genusacarus)粗腳粉螨(a.siro)食酪螨屬(genustyrophagus)長食酪螨(t.longior)腐食酪螨(t.putrescentiae)·嗜渣螨科(familychortoglyphidae)嗜渣螨屬(genuschortoglyphus)拱殖嗜渣螨(c.arcuatus)最常產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)的物種是塵螨屬的那些。其最佳生長條件為約20℃的溫度和70％以上的相對(duì)濕度。濕度小于50-60％的環(huán)境很大程度地限制其存在；因此它們?cè)跉夂驕睾偷难睾５貐^(qū)大量存在，并且極少地存在于干燥的多山地帶，特別是海拔1500m以上。因此，在季節(jié)變動(dòng)(春天和秋天)時(shí)有雨和溫和的溫度下在住宅內(nèi)螨濃度也增加，并且通常在夏天(熱，干燥氣候)和冬天(冷，干燥氣候)期間減少。屋塵螨是復(fù)雜的生物體，其產(chǎn)生上千種不同蛋白質(zhì)和其他的大分子。它們是變態(tài)反應(yīng)的最普遍的來源之一，并且已經(jīng)估計(jì)歐洲5000萬人患有變態(tài)反應(yīng)，15％對(duì)螨過敏，估計(jì)大概1000-1500萬人沒有被正確地診斷。其他數(shù)據(jù)表明至多80％的哮喘兒童可能對(duì)螨過敏[deblayf等，influenceofmiteexposureonsymptomsofmite-sensitivepatientswithasthma(螨接觸對(duì)螨過敏的哮喘患者的癥狀的影響).jallergyclinimmunol1994；93:136-138]。迄今為止，已經(jīng)闡明了來自最常見的屋螨——?dú)W洲塵螨和粉塵螨的14種變應(yīng)原，各種在變態(tài)反應(yīng)患者之間具有非常不同的患病率。在國際免疫學(xué)聯(lián)合會(huì)(i.u.i.s.)的變應(yīng)原命名小組委員會(huì)(allergennomenclaturesub-committee)(http://www.allergen.org/allergen.aspx)于2007年7月3日的變應(yīng)原官方列表中所述的歐洲塵螨的變應(yīng)原為：derp1和derp2與80-100％的螨過敏患者反應(yīng)[thomas,w.r.,smith,w-e,hale,b.,mills,k.l.,o′brien,r.m.(2002).characterizationandimmunobiologyofhousedustmiteallergens(屋塵螨變應(yīng)原的表征和免疫生物學(xué)).int.arch.allergyimmunol.129；1-8]并且能夠抑制幾乎所有對(duì)歐洲塵螨全提取物的ige反應(yīng)性[vanderzee,j.s.,vanswieten,p.,cansen,h.m.,aalbersen,r.c.(1988).skintestsandhistaminereleasewithp1-depletedd.pteronyssinusbodyextractsandpurifiedp1(使用p1缺失的歐洲塵螨身體提取物和純化的p1的皮膚試驗(yàn)和組胺釋放).j.allergyclin.immunol.81；884-895；meyer,c.h.,bond,j.f.,chen,m.c.,kasaian,m.t.(1994).comparisonofthelevelsoftheallergensderpiandderpiiinstandardisedextractofthehousedustmited.pteronyssinus(在屋塵螨歐洲塵螨的標(biāo)準(zhǔn)化提取物中變應(yīng)原derpi和derpii的水平的比較).clin.exp.allergy24；1041-1048]。1類變應(yīng)原(derp1)是具有半胱氨酸蛋白酶活性的蛋白質(zhì)，并與木瓜蛋白酶和肌動(dòng)蛋白-半胱氨酸蛋白酶屬于相同的家族。成熟蛋白具有222個(gè)殘基和80個(gè)前蛋白殘基。其在螨的消化道中產(chǎn)生，因此見于糞便中，并且似乎參與食物的消化。其具有3個(gè)二硫橋：c4-c117、c31-c71以及c64-c103并且其三維結(jié)構(gòu)由兩個(gè)球形結(jié)構(gòu)域組成：一個(gè)在氨基端處(殘基21-90)形成，另一個(gè)在羧基端處(殘基131-200)形成。它們通過柔性環(huán)(flexibleloop)(101-131位處)相連[meno,k.,thorsted,p.b.,ipsen,h.,kristensen,o.,larsen,j.n.,spangfort,m.d.,gajhede,m.,lund,k.(2005).thecrystalstructureofrecombinantproderp1,amajorhousedustmiteproteolyticallergen(重組proderp1，一種主要的屋塵螨蛋白水解變應(yīng)原的晶體結(jié)構(gòu)).j.immunol.175,3835-3845]，其中已經(jīng)證明了高的t細(xì)胞刺激活性[kircher,m.f.,haeusler,t.,nickel,r.,lamb,j.r.,renz,h.,beyer,k.(2002).vb18.1andva2.3+t-cellsubsetsareassociatedwithhousedustmiteallergyinhumansubjects(vb18.1和va2.3+t-細(xì)胞亞群與人受試者中的屋塵螨變態(tài)反應(yīng)有關(guān)).j.allergyclin.immunol.109,517-523]。在中性和堿性ph條件下derp1蛋白趨于形成二聚體。b細(xì)胞表位沿整個(gè)分子分布，一些是構(gòu)象表位[dehalleux,s.,stura,e.,vanderelst,l.,carlier,v.,jacquemin,m.,saint-remy,j.m.(2006).three-dimensionalstructureandige-bindingpropertiesofmaturefullyactivederp1,aclinicallyrelevantmajorallergen(成熟的完全活性的derp1，一種臨床上相關(guān)的主要變應(yīng)原的三維結(jié)構(gòu)和ige結(jié)合特性).j.allergyclin.immunol.117,571-576]。2類變應(yīng)原(derp2)含有3個(gè)二硫橋(c8-c119、c21-c27和c73-c78)，并且由兩個(gè)反平行的β折疊組成。derp2的t細(xì)胞表位遍及整個(gè)蛋白中。然而，肽111-129常常被t細(xì)胞識(shí)別[o'brien,r.m.,thomas,w.r.,nicholson,i.,lamb,j.r.,tait,b.d.(1995).animmunogeneticanalysisofthet-cellrecognitionofthemajorhousedustmiteallergenderp2:identificationofhigh-andlow-responderhla-dqallelesandlocalizationoft-cellepitopes(t細(xì)胞識(shí)別主要屋塵螨變應(yīng)原derp2的免疫遺傳分析：高和低應(yīng)答個(gè)體hla-dq等位基因的鑒定和t細(xì)胞表位的定位).immunology.86,176-182]。b細(xì)胞表位似乎是構(gòu)象性的，因?yàn)閕ge結(jié)合高度依賴于三級(jí)結(jié)構(gòu)。變應(yīng)原螨提取物是蛋白質(zhì)和非蛋白分子的復(fù)雜混合物。用于尋找相對(duì)于提取物的組分的特異性ige水平的技術(shù)的不斷應(yīng)用使得能夠證明變應(yīng)性疾病患者通常與各種組分反應(yīng)。有少數(shù)變應(yīng)性疾病患者與單一的變應(yīng)原反應(yīng)。使用全螨提取物的免疫治療研究已經(jīng)證明在用螨提取物進(jìn)行免疫治療期間可發(fā)生危險(xiǎn)的全身不良反應(yīng)[n.,hassanzadeh,a.,y.,h.(2000).localandsystemicreactionsduringimmunotherapywithadsorbedextractsofhousedustmiteinchildren(在兒童中使用屋塵螨的吸附提取物進(jìn)行免疫治療期間的局部和全身反應(yīng))ann.allergyasthmaimmunol.85；317-321]和誘發(fā)新的對(duì)貝類的ige反應(yīng)性[vanree,r.,antonicelli,l.,akkerdaas,j.h.,garritani,m.s.,aalberse,r.c.,bonifazi,f.(1996).possibleinductionoffoodallergyduringmiteimmunotherapy(螨免疫治療期間可能誘發(fā)食物變態(tài)反應(yīng)).allergy51；108–113]。由此顯示目前已知的變應(yīng)原提取物在實(shí)現(xiàn)螨變態(tài)反應(yīng)的最佳治療中具有明顯的缺點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：考慮到上面提到的
背景技術(shù)：
