本發(fā)明涉及一種可用于富集人l1cam蛋白的抗原多肽和單克隆抗體。

背景技術(shù)：

現(xiàn)有的能夠富集人l1cam(神經(jīng)細胞黏附分子l1)蛋白的抗體，抗原是來源于16周人胎腦懸浮液，對于一般的抗體生產(chǎn)和研發(fā)公司來說，要想得到同樣來源的抗原是很難的，而且用16周左右的人胎腦懸浮液免疫后，后期的單抗的篩選方法比較復(fù)雜，而且篩選難度很大，成本較高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種可用于富集人l1cam蛋白的抗原多肽和單克隆抗體。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種可用于富集人l1cam蛋白的抗原多肽，氨基酸序列如seqidno:1所示。

一種可用于富集人l1cam蛋白的抗原多肽，氨基酸序列如seqidno:2所示。

一種可用于富集人l1cam蛋白的單克隆抗體，包括以下步驟的方法制備：

a、將抗原多肽偶聯(lián)到klh蛋白上；

b、將偶聯(lián)好的多肽-khl偶聯(lián)物通過sepdexg250進行純化；

c、純化后免疫小鼠，之后進行細胞融合；

d、對融合后的細胞進行篩選；

e、將篩選的細胞株進行亞克隆，挑選單克隆細胞，并對表達的抗體進行生物學(xué)活性驗證；

f、對生物活性驗證過的細胞株進行抗體制備。

作為優(yōu)選方式，所述步驟c中，免疫小鼠，按照80ug/只/次的劑量進行皮下注射免疫，共免疫四次，每次免疫的時間間隔為2周，初次免疫用完全佐劑，隨后的3次免疫用不完全佐劑，免疫結(jié)束后，采集免疫小鼠血清進行抗體的免疫效價以及生物學(xué)功能監(jiān)測，選擇最合適的小鼠進行最終的加強免疫，加強免疫為不用任何佐劑，直接按照50ug劑量進行小鼠腹腔免疫。

本發(fā)明涉及兩條多肽，cd-17(cregsqrkhskrhihkd)和cy-17(cnqssytqwdlqpdtdy)。我們對l1cam進行蛋白結(jié)構(gòu)進行分析，利用相關(guān)抗原設(shè)計軟件對l1cam蛋白進行抗原表位設(shè)計，最終從l1cam截取了regsqrkhskrhihkd和nqssytqwdlqpdtdy肽段，為了便于偶聯(lián)載體蛋白，在肽段的前面加上半胱氨酸(c).

其中cd-17是人鼠同源的序列，可以用鼠標本代替人標本來檢測抗體的活性，本實驗中用鼠的腦組織裂解液來驗證了cd-17的幾個抗體對人l1cam蛋白wb檢測陽性的可能性，確定了我們篩選的cd-17抗原產(chǎn)生的單克隆抗體具有良好的wb檢測功能.我們通過兩個多肽的免疫，獲得最終分別獲得了針對cd-17和cy-17的單克隆抗體，其中針對cd-17多肽的單克隆抗體不但可以用來富集l1cam蛋白，還可以用于l1cam蛋白的wb檢測。針對cy-17多肽的單克隆抗體僅僅可以用來富集l1cam蛋白。

抗體篩選方法以及活性驗證的設(shè)計：在篩選方法中，我們巧妙的實驗設(shè)計節(jié)省了篩選成本，繞過了篩選過程的最大障礙。

常規(guī)富集痕量蛋白的方法是，用蛋白對應(yīng)的具有ip生物活性的抗體偶聯(lián)在磁珠上，然后用這個磁珠分散在樣品血漿或者裂解液中，通過抗原抗體的相互作用，形成磁珠-抗體-抗原復(fù)合物，然后在一定磁場的作用下，磁珠-抗體-抗原復(fù)合物被收集起來，然后洗脫下抗原，就完成了抗原富集。

我們小鼠免疫后，要確定那只小鼠產(chǎn)生的抗體具有類似的ip生物活性功能，不可能將小鼠的血漿抗體偶聯(lián)到磁珠上，一方面是小鼠血漿中，除了很少量的我們抗原刺激產(chǎn)生的目標抗體外，還有小鼠本身的igg以及其他復(fù)雜的蛋白成分，這么多無效的成分偶連的磁珠，是不能實現(xiàn)富集抗原的目的。如果我們先把小鼠血清中的有效目的抗體純化出來再偶聯(lián)，也不現(xiàn)實，因為一般從小鼠采集的小鼠