：，本發(fā)明人致力于研究抗變態(tài)反應(yīng)治療的新的有利方式，特別是治療由螨產(chǎn)生的變態(tài)反應(yīng)。作為廣泛研究的結(jié)果，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了治療螨變態(tài)反應(yīng)的新的和有效的方式，該方式基于通過結(jié)合歐洲塵螨的兩種變應(yīng)原(derp1和derp2)的片段形成的新的雜合蛋白，以及獲得它們的各種方法和手段。低變應(yīng)原性雜合蛋白可以具有與單個(gè)天然變應(yīng)原和/或其混合物相比顯著減小的變應(yīng)原性。例如，雜合蛋白可以具有小于60％,優(yōu)選小于50％,更優(yōu)選小于40％,更優(yōu)選還小于20％,最優(yōu)選小于10％或甚至小于2％的單個(gè)天然變應(yīng)原和/或其混合物的ige結(jié)合能力。根據(jù)本發(fā)明的雜合蛋白可以稱作低變應(yīng)原性的，因?yàn)樗鼈兓谙铝芯哂休^低的結(jié)合ige抗體的能力：i)使用來自對(duì)歐洲塵螨過敏的患者的混合血清(serumpool)的體外elisa、elisa-抑制和免疫印跡試驗(yàn)；ii)在對(duì)歐洲塵螨過敏的患者上的體內(nèi)皮膚反應(yīng)性試驗(yàn)；iii)分離自對(duì)歐洲塵螨過敏的患者血液的嗜堿性粒細(xì)胞的離體激活試驗(yàn)以及iv)使用來自對(duì)歐洲塵螨過敏的患者的個(gè)體化血清的體外east試驗(yàn)。此外，根據(jù)本發(fā)明的雜合蛋白：i)保持其免疫原性，如通過使用來自23名對(duì)歐洲塵螨過敏的患者的顯示t細(xì)胞反應(yīng)性的外周血單核細(xì)胞(pbmc)的淋巴細(xì)胞增殖研究證明；ii)實(shí)際上在用該雜合蛋白免疫接種小鼠后具有比野生型蛋白更高的免疫原性；以及iii)具有在小鼠中誘導(dǎo)“阻斷”抗體的能力，即，誘導(dǎo)derp1和derp2-特異性igg，其抑制屋塵螨過敏患者的ige與天然變應(yīng)原的結(jié)合。因此本發(fā)明涉及由變應(yīng)原derp1和derp2的片段組成的雜合蛋白(或嵌合體)(此后稱為qm1和qm2)，其中在derp2的兩個(gè)β折疊的至少一個(gè)中，derp2的c8和c119之間的二硫橋已經(jīng)通過例如，用絲氨酸殘基置換圖2中顯示的成熟天然蛋白的8位和119位處的半胱氨酸殘基之一或兩個(gè)而被破壞，或通過插入附加的氨基酸序列，諸如derp1的片段，例如，成熟蛋白的5-222殘基(即，沒有圖1中顯示的前-區(qū)(pre-region)而被破壞。優(yōu)選地，附加的氨基酸序列在圖2中顯示的derp2成熟天然蛋白序列的73和74殘基之間插入。已經(jīng)減小了變態(tài)反應(yīng)性，然而令人驚奇地是對(duì)其免疫原能力沒有損害。事實(shí)上，在一些試驗(yàn)中雜合蛋白已經(jīng)顯示了增加的免疫原性，另外其可刺激igg抗體的產(chǎn)生。本發(fā)明因此提供了包含與seqidno2或4具有至70％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％、還更優(yōu)選至少95％、或最優(yōu)選100％的序列同源性的氨基酸序列或由其組成的肽序列。所述蛋白質(zhì)可通過任何標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)合成法，例如，化學(xué)合成，半化學(xué)合成，或通過使用表達(dá)系統(tǒng)來產(chǎn)生。因此，本發(fā)明還涉及包含編碼所述嵌合蛋白的dna或由其組成的核苷酸序列，表達(dá)系統(tǒng)例如載體，所述載體包含所述序列，伴有用于表達(dá)和表達(dá)控制的必需序列，并且還涉及由所述表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞和宿主生物體。本發(fā)明因此提供了包括與seqidno1或3具有至70％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％、還更優(yōu)選至少95％、或最優(yōu)選100％的序列同源性的核苷酸序列或由其組成的多核苷酸。表達(dá)載體可根據(jù)其中可以插入本發(fā)明的多核苷酸的宿主細(xì)胞來選擇。宿主細(xì)胞的此類轉(zhuǎn)化涉及常規(guī)技術(shù)諸如sambrook等[sambrook,j.,russell,d.(2001)molecularcloning:alaboratorymanual(分子克?。簩?shí)驗(yàn)室指南),coldspringharborlaboratorypress,ny,usa]中所教導(dǎo)的那些。適當(dāng)載體的選擇是本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員所公知的。適當(dāng)?shù)妮d體包括質(zhì)粒、噬菌體、粘粒和病毒。產(chǎn)生的雜合蛋白可從宿主細(xì)胞中通過任何適當(dāng)?shù)姆椒ǚ蛛x和純化，所述方法例如，沉淀或?qū)游龇蛛x，例如親和層析。本發(fā)明還涉及這些嵌合多肽的臨床應(yīng)用，并且涉及用于治療變態(tài)反應(yīng)，特別是對(duì)塵螨——?dú)W洲塵螨的變態(tài)反應(yīng)的特異性免疫治療。如上所述，特異性免疫治療是一種通過施用有效量的本發(fā)明的一種或多種雜合蛋白來治療和預(yù)防變態(tài)反應(yīng)的方法。優(yōu)選地，該治療是哺乳動(dòng)物，特別是人的治療。變態(tài)反應(yīng)本身可表現(xiàn)為鼻炎，結(jié)膜炎，哮喘，蕁麻疹，血管性水腫，濕疹，皮炎和/或過敏性休克。因此，本發(fā)明所涵蓋的治療和預(yù)防性治療可包括這些病癥的一種或多種的治療。如通過所述方法制備的雜合蛋白可配制成為用于治療變態(tài)反應(yīng)的藥物。本發(fā)明還涉及包含這些雜合蛋白的可能組合物以及施用它們的不同方式。本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案涉及疫苗組合物。主要組分是雜合蛋白，其優(yōu)選地與佐劑一起施用。有幾種適用于人類應(yīng)用的佐劑，例如，氫氧化鋁。疫苗的制備描述在vaccinedesign(疫苗設(shè)計(jì))(“thesubunitandadjuvantapproach(亞基和佐劑方法)”),mfpowell&mjnewman編輯,plenumpress,newyork,1995中。給藥的優(yōu)選形式包括對(duì)于通常疫苗接種和特別是變態(tài)反應(yīng)免疫治療所描述和建議的所有標(biāo)準(zhǔn)給藥方法(以口服，舌下，經(jīng)皮，靜脈內(nèi)，鼻內(nèi)，粘液形式，等)。本發(fā)明的雜合蛋白的低變應(yīng)原特性在下面討論。由本發(fā)明人使用elisa和elisa抑制試驗(yàn)所進(jìn)行的免疫學(xué)測(cè)試表明qm2嵌合體顯示在對(duì)歐洲塵螨過敏的患者的血清中沒有ige識(shí)別(圖9)。盡管含有兩種變應(yīng)原蛋白的大部分序列，然而嵌合體qm1的ige結(jié)合能力比兩種天然蛋白的混合物的ige結(jié)合能力低2500倍，如圖10中所示。qm1含有兩種蛋白的大多數(shù)序列，但在derp2的兩個(gè)半胱氨酸(8和119殘基)中有突變。通過使用皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)在107名患者上的體內(nèi)試驗(yàn)確證了這些低變應(yīng)原性數(shù)據(jù)。嵌合體qm1的變應(yīng)原性(例如，通過風(fēng)團(tuán)大小所指示的ige結(jié)合能力)比使用兩種單獨(dú)的天然蛋白所獲得的變應(yīng)原性低約50倍(圖11)。qm2的變應(yīng)原性實(shí)際上為0。當(dāng)用來自107名對(duì)歐洲塵螨過敏的患者的血清測(cè)量嵌合體qm2的反應(yīng)性時(shí)，此分子的低變應(yīng)原性得到確證(圖12)。此變應(yīng)原性的減小伴隨著嵌合體qm1和qm2的免疫原性的保持，該免疫原性出人意料地高于單個(gè)天然蛋白的總和所觀察到的免疫原性(圖13和圖14a)。這些特性允許這些嵌合體用作現(xiàn)有技術(shù)的全變應(yīng)原提取物的替代物，但其具有更高的安全性。菌株的保藏根據(jù)本發(fā)明的微生物的菌株已經(jīng)根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約(treatyofbudapestontheinternationalrecognitionofthedepositofmicroorganismsforthepurposesofpatentprocedure)保藏在巴倫西亞大學(xué)(universidaddevalencia,edificiodeinvestigación,campusdeburjasot,46100burjasot,valencia)的coleccióndecultivostipo(cect)，其具有下列參考資料：cect7317大腸桿菌(escherichiacoli)qm1cect7318大腸桿菌qm2于2007年10月3日保藏。附圖說明圖1顯示了從前面提及的相應(yīng)前蛋白proderp1推導(dǎo)的核苷酸和氨基酸的序列，其中前-區(qū)已經(jīng)加框，并且二硫橋通過連接相關(guān)被環(huán)繞的半胱氨酸殘基的線來指示。圖2顯示從前面提及的相應(yīng)成熟蛋白derp2推導(dǎo)的核苷酸和氨基酸的序列，其中二硫橋通過連接相關(guān)被環(huán)繞的半胱氨酸殘基的線來指示。圖3顯示qm1構(gòu)建圖。*表示被置換的殘基的位置。圖4顯示qm1的氨基酸和核苷酸的序列。derp2的引入殘基以陰影顯示，并且derp1的那些加框顯示。被置換的殘基通過雙框顯示。圖5顯示qm2構(gòu)建圖。*表示被置換的殘基的位置。圖6顯示qm2氨基酸和核苷酸的序列。derp2的引入殘基以陰影顯示，并且derp1的那些加框顯示。嵌合體構(gòu)建期間被置換的殘基通過雙下劃線顯示。圖7顯示電泳后考馬斯藍(lán)染色的聚丙烯酰胺凝膠，其中出現(xiàn)天然和重組變應(yīng)原(derp1和derp2)以及qm1和qm2融合體。圖8顯示與來自對(duì)歐洲塵螨過敏的患者的混合血清的ige抗體溫育的免疫印跡，其中出現(xiàn)天然和重組變應(yīng)原(derp1和derp2)以及qm1和qm2融合體。泳道m(xù)指示標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記物。圖9顯示使用來自19名對(duì)歐洲塵螨過敏的患者的血清(1/4稀釋液)，ige抗體與nderp1、nderp2、qm1和qm2的結(jié)合。圖10顯示來自elisa抑制試驗(yàn)的結(jié)果，所述elisa抑制試驗(yàn)顯示來自對(duì)歐洲塵螨過敏的患者的混合血清與固相中nderp1+derp2的等摩爾混合物的ige結(jié)合活性。使用的抑制劑分子為：nderp1+derp2、qm1、和qm2。各值對(duì)應(yīng)于從三個(gè)試驗(yàn)獲得的平均抑制，標(biāo)準(zhǔn)差小于10％。圖11顯示來自單個(gè)患者(n＝107)的、使用歐洲塵螨提取物(dpt)、nderp1和nderp2(均為10和100μg/ml)、以及qm1和qm2(均為50和500μg/ml)皮膚試驗(yàn)的結(jié)果。以mm2計(jì)的單個(gè)值作為在兩臂上測(cè)量的兩個(gè)(一式兩份)風(fēng)團(tuán)表面積的均數(shù)給出。結(jié)果顯示為箱形圖，其中各個(gè)箱的邊緣標(biāo)記25和75百分位數(shù)，并且直線表示中位值。從各個(gè)箱上下延伸的棒顯示非離群值的最大觀測(cè)值?？招膱A和星號(hào)代表各患者組的離群值和極值。wilcoxon秩檢驗(yàn)分析后的p值被包括在內(nèi)。圖12顯示來自單個(gè)患者血清(n＝107)的兩個(gè)(一式兩份)特異性ige均值的與歐洲塵螨提取物(dpt)、nderp1、nderp2、nd1d2、qm1和qm2的箱形圖圖示。結(jié)果顯示為箱形圖，其中各個(gè)箱的邊緣標(biāo)記25和75百分位數(shù)，并且直線表示中位值。從各個(gè)箱上下延伸的棒顯示非離群值的最大觀測(cè)值?？招膱A和星號(hào)代表各患者組的離群值和極值。wilcoxon秩檢驗(yàn)分析后的p值被包括在內(nèi)。圖13顯示使用10μg/ml歐洲塵螨提取物(dpt)、兩種雜合蛋白以及derp1和derp2的天然和重組形式的等摩爾混合物(分別為natmix和recmix)獲得的t淋巴細(xì)胞的增殖。顯示的值是刺激指數(shù)(％)。僅當(dāng)差異顯著時(shí)顯示p值。圖14:(a)通過用nd1d2、qm1和qm2免疫小鼠生成的抗血清的滴定。對(duì)不同稀釋度的抗血清檢測(cè)對(duì)nderp1和nderp2的天然等摩爾混合物(nd1d2)的反應(yīng)性。對(duì)每個(gè)血清稀釋度顯示與結(jié)合的igg抗體對(duì)應(yīng)的光密度均值(od)。(b)用nd1d2-、qm1-和qm2-特異性小鼠igg抗體預(yù)溫育后人ige結(jié)合nd1d2及其組分derp1和derp2的抑制。具體實(shí)施方式在qm1的情況下，通過兩種蛋白質(zhì)(derp1和derp2)的融合和去除一個(gè)二硫橋(殘基8-119)，并且在qm2的情況下，通過在derp2的殘基73和74之間插入蛋白derp1，獲得了根據(jù)本發(fā)明的低變應(yīng)原性雜合蛋白。出人意料地，盡管有這些變化，雜合蛋白(qm1和qm2)仍顯示比單獨(dú)的野生型分子更高的t細(xì)胞刺激能力(圖13)和誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫原性(圖14a)。組成雜合蛋白的肽片段可以由合格的和受過訓(xùn)練的人根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法諸如例如sambrook等[sambrook,j.,russell,d.(2001)molecularcloning:alaboratorymanual(分子克?。簩?shí)驗(yàn)室指南),coldspringharborlaboratorypress,ny,usa]中所述的那些方法通過例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)從編碼它們的核苷酸序列合成。已經(jīng)通過適當(dāng)?shù)南拗菩悦赶乃龅暮塑账嵝蛄锌梢酝ㄟ^連接反應(yīng)而合并入表達(dá)載體中。編碼肽片段的不同核苷酸序列使用接頭連接，所述接頭用被不同的限制性酶識(shí)別的序列形成，并且因此一些殘基出現(xiàn)在最終的雜合肽分子中，它們不存在于天然變應(yīng)原的原始序列中。這些新的殘基不干擾蛋白質(zhì)的正確翻譯，并且已經(jīng)通過雙下劃線標(biāo)記在圖6中的序列中。本發(fā)明涵蓋根據(jù)本發(fā)明的嵌合體，qm1和qm2，或由它們衍生的合成肽在動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物諸如人的脫敏治療中的應(yīng)用。脫敏方法涉及通過胃腸外(皮下，靜脈內(nèi)或肌內(nèi))，口服，舌下，經(jīng)鼻或經(jīng)直腸途徑的反復(fù)給藥。這些雜合蛋白可根據(jù)當(dāng)前法律和適用的臨床程序單獨(dú)施用或與藥物賦形劑、佐劑和/或稀釋劑聯(lián)合施用。根據(jù)本發(fā)明的雜合蛋白的免疫學(xué)特征展示如下。本發(fā)明所述的qm1和qm2雜合蛋白是低變應(yīng)原性的：如圖8、9、10和12中所示。它們對(duì)歐洲塵螨過敏患者的血清的反應(yīng)性低于全提取物或合并的天然蛋白，并且特別地對(duì)于qm2嵌合體，在“離體”試驗(yàn)中激活嗜堿性粒細(xì)胞的能力較低。在體內(nèi)皮膚試驗(yàn)中也已經(jīng)證明了此低變應(yīng)原性(圖11)。圖8顯示了免疫檢測(cè)試驗(yàn)，該試驗(yàn)表明qm1和qm2嵌合體與天然蛋白derp2的反應(yīng)性相比在變態(tài)反應(yīng)患者中具有較低的ige結(jié)合能力。此變應(yīng)原性的減小通過使用歐洲塵螨過敏患者的血清混合物的elisa抑制來定量(圖10)。與兩種天然蛋白的混合物相比，需要2500倍的qm1蛋白來達(dá)到50％的抑制。因此可以推斷其變應(yīng)原性比天然蛋白低2500倍，表明與兩種天然蛋白的混合物的ige結(jié)合能力減小了99％以上。qm1和qm2嵌合體的低變應(yīng)原性的更直接的測(cè)量方式通過直接測(cè)量107名歐洲塵螨過敏患者中的皮膚反應(yīng)性來獲得。圖11中的數(shù)據(jù)顯示嵌合體qm2具有顯著降低的皮膚反應(yīng)性。另一方面嵌合體qm2僅在5名患者中產(chǎn)生陽性反應(yīng)性。各個(gè)分布的比較顯示嵌合體qm1的風(fēng)團(tuán)大小均值比對(duì)nderp2觀察到的均值小50倍，并且比對(duì)nderp1觀察到的均值小10倍，表明變應(yīng)原活性減小了90-98％。不管對(duì)雜合蛋白使用的劑量更高，結(jié)果仍然如此。通過east測(cè)量，使用107名其他的歐洲塵螨過敏患者的血清還證明了雜合蛋白qm2的低ige結(jié)合能力(圖12)。在所有患者中，與天然蛋白的混合物dpt，以及重組或天然任一形式的單一蛋白相比，qm2的ige結(jié)合實(shí)際上是不存在的。此結(jié)合ige并導(dǎo)致不良反應(yīng)的能力的大量減小伴隨著免疫原性的保持。如圖13中所示，蛋白qm1和qm2顯示的淋巴增殖指數(shù)與兩種純蛋白derp1和derp2的混合物組合(以天然和重組兩種形式)所誘導(dǎo)的淋巴增殖指數(shù)相似。這證明作為突變多肽derp2(c8-c119)和derp1的融合體構(gòu)建的雜合蛋白qm1和用derp2的2個(gè)片段和derp1的一個(gè)片段構(gòu)建的qm2含有較少的構(gòu)象ige結(jié)合表位，但保留了足夠的t表位以誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答。當(dāng)用作sit的候選物時(shí)低變應(yīng)原性分子的另一所需特征，除了當(dāng)與相應(yīng)的變應(yīng)原比較具有較低的ige結(jié)合活性和含有t細(xì)胞表位以外，是它們應(yīng)當(dāng)具有誘導(dǎo)“阻斷”抗體的能力，該“阻斷”抗體阻止脫顆粒和組胺的釋放。用雜合蛋白qm1和qm2免疫小鼠誘導(dǎo)出比野生型蛋白混合物更強(qiáng)的igg應(yīng)答。這些derp1和derp2特異性igg抗體抑制屋塵螨過敏患者的ige與天然變應(yīng)原的結(jié)合，進(jìn)一步改善了變態(tài)反應(yīng)癥狀的預(yù)防作用。從與為準(zhǔn)備本發(fā)明并證明其特性的實(shí)驗(yàn)階段相關(guān)的下列實(shí)施例中將更好地理解本發(fā)明。這些實(shí)施例僅是說明性地，并不限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1:從螨身體純化天然變應(yīng)原derp1和derp2使用歐洲塵螨的凍干身體和糞便的混合物(laboratoriosleti,madrid,spain)作為起始原料，用10體積(p/v)添加1mmpmsf(苯甲磺酰基氟化物)的pbs(磷酸鹽緩沖鹽水)在4℃下快速攪拌提取15分鐘。然后以3,800xg在4℃下離心15分鐘。提取上清液通過ap(millipore)過濾，并且緩慢地加入60％硫酸銨361g/l)30min。在4℃下攪拌1小時(shí)后，其以17,000xg和在4℃下離心15分鐘?！ぬ烊籨erp1的純化離心后獲得的沉淀重新懸浮在2ml20mmtrisph8.0中，并通過0.22μm過濾。在superdexs20016/60柱(ge-healthcare,uppsala,sweden)中進(jìn)行分子篩層析，該柱用pbs平衡，并且注入來自前一步驟的2ml樣品。從排斥體積中收集3ml級(jí)分，其與24kda級(jí)分合并，通過sds-page在非還原條件下分析。下一步，在hightrapq柱(ge-healthcare)中進(jìn)行陰離子交換層析，該柱用20mmtrisph8.5平衡。來自前一步驟的陽性級(jí)分針對(duì)5l蒸餾水透析120min，并且轉(zhuǎn)至20mmtrisph8.5。樣品以1ml/分鐘加樣并用20mmtrisph8.5中的200-1000mmnacl的梯度洗脫。收集未結(jié)合的級(jí)分。通過在使用sds的聚丙烯酰胺凝膠(sds-page)中電泳來檢查制劑的純度。使用mini-protean(bio-rad)電泳儀，基本上遵循由laemmli所述的技術(shù)[(19)laemmli,u.k.(1970).cleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophaget4(在細(xì)菌噬菌體t4的頭部組裝期間結(jié)構(gòu)蛋白的切割).nature277,680-685]。在tris-甘氨酸緩沖液中向測(cè)定為10x10cm并且使用12.5％的聚丙烯酰胺濃度的凝膠施加200伏特電流45分鐘。用作標(biāo)記物的蛋白質(zhì)是用于低分子量的bio-rad試劑盒。使用圖像分析儀(diversity,biorad)進(jìn)行分子量的計(jì)算和凝膠的密度計(jì)分析。當(dāng)在還原條件下進(jìn)行sds-page時(shí)天然derp1的純化結(jié)果為純度為98％以上、大小為29.07kda的蛋白質(zhì)(圖7)。·天然derp2的純化239g/l硫酸銨加入至沉淀上清液中，使用60％硫酸銨獲得95％的濃度，在4℃下攪拌留置過夜。其在17,000xg和4℃下離心15分鐘，沉淀物重新懸浮在25mlmilliq水中。下一步，用50mmtrisph8.0平衡的highflowq16/20柱(ge-healthcare)中進(jìn)行陰離子交換層析。樣品針對(duì)5l水透析過夜，換3次水并轉(zhuǎn)至50mmtrisph8.0中。樣品以5ml/分鐘加樣，并且收集未結(jié)合的級(jí)分。第三個(gè)純化步驟由下列組成：在用20mmacnaph5.5平衡的hightrapsp柱(ge-healthcare)中進(jìn)行陽離子交換層析。來自前一步驟的未結(jié)合的級(jí)分針對(duì)5l水透析3小時(shí)，并轉(zhuǎn)至20mmacnaph5.5中。樣品的流速為1ml/分鐘，并用20mmacnaph5.5中200-1000mmnacl的梯度洗脫。作為最終的純化步驟，在用pbs平衡的superdexs75/300柱(ge-healthcare)中進(jìn)行分子篩層析。來自前一步驟的用200mmnacl洗脫的級(jí)分在amiconultra4(millipore)中濃縮，流速為0.4ml/min，并且收集0.5ml級(jí)分。該級(jí)分使用sds-page分析。將含有對(duì)應(yīng)于derp2的16kda蛋白的那些級(jí)分合并在一起。當(dāng)在還原條件下進(jìn)行sds-page時(shí)天然derp2的純化獲得了純度為95％以上且大小為16.63kda的蛋白質(zhì)(圖7)。實(shí)施例2:derp1和derp2變應(yīng)原的克隆編碼變應(yīng)原derp1和derp2的互補(bǔ)dna(cdna)，在各自的情況下，通過使用從塵螨分離的mrna作為模板和特異性引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄、接著使用pcr擴(kuò)增而被克隆。mrna使用quickprepmicrorna純化試劑盒(ge-healthcare)分離自100mg歐洲塵螨身體(laboratioriosleti,madrid,spain)。使用第一鏈cdna合成試劑盒(ge-healthcare)通過mrna的逆轉(zhuǎn)錄獲得cdna。引物由雜交區(qū)、不同限制性內(nèi)切酶的各種切割位點(diǎn)(下面加下劃線的)和錨定核苷酸組成。pcr擴(kuò)增反應(yīng)具有50μl的反應(yīng)體積中的下列組分：擴(kuò)增緩沖液x10,5μl；200μmdntp；100pm各種寡核苷酸引物；2.5單位taq聚合酶(pfxdna聚合酶,invitrogen)；1ngdna模板和補(bǔ)足至50μl的無菌蒸餾水。在robocycler熱循環(huán)儀(stratagene)中在各種情況下說明的特定條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)的產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠(2％)中進(jìn)行電泳，并且使用由生產(chǎn)廠商說明的實(shí)驗(yàn)方案通過geneclean(bio101)從凝膠中分離目的條帶。分離的片段連接進(jìn)pgem載體(promega)中。連接反應(yīng)混合物用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α的感受態(tài)細(xì)胞(可通過invitrogen,paisley,unitedkindom獲得)。將得到的集落生長以分離其質(zhì)粒dna，用適當(dāng)?shù)拿赶|(zhì)粒dna以釋放目的片段。選擇陽性克隆用于測(cè)序。通過改良的使用熒光雙脫氧核苷酸的sanger法對(duì)插入至pbluescript中的dna測(cè)序并且在熱循環(huán)儀中使用prism簡便反應(yīng)染色脫氧終止循環(huán)測(cè)序試劑盒(prismreadyreactiondyedeoxyterminationcyclesequencingkit)(perkinelmer)遵循生產(chǎn)廠商的說明書進(jìn)行擴(kuò)增?！erp1的cdna使用根據(jù)已發(fā)表的序列(genbank登記號(hào)：p08176)設(shè)計(jì)的引物通過pcr擴(kuò)增編碼derp1的cdna區(qū)。正向引物5′-actgacaggcctcgtccatcatcgatcaaaac-3′包括酶stui的切割序列(下劃線)，反向引物5′-cggaattcttagagaatgacaacatatgg-3′包括ecori(下劃線)和avrii(斜體)核酸內(nèi)切酶的切割區(qū)。擴(kuò)增條件為：94℃-1′(1個(gè)循環(huán))；94℃-30",48℃-1′,72℃-1′(35個(gè)循環(huán))；72℃-10′(1個(gè)循環(huán))。分離獲得的pcr產(chǎn)物，克隆在pgem(promega)載體中并測(cè)序。derp1的質(zhì)粒dna編碼具有302個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，包括80個(gè)氨基酸的前蛋白和222個(gè)氨基酸的成熟蛋白(圖1)。此序列顯示與對(duì)derp1.0105(p08176)所述的序列相比有差異(his152->asn)。該蛋白質(zhì)的計(jì)算分子量為24.97kda，等電點(diǎn)為5.49。·derp2的cdna使用根據(jù)已發(fā)表的序列(aaf86462)設(shè)計(jì)的引物通過pcr擴(kuò)增編碼derp2的cdna區(qū)。5′-cgggatccgatcaagtcgatgtcaaag-3′用作正向引物，其包括限制性酶bamhi的切割序列，5′-cggaattcttaatcgcggattttagc-3′用作反向引物，具有限制性酶ecori的切割序列。擴(kuò)增條件為：94℃-1′(1個(gè)循環(huán))；94℃-30",48℃-1′,72℃-1′(35個(gè)循環(huán))；72℃-10′(1個(gè)循環(huán))。分離獲得的pcr產(chǎn)物，克隆在pbluescriptiiks載體(stratagene)中并測(cè)序。在用限制性酶bamhi/ecori消化后分離編碼derp2的質(zhì)粒dna，并且亞克隆進(jìn)pkn172載體[(20)way,m.,pope,b.,gooch,j.,hawkins,m.,weeds,a.g.(1990)identificationofaregioninsegment1ofgelsolincriticalforactinbinding(鑒定鈣結(jié)合微絲蛋白的節(jié)段1中對(duì)肌動(dòng)蛋白結(jié)合重要的的區(qū)).emboj.9；4103-4109]和ptrchisa(invitrogen,carlsbad,ca,usa)]中。獲得的derp2序列編碼129個(gè)氨基酸的多肽(圖2)，其包括相對(duì)于derp2.0102(aaf86462)序列的一個(gè)氨基酸改變(leu127->ile)。然而，derp2(p49278)和所述的其他亞型在此位置中也具有異亮氨酸。該蛋白質(zhì)的理論分子量為14.106kda，等電點(diǎn)為7.10。實(shí)施例3:重組derp2的表達(dá)和純化用相應(yīng)的質(zhì)粒通過hanahan法[(21)hanahan,d.(1983).studiesontransformationofescherichiacoliwithplasmids(對(duì)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌的研究).j.mol.biol.166,557-580]轉(zhuǎn)化的大腸桿菌bl21(de3)細(xì)胞鋪在含有添加了200μg/ml氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(petriplate)上。從細(xì)胞集落預(yù)先接種50ml相同培養(yǎng)基，在37℃下溫育過夜并攪拌(260rpm)。用所述預(yù)接種物接種在1升相同的培養(yǎng)基中，從0.2的光密度(600nm)開始。其在37℃下溫育并攪拌直至達(dá)到0.6的光密度(600nm)(約90分鐘)，此時(shí)使用異丙基-硫代-β-半乳糖苷(iptg)以0.6mm的終濃度進(jìn)行誘導(dǎo)。3小時(shí)的誘導(dǎo)期后，通過離心收集細(xì)胞。細(xì)胞在4℃下以10000rpm離心15分鐘，并且重新懸浮在50ml裂解緩沖液(50mmtrisph8.0；1mmdtt(二硫蘇糖醇))中。重懸浮液用溶菌酶(0.1mg/ml的終濃度)在37℃下處理30分鐘并攪拌。下一步其在冰浴中超聲處理5分鐘，加入1％tritonx-100，并且將其放置在室溫下溫育30分鐘并輕輕攪拌。在8000xg下離心15分鐘后，沉淀物重新懸浮在20ml2m尿素和0.2％tritonx-100中，并且在室溫下溫育30分鐘并輕輕攪拌。其在冰浴中超聲處理1分鐘，并且在8000xg和4℃下離心15分鐘。沉淀物重新懸浮在10ml6m氯化胍和0.5％β-巰基乙醇中。將其保持在4℃下磁力攪拌1小時(shí)并且針對(duì)200ml處于25mmtrisph8.0中的6m尿素透析過夜。為了改善其折疊，然后樣品用6m尿素稀釋至1-2mg/ml，并且針對(duì)如下各溶液在4℃下逐步進(jìn)行透析：400ml3m尿素/1l1.5m尿素/0.75m尿素/0.37m尿素/0.18m尿素，每90分鐘進(jìn)行更換。最后，其在4℃下針對(duì)5l蒸餾水透析過夜。在用25mmacnaph5.5平衡的highflowsp16/20柱(healthcare)中采用陰離子交換層析完成純化。樣品轉(zhuǎn)至25mmacnaph5.5并且以3800xg離心10分鐘以及通過ap(millipore)和0.45μm(millipore)濾器過濾后，其以5ml/min通過柱。以處于25mmacnaph5.5中的1000mmnacl進(jìn)行洗脫。純化的收率為每升培養(yǎng)液3.8mg。當(dāng)在還原條件下進(jìn)行sds-page時(shí)，重組derp2的純化得到純度超過95％和大小為17.05kda的蛋白質(zhì)(圖7)。實(shí)施例4:qm1融合體的構(gòu)建此以derp2的質(zhì)粒dna開始，該質(zhì)粒dna使用引物5′-cgggatccgtcaaagatagtgccaatc-3′和5′-acggatctgcaggtagcaatagcactggccaa-3通過pcr擴(kuò)增而成，該引物分別包括酶bamhi和psti的切割序列(下劃線)。擴(kuò)增條件為：94℃-1′(1個(gè)循環(huán))；94℃-30",56℃-30",72℃-1′(35個(gè)循環(huán))；72℃-10′(1個(gè)循環(huán))。獲得的片段被連接進(jìn)用bamhi/psti切割的pbluescriptks載體(stratagene)中并測(cè)序。此構(gòu)建體用psti/ecori消化，并且在用相同的酶psti/ecori消化初始序列后已經(jīng)獲得的derp1的成熟蛋白的部分序列通過連接反應(yīng)摻入。獲得的融合蛋白亞克隆進(jìn)表達(dá)載體pkn172和trchis中的bamhi/ecori處。融合蛋白1來自兩個(gè)片段的結(jié)合(圖3)。第一個(gè)片段由編碼derp2的氨基酸5-123的序列形成。設(shè)計(jì)用于再擴(kuò)增此序列的寡核苷酸包括堿基變化，所述堿基變化包括原始蛋白的8和119位的半胱氨酸被絲氨酸置換。第二個(gè)片段編碼derp1的成熟蛋白的氨基酸4-222。第二個(gè)片段與第一個(gè)片段通過位于derp1的成熟蛋白的氨基酸3和5之間的酶psti的核心結(jié)合。得到的質(zhì)粒dna編碼338個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(圖4)，其分子量為37.56kda，理論等電點(diǎn)為6.16。實(shí)施例5:qm2融合體的構(gòu)建融合蛋白2通過三個(gè)片段的結(jié)合而構(gòu)建：·對(duì)應(yīng)于derp2的n-末端的片段1使用包括酶bamhi的核心的正向引物5′-cgggatccgatcaagtcgatgtcaaag-3′和包括ecori、avrii和psti的核心的反向引物5′-ccgaattccctaggctgcagccatttggatcgat-3′擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：94℃-1′(1個(gè)循環(huán))；94℃-30",56℃-30",72℃-1′(35個(gè)循環(huán))；72℃-10′(1個(gè)循環(huán))。·derp1的片段2用下列的寡核苷酸擴(kuò)增：5′-actgacaggcctcgtccatcatcgatcaaaac-3′和5′-cacctagggagaatgacaacatatgg-3′。正向引物包括stui的切割序列，反向引物包括avrii的切割序列。擴(kuò)增條件為：94℃-1′(1個(gè)循環(huán))；94℃-30",56℃-30",72℃-1′(35個(gè)循環(huán))；72℃-10′(1個(gè)循環(huán))?！て?使用derp2作為模板以及引物5′-cacctaggcattacatgaaaagccca-3′和5′-cggaattcttaatcgcggattttagc-3′(分別具有酶avrii和ecori的識(shí)別序列)通過pcr獲得。擴(kuò)增條件為：94℃-1′(1個(gè)循環(huán))；94℃-30",52℃-30",72℃-1′(35個(gè)循環(huán))；72℃,10′(1個(gè)循環(huán))。分離所需片段并在下列條件下進(jìn)行再擴(kuò)增：94℃-1′(1個(gè)循環(huán))；94℃-30",56℃-30",72℃-1′(35個(gè)循環(huán))；72℃-10′(1個(gè)循環(huán))。片段1克隆進(jìn)pbluescriptks載體(stratagene)中的bamhi/ecori處。此第一構(gòu)建體用psti和avrii消化，并且之前用相同酶消化的片段2通過連接反應(yīng)摻入。使用psti的消化確保此第二片段僅包括derp1的成熟蛋白的部分序列。此包括片段1和2的新構(gòu)建體再用avrii和ecori消化，并且與片段3結(jié)合。將編碼融合蛋白的質(zhì)粒dna測(cè)序，并且亞克隆進(jìn)pkn172和ptrchisa載體中用于其表達(dá)。由編碼derp2的完整蛋白的序列形成qm2融合體的dna，該序列中編碼從derp1的成熟蛋白的氨基酸5至最后殘基的序列已經(jīng)插入至決定氨基酸73和74的堿基之間(圖5)。derp1結(jié)合至derp2的第二個(gè)片段，涉及加入avrii的核心和編碼脯氨酸和精氨酸的6個(gè)額外堿基。設(shè)計(jì)用于構(gòu)建片段1和3的引物包括相對(duì)于原始序列的一些差異：derp2的氨基酸72(ala->gly)和78(cys->ser)的改變(圖6)。蛋白質(zhì)的氨基酸342證明是纈氨酸而非derp2的原始序列的丙氨酸。當(dāng)derp1的序列被引入至derp2的氨基酸73中時(shí)，最終的蛋白完全地破壞了derp2的三維結(jié)構(gòu)。最終的雜合蛋白由349個(gè)氨基酸構(gòu)成，其計(jì)算的分子量為38.92kda，理論等電點(diǎn)為6.22。實(shí)施例6:雜合蛋白qm1和qm2的表達(dá)和純化以使用從添加了200μg/ml氨芐青霉素的lb平板分離的相應(yīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌bl21(de3)細(xì)胞的集落開始，取50ml相同培養(yǎng)基的預(yù)接種物，并且在37℃下溫育過夜并攪拌(260rpm)。從0.2的光密度(600nm)開始，在1升相同的培養(yǎng)基中接種所述預(yù)接種物。其在37℃下溫育并攪拌直至其達(dá)到0.6的光密度(600nm)(約90分鐘)，此時(shí)使用異丙基-硫代-β-半乳糖苷(iptg)以0.6mm的終濃度進(jìn)行誘導(dǎo)。3小時(shí)的誘導(dǎo)期后，通過離心收集細(xì)胞?！m1純化重組細(xì)菌的裂解條件以及在去除尿素的階段中通過透析重折疊與rderp2的純化(實(shí)施例3)一樣。最后通過透析的氧化折疊在4℃下針對(duì)1l處于50mmtrisph8.0中的5mm半胱氨酸/1mm胱氨酸過夜進(jìn)行。最后，其在3800xg和4℃下離心10分鐘，上清液通過ap(millipore)過濾，和針對(duì)2mm磷酸鹽ph8.5透析2小時(shí)，并以18000xg離心15分鐘以去除可能沉淀的物質(zhì)。純化的最終收率為120mg/升培養(yǎng)基。·qm2純化重組細(xì)菌的裂解條件與rderp2的純化(實(shí)施例3)一樣。50mmdtt加入至10ml6m氯化胍中的135mg蛋白中并在環(huán)境溫度下溫育1小時(shí)。下一步，加入0.2m2-碘乙酰胺，并且在環(huán)境溫度下溫育1小時(shí)。最后，加入0.2mβ-巰基乙醇，在環(huán)境溫度下再溫育1小時(shí)，并用6m尿素使之達(dá)到50ml。下一步在通過透析去除尿素的階段中進(jìn)行折疊，與rderp2的純化(實(shí)施例3)一樣，并且以3800xg離心15分鐘以去除任何沉淀的物質(zhì)。純化的下一階段由下列組成：在用20mm乙醇胺ph10.0平衡的highflowq16/20柱中進(jìn)行的陰離子交換層析。樣品以5ml/min通過，收集未結(jié)合的物質(zhì)，并在amiconultra4(millipore)中濃縮。其以3800xg離心15分鐘，并通過ap和0.45μm濾器過濾以去除任何沉淀的物質(zhì)。最后，在用200mmnh4hco3平衡的superdexsx20016/60柱中以1ml/min進(jìn)行分子篩層析。蛋白質(zhì)由于其形成聚集體的傾向而出現(xiàn)在洗脫液中。純制劑在相同的緩沖液中凍干，并保持在4℃。純化的最后收率為42.4mg/升培養(yǎng)基。在作為包涵體的不溶級(jí)分中發(fā)現(xiàn)兩種蛋白質(zhì)，但它們不能溶解在尿素中。當(dāng)在還原條件下進(jìn)行sds-page時(shí)，qm1和qm2的純化得到了純度超過95％，大小分別為34.91和39.67kda的蛋白質(zhì)(圖7)。實(shí)施例7:證明雜合蛋白與來自歐洲塵螨過敏患者的血清混合物的低ige固定反應(yīng)性的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)a)免疫檢測(cè)使用來自歐洲塵螨過敏患者的血清混合物通過免疫轉(zhuǎn)移技術(shù)進(jìn)行qm1和qm2嵌合體的ige結(jié)合活性的初步評(píng)價(jià)。將蛋白質(zhì)提取物和純化蛋白質(zhì)施加至聚丙烯酰胺凝膠上后，使用towbin等的方法[towbin,h.,staehelin,i.,andgordon,j.(1979).electrophoretictransferofproteinsfrompolyacrylamidegelstonitrocellulosesheets:procedureandsomeapplications(蛋白從聚丙烯酰胺凝膠至硝酸纖維素片的電泳轉(zhuǎn)移：程序和一些應(yīng)用).proc.natl.acad.sci.usa76,4350-4354]進(jìn)行電轉(zhuǎn)移。通過sds-page分離的蛋白質(zhì)被電轉(zhuǎn)移至pvdf(聚偏二氟乙烯)hybond-p片(ge-healthcare)。該片在環(huán)境溫度下封閉1小時(shí)后，將它們與一抗在4℃下溫育過夜，并且在用相同的洗滌緩沖液洗滌多次后，將該片與與過氧化物酶混合的二抗在環(huán)境溫度下溫育1小時(shí)。使用ecl化學(xué)發(fā)光法(ge-healthcare)如生產(chǎn)廠商所提及的那樣通過將該片與膜(hyperfilm.ecl,ge-healthcare)接觸而進(jìn)行條帶檢測(cè)。免疫檢測(cè)試驗(yàn)不是定量的，但顯示在兩個(gè)嵌合體之間不同的ige結(jié)合能力；因此僅在qm1的情況下有ige抗體的輕微識(shí)別，而在qm2嵌合體的情況下識(shí)別為0(圖8)。b)直接elisa使用來自歐洲塵螨過敏患者的個(gè)體血清通過elisa技術(shù)分析兩種嵌合體的ige反應(yīng)性。聚苯乙烯平板(greiner)與每小杯0.1μg的純蛋白nderp1和nderp2在pbs緩沖液(10mm磷酸鹽ph7.2；137mmnacl2.7mmkcl)中的等摩爾混合物在環(huán)境溫度下溫育過夜。它們用200μl/小杯添加了bsa1％-tween200.05％的pbs封閉并在37℃下保持1小時(shí)。下一步，以1/4稀釋度加入100μl/小杯來自歐洲塵螨過敏患者的血清混合物，并在37℃下放置90分鐘。用200μl/小杯的pbs-t(pbs+tween200.05％)洗滌3次后，加入100μl/小杯的與過氧化酶(稀釋度1:1000)混合的針對(duì)人ige免疫球蛋白的抗血清(dako)，并且在37℃下溫育90分鐘。用pbs-t又洗滌3次后，加入200μl/小杯的根據(jù)生產(chǎn)廠商的說明書制備的鄰苯二胺溶液(sigma-fasttabletsets,sigma)，并將平板在暗處保持30分鐘。用50μl/小杯的3mh2so4終止反應(yīng)，并且在elisaeasyreaderear-400at平板讀數(shù)儀(slt-labinstruments)中在492nm處測(cè)量吸光度。僅在一些患者中顯示對(duì)qm1嵌合體的ige反應(yīng)性，而實(shí)際上患者血清的ige抗體的任一種均不識(shí)別qm2(圖9)。c)elisa抑制使用來自歐洲塵螨過敏患者的個(gè)體血清的混合物，通過elisa抑制技術(shù)分析對(duì)兩種嵌合體的ige反應(yīng)性。該技術(shù)與前面的技術(shù)相同，不同之處在于來自歐洲塵螨過敏患者的血清混合物以1/10的稀釋度與特定濃度的抑制劑蛋白(0.025-2500ng/ml)在4℃下預(yù)溫育過夜。然后與直接elisa一樣，檢測(cè)ige結(jié)合的抗體。在elisa抑制試驗(yàn)中，qm1嵌合體顯示的抑制程度比nderp1-nderp2的當(dāng)量混合物低。因此，達(dá)到50％抑制的nderp1-nderp2所需的量為1ng/ml，而使用qm1嵌合體需要加入2500ng/ml以達(dá)到相同的效應(yīng)(圖10)。這表明qm1與患者特異性ige的結(jié)合能力低2500倍，并且因此其變應(yīng)原性將降低99.96％。qm2嵌合體不能結(jié)合歐洲塵螨過敏患者的特異性ige，因此其在elisa抑制試驗(yàn)中的行為與使用陰性對(duì)照諸如牛血清白蛋白所獲得的行為相比沒有變化。實(shí)施例8:證明qm1和qm2雜合蛋白的低皮膚反應(yīng)性的體內(nèi)試驗(yàn)在107名螨過敏患者上進(jìn)行體內(nèi)皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)(skinpricktests)以評(píng)價(jià)qm1和qm2嵌合體的低變應(yīng)原性。使用歐洲塵螨提取物，從螨分離的nderp1和nderp2；在大腸桿菌中表達(dá)的rderp2，以及qm1和qm2嵌合體進(jìn)行皮膚試驗(yàn)。所有樣品在0.5％含酚的和50％含甘油的生理鹽水溶液中稀釋。對(duì)于未修飾的純化蛋白(nderp1、nderp2和rderp2)使用的濃度為1、10和100μg/ml，對(duì)于嵌合體為5、50和500μg/ml。nacl0.9％和鹽酸組胺(10mg/ml)分別用作陰性和陽性對(duì)照。在試驗(yàn)中，放置一滴各種變應(yīng)原用于在前臂內(nèi)側(cè)上測(cè)試，然后用小刀刺穿該液滴。每個(gè)試驗(yàn)成排地重復(fù)用于比較增加和降低的濃度。15min后，用細(xì)筆尖黑色標(biāo)記筆將風(fēng)團(tuán)畫圈。低變應(yīng)原膠布條置于風(fēng)團(tuán)上并輕輕按壓，從而將墨水的痕跡轉(zhuǎn)移至條上，這將其轉(zhuǎn)移至風(fēng)團(tuán)記錄片上。使用數(shù)字化書寫紙summasketch和計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)程序(autocadv.11)通過數(shù)字化輸入測(cè)量風(fēng)團(tuán)面積。在測(cè)量的反應(yīng)性和采用的變應(yīng)原濃度之間觀察到相關(guān)性。qm2嵌合體稍有反應(yīng)性，因?yàn)樵谘芯康?07名患者的5名(4.7％)中僅在最高濃度(500μg/ml)下觀察到反應(yīng)性。qm1嵌合體反應(yīng)性較高，86名患者(80.4％)對(duì)500μg/ml具有陽性反應(yīng)，16名(16.8％)對(duì)50μg/ml有陽性反應(yīng)，但反應(yīng)性比野生型蛋白小得多。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)研究，通過將結(jié)果顯示在箱形圖中并對(duì)兩個(gè)相關(guān)變量使用wilcoxon檢驗(yàn)以比較性地解釋獲得的結(jié)果(圖10)。在這些圖示中可見當(dāng)處于500μg/ml的最高濃度的qm1(中位數(shù)40.33mm2,置信區(qū)間95％:35.05-47.88)與處于100μg/ml的nderp1、nderp2和rderp2比較時(shí)皮膚反應(yīng)值(作為以mm2計(jì)的風(fēng)團(tuán)面積所測(cè)量的)的分布有顯著的差異(p<0.001)，對(duì)nderp1、nderp2和rderp2的反應(yīng)性比qm1所誘導(dǎo)的反應(yīng)性大，中位值分別為52.96；78.86；和75.72mm2。然而，qm1的反應(yīng)性與處于10μg/ml的nderp2(中位數(shù)41.91mm2,置信區(qū)間95％:28.27-49.71)沒有顯著差異(p＝0.067)。當(dāng)與全螨提取物的反應(yīng)性(中位數(shù)39.55mm2,置信區(qū)間95％:34.10-44.40)比較時(shí)也沒有顯著差異(p＝0.872)。就此而言，值得注意的是：與qm1中存在500μg/ml的蛋白質(zhì)相比，用于點(diǎn)刺診斷的螨提取物制劑分別含有7.96和2.22μg/mlderp1和derp2。在這些圖示中也可看到qm2與螨提取物(dpt)、nderp1和nderp2相比分布有顯著差異(p<0.001)。實(shí)施例9:嵌合體的比較spt值比較了產(chǎn)生與10mg/ml組胺所產(chǎn)生的風(fēng)團(tuán)類似的風(fēng)團(tuán)的變應(yīng)原濃度值。為此，采用nordic指南(nordicguidelines)中所述的方法[(24)registrationofallergenpreparations(變應(yīng)原制劑的注冊(cè)).nordicguidelines(1989).nlnpublication23,uppsala,sweden]。對(duì)每個(gè)患者從不同濃度的各種蛋白所獲得的風(fēng)團(tuán)的幾何平均數(shù)計(jì)算產(chǎn)生類似于組胺產(chǎn)生的風(fēng)團(tuán)的蛋白濃度，然后對(duì)研究的每組患者計(jì)算這些值的均值。觀察到對(duì)于nderp1和nderp2，產(chǎn)生類似于組胺所產(chǎn)生的風(fēng)團(tuán)的蛋白濃度分別為20.5和17.4μg/ml，而對(duì)于qm1嵌合體，其濃度高達(dá)182.4μg/ml。實(shí)施例10:證明雜合蛋白qm1和qm2的低ige抗體結(jié)合能力的試驗(yàn)除了體內(nèi)試驗(yàn)，使用east直接技術(shù)通過測(cè)定特異性ige進(jìn)行體外試驗(yàn)。根據(jù)ceska等[(25)ceska,m.和lundkvist,u.(1972).anewandsimpleradioimmunoassaymethodforthedeterminationofige(一種新型和簡單的測(cè)定ige的放射免疫測(cè)定法).immunochemistry9,1021-1030]通過將天然和重組蛋白(50μg/ml)結(jié)合到用溴化氰活化的皿中，并且還結(jié)合歐洲塵螨提取物(500μg/ml)，測(cè)定特異性ige。下一步，加入50μl來自患者的血清并且在環(huán)境溫度下溫育1小時(shí)。洗滌后，將這些皿與50μl與堿性磷酸酶結(jié)合的人抗ige抗體在37℃下溫育30分鐘，并且根據(jù)生產(chǎn)廠商所述的使用說明以hytec特異性igeeia試劑盒(hycorbiomedicalinc.)的試驗(yàn)方案進(jìn)行定量。獲得的結(jié)果簡單地重新確認(rèn)了體內(nèi)獲得的結(jié)果。qm2嵌合體結(jié)合ige抗體的能力非常低，因?yàn)?07個(gè)研究的血清中僅有7個(gè)(6.5％)具有能夠結(jié)合qm2的ige抗體。具有qm1特異性ige的血清數(shù)目為88(82.2％)。qm1的ige結(jié)合能力(中位數(shù)17.01u/ml,置信區(qū)間95％:9.92-27.16)有顯著的差異(p<0.001)，并且低于全提取物(中位數(shù)39.35u/ml,置信區(qū)間95％:18.80-50.90)(圖11)。實(shí)施例11:證明雜合蛋白qm1qm2的嗜堿性粒細(xì)胞激活能力的試驗(yàn)使用通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量的嗜堿性粒細(xì)胞刺激試驗(yàn)(流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞變應(yīng)原刺激實(shí)驗(yàn))來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所述嗜堿性粒細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)如sanz等[(26)sanz,m.l,.sánchez,g.,gamboa,p.,vila,l.,uasuf,c.,chazot,m.(2001)allergen-inducedbasophilactivation:cd63cellexpressiondetectedbyflowcytometryinpatientsallergictod.pteronyssinusandloliumperenne(變應(yīng)原誘導(dǎo)的嗜堿性粒細(xì)胞激活：在對(duì)歐洲塵螨和黑麥草過敏的患者中通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)cd63細(xì)胞表達(dá)).clin.exp.allergy31,1007-1013]中所述進(jìn)行。通過離心收集位于紅細(xì)胞上的層中的血細(xì)胞并且重新懸浮在含有il3(2ng/ml)和10μl肝素(5000ui/ml)的hepes-ca2+緩沖液(20mmhepes,133mmnacl,5mmkcl,7mmcacl2,3.5mmmgcl2,1mg/mlbsa,ph7.4)中。向u形底聚苯乙烯平板(greinermicrolon,greiner-bioone,frickenhausen,germany)的小杯中加入濃度為2μg/ml-0.02pg/ml的變應(yīng)原和對(duì)照溶液(50μl)，其與50μl來自患者的細(xì)胞懸液混合并在37℃下溫育40分鐘。通過加入無ca2+或mg2+但含有0.27mmedta的100μlhepes緩沖液(洗滌緩沖液)終止反應(yīng)，并將平板離心。細(xì)胞沉淀的嗜堿性粒細(xì)胞用標(biāo)記以pe(藻紅蛋白)的抗cd63抗體和標(biāo)記以fitc(異硫氰酸熒光素)的抗ige抗體(稀釋度分別為1:80和1:60,caltag,burlingame,usa)進(jìn)行標(biāo)記，并在4℃下溫育30分鐘，隨后加入4ml紅細(xì)胞溶解試劑(erythrolyticreagent)(orthodiagnosticsystem,madrid,spain)。通過加入洗滌緩沖液終止細(xì)胞裂解，離心細(xì)胞后，上清液用500μl相同的緩沖液稀釋。使用裝有15nw氬激光的facscan流式細(xì)胞儀(bectondickinson,sanjose,usa)在488nm下通過流式細(xì)胞術(shù)分析嗜堿性粒細(xì)胞的表面標(biāo)志物，并使用cellquest計(jì)算機(jī)軟件包分析數(shù)據(jù)。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在至少500個(gè)嗜堿性粒細(xì)胞中研究抗ige和抗cd63標(biāo)記。單克隆抗ige抗體le27(1μl/ml；bühlmann,allschwil,switzerland)用作陽性對(duì)照，使用hepes-ca2+緩沖液評(píng)價(jià)無刺激的基線值。當(dāng)在使用的歐洲塵螨提取物或純化蛋白的任何濃度下刺激指數(shù)(用歐洲塵螨提取物或純化蛋白激活的％嗜堿性粒細(xì)胞/基礎(chǔ)條件下激活的％嗜堿性粒細(xì)胞)≥2時(shí)認(rèn)為激活反應(yīng)呈陽性，并且由于該變應(yīng)原引起的特異性激活>10％。對(duì)于嵌合體qm1或qm2，沒有一個(gè)對(duì)照受試者顯示陽性結(jié)果。在33名研究的歐洲塵螨過敏患者中，qm1在28名中產(chǎn)生陽性反應(yīng)，而qm2僅在10例中存在陽性反應(yīng)，并且在總是以大大低于qm1的濃度產(chǎn)生陽性反應(yīng)。實(shí)施例12:證明雜合蛋白qm1和qm2的免疫原性能力的誘導(dǎo)性淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)低變應(yīng)原性分子在免疫治療中的應(yīng)用的一種基本要求是保持其抗原性(t表位)。因此為了檢查除了不結(jié)合ige抗體以外，雜合蛋白是否持續(xù)具有抗原性，在通過實(shí)驗(yàn)中使用的不同蛋白刺激的外周血單核細(xì)胞(pbmc)上進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖研究。通過在純化淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)物中摻入熒光素衍生物來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。此衍生物(羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(cfse))可通過細(xì)胞膜，但直至其被細(xì)胞酯酶降解轉(zhuǎn)變?yōu)椴荒芡ㄟ^細(xì)胞膜的熒光素化合物才發(fā)出熒光。在bdfacscalibur流式細(xì)胞儀(becton-dickinson,franklinlakesnj,usa)中通過流式細(xì)胞術(shù)分析cfse摻入。使用淋巴細(xì)胞分離溶液(lymphoprep,nycomed)通過密度梯度離心分離23名歐洲塵螨過敏患者的pbmc。然后pbmc以1-2x106活細(xì)胞/ml重新懸浮在培養(yǎng)基(rpmi1640,sigmachemicalco.)中，并且其活力用pbs中的0.25％臺(tái)盼藍(lán)(sigmachemicalco.)來檢測(cè)。制備的活力大于90％的pbmc立即用于體外增殖試驗(yàn)。rpmi-1640中的10x106pbmc用cfse(終濃度5μm)在37℃和5％co2的潮濕氣氛中標(biāo)記10min。用50％的胎牛血清終止標(biāo)記5min，將它們用添加了10％胎牛血清的rpmi-1640洗滌2次，并以1-2x106細(xì)胞/ml重新懸浮在添加了5％人ab血清的完全培養(yǎng)基(rpmi-1640,50μg/ml慶大霉素和谷氨酰胺2mm)中。將它們置于具有24個(gè)小杯的平底微量滴定板(nunclon,nunc)中，在1ml的最終體積的培養(yǎng)基中有1-2x106細(xì)胞，并以10μg/ml的終濃度加入抗原(歐洲塵螨提取物和不同的純化蛋白)，并在37℃和5％co2的潮濕氣氛中溫育7天。在具有四色熒光性能的bdfacscalibur流式細(xì)胞儀(becton-dickinson)中進(jìn)行流式細(xì)胞分析。結(jié)果表示為通過cellquest軟件程序包(becton-dickinson)所評(píng)價(jià)的記錄事件的百分比。在所有情況下均包括未刺激培養(yǎng)物的對(duì)照一式三份。試驗(yàn)中使用的蛋白質(zhì)為兩種雜合蛋白(qm1和qm2)，歐洲塵螨的純化蛋白nderp1和nderp2(天然混合物)和分離自大腸桿菌的重組蛋白rderp1和rderp2(重組混合物)的兩種等摩爾混合物。歐洲塵螨提取物也用作對(duì)照。在第一步驟中，進(jìn)行一定范圍的免疫原蛋白濃度以確定用于隨后進(jìn)行試驗(yàn)的最佳濃度。在所有情況下均觀察到顯示最大增殖(ie％)的蛋白濃度為10μg/ml。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)箱形圖分析和兩個(gè)匹配樣品的非參量檢驗(yàn)分析23名歐洲塵螨過敏患者的增殖結(jié)果。從統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可見，用作對(duì)照的歐洲塵螨提取物(均值12％,置信區(qū)間95％:8-20)的抗原刺激能力與嵌合體qm1(均值15％,置信區(qū)間95％:10-25)和qm2(均值13％,置信區(qū)間95％:8-17)沒有顯著的差異(分別為p＝0.121和p＝0.304)。然而，qm1的免疫原性稍高于(p<0.05)使用天然混合物(均值9％,置信區(qū)間95％:5-13)或重組混合物(均值9％,置信區(qū)間95％:57-14.5)獲得的免疫原性(p<0.005)。當(dāng)兩種嵌合體彼此比較時(shí)，觀察到qm1誘導(dǎo)免疫增殖的能力稍高(p<0.005)(圖13)。從獲得的結(jié)果可以看出，qm1和qm2兩者均一直保持免疫增殖誘導(dǎo)能力，并且與野生型蛋白相比在融合蛋白中甚至更高。實(shí)施例13:qm1和qm2誘導(dǎo)的抗體抑制患者的ige與天然變應(yīng)原的結(jié)合為此目的，用雜合蛋白免疫小鼠。6周齡雌性balb/c小鼠(haarlam,barcelona,spain)經(jīng)腹膜內(nèi)使用10μg純化的nderp1和nderp2(nd1d2)的等摩爾混合物，吸附至氫氧化鋁的qm1或qm2的任一種進(jìn)行免疫，每15天5次。對(duì)于各種蛋白質(zhì)，使用6只小鼠，并在最后一次強(qiáng)化免疫后10天經(jīng)頜下靜脈放血獲得血清，混合并在-20℃下保存?zhèn)溆?。首先，使用elisa滴定試驗(yàn)檢查用nd1d2、qm1和qm2免疫小鼠產(chǎn)生的抗血清是否對(duì)nd1d2有反應(yīng)性。如實(shí)施例7b中所述進(jìn)行elisa試驗(yàn)，但加入小鼠抗血清的2倍稀釋液，然后各孔與1/2000稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的小鼠抗小鼠igg抗體(sigmachemical,st.louis,mo,usa)溫育。三次洗滌后，加入200μl/孔的鄰苯二胺溶液(sigma)測(cè)量過氧化物酶活性。30min后，通過加入50μl/孔3mh2so4終止顯色反應(yīng)，在492nm處讀取光密度。用純化nderp1和nderp2的等摩爾混合物(nd1d2)、qm1和qm2免疫小鼠產(chǎn)生的抗血清與nd1d2反應(yīng)，顯示用兩種雜合蛋白免疫與用nd1d2免疫相比導(dǎo)致較高的nd1d2特異性igg抗體水平(圖14a)。為了研究針對(duì)雜合分子的小鼠igg是否能夠抑制患者血清ige與nd1d2的結(jié)合，使用九個(gè)來自屋塵螨(hdm)過敏患者的個(gè)體血清或來自30名hdm過敏患者的混合血清(1/50稀釋)進(jìn)行競爭elisa。elisa滴定板(greiner)用pbs中的nd1d2包被(100ng/孔)過夜，用6只小鼠的抗nd1d2、抗qm1和抗qm2混合血清的1/20稀釋液預(yù)溫育。使用免疫前混合血清作為免疫對(duì)照。洗滌后，滴定板與來自hdm過敏患者的個(gè)體血清(1/20和1/50稀釋)或混合血清(1/50稀釋)溫育。結(jié)合的ige抗體用1/2000稀釋的辣根過氧化物酶(hrp)標(biāo)記的抗人igemab(southern,birmingham,al)和鄰苯二胺(sigma)檢測(cè)。阻斷能力表示為不加入小鼠血清的孔的信號(hào)百分比。雜合蛋白免疫產(chǎn)生的特異性小鼠抗體能夠以不同的方式阻斷9名螨過敏患者的ige與純化的nderp1和nderp2的等摩爾混合物(nd1d2)的結(jié)合。用小鼠抗nd1d2抗體獲得的抑制為41-72％(均數(shù)56％)，而小鼠抗qm1和抗qm2抗體對(duì)血清ige與nd1d2的結(jié)合的抑制分別為43-82％(均數(shù)60％)以及0-45％(均數(shù)20％)(表i)。使用小鼠抗nd1d2抗體獲得的抑制稍低于(盡管沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；p＝0.139)使用小鼠抗qm1抗體獲得的抑制。小鼠抗qm2組中獲得的抑制與在抗nd1d2和抗qm1組中獲得的抑制有顯著的差異(p<0.01)。表i:nd1d2-、qm1-和qm2-特異性小鼠igg抗體對(duì)患者ige與nd1d2結(jié)合的抑制百分比。§與抗nd1d2組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異(p＝0.139)。*與抗nd1d2和抗qm1組有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異(p<0.01)。另外，使用來自30名hdm過敏患者的混合血清評(píng)價(jià)小鼠阻斷抗血清(圖14b)。針對(duì)qm1和qm2產(chǎn)生的小鼠igg抑制血清ige與nd1d2結(jié)合分別達(dá)71％和26％，而使用小鼠抗nd1d2抗體或免疫前血清獲得的抑制分別為65％和17％(圖14b)。qm2誘導(dǎo)的igg對(duì)ige反應(yīng)性的部分抑制是由于特異性ige對(duì)derp2的抑制非常小而引起的?？筿m2igg抗體干擾患者ige與derp2結(jié)合的能力大大低于抗qm1血清(分別為13和85％)。相反，在兩種小鼠抗血清中對(duì)ige與derp1結(jié)合的抑制是相當(dāng)?shù)?抗qm2的抑制:52％；抗qm1的抑制:52％)(圖14b)。用各種雜合蛋白誘導(dǎo)的igg抑制hdm過敏患者血清的ige與nd1d2的結(jié)合，盡管qm1誘導(dǎo)的igg顯示的抑制能力高于用qm2誘導(dǎo)的igg。如使用qm2誘導(dǎo)的抗血清所見到的這種僅部分抑制ige反應(yīng)性也見于phlp2-同源嵌合體[(30)mothes-luksch,n.,stumvoll,s.,linhart,b.,focke,m.,krant,m-t.,hanswirth,a.,valent,p.,verdino,p.,keller,w.,grote,m.,valenta,r.(2008).disruptionofallergenicactivityofthemajorgrasspollenallergenphlp2byreassemblyasmosaicprotein(通過再組裝為嵌合蛋白破壞主要青草花粉變應(yīng)原phlp2的變應(yīng)原活性).jimmunol181,4864-4873]。在該文中，作者認(rèn)為可能由于ige表位的破壞，導(dǎo)致因此不能誘導(dǎo)針對(duì)原始ige表位的igg。對(duì)于qm2可能是這種情況，因?yàn)閕ge與derp2結(jié)合的igg阻斷活性非常低，并且此雜合蛋白的ige反應(yīng)性幾乎消失。小鼠抗nd1d2抗體抑制ige與其自身的結(jié)合的低能力(60-65％；表i和圖14b)類似于對(duì)derp2特異性ige的報(bào)道[chen,k-w.,fuchs,g.,sonneck,k.,gieras,a.,swoboda,i.,douladiris,n.,linhart,b.,jankovic,m.,pavkov,t.,keller,w.,papadopoulos,n.g.,valent,p.,valenta,r.,vrtala,s.(2008).reductionoftheinvivoallergenicityofderp2,themajorhouse-dustmite,bygeneticengineering(通過遺傳工程減小主要屋塵螨derp2的體內(nèi)變應(yīng)原性).molimmunol.45,2486-2498]。鼠igg和人ige對(duì)螨變應(yīng)原的應(yīng)答的特異性之間的這些差異可部分地受不同的免疫方式的影響，如之前由chapman等(1987)所報(bào)道的那樣[chapman,m.d.,heymann,p.w.,platts-mills,t.a.e.(1987).epitopemappingoftwomajorinhalantallergens,derp1andderp2,frommitesofthegenusdermatophagoides(來自塵螨屬螨的兩種主要吸入性變應(yīng)原derp1和derp2的表位作圖).jimmunol.139,1479-1484]。在通過含有佐劑的ip注射液免疫的小鼠中，抗原被很大程度地加工，而在通過吸入微量的變應(yīng)原而無佐劑致敏的人中，進(jìn)行有限的變應(yīng)原加工或不同形式的加工。qm1和qm2兩者均顯示很高的t細(xì)胞刺激能力，并且與單獨(dú)分子相比誘導(dǎo)較強(qiáng)的保護(hù)性抗體應(yīng)答。從上可以得出結(jié)論，雜合蛋白qm1和qm2是兩種低變應(yīng)原性分子，能夠開發(fā)出針對(duì)歐洲塵螨過敏的令人滿意的免疫治療。施用方法本發(fā)明涵蓋上述低變應(yīng)原性嵌合體或由其衍生的合成肽在哺乳動(dòng)物中的脫敏治療中的應(yīng)用。脫敏方法涉及通過胃腸外(皮下、靜脈內(nèi)或肌內(nèi))、吸入、口服、舌下、經(jīng)鼻或經(jīng)直腸途徑反復(fù)施用所討論的變應(yīng)原。嵌合體可根據(jù)當(dāng)前法律和適用的臨床程序單獨(dú)施用或與藥學(xué)可接受的稀釋劑和賦形劑聯(lián)合施用。當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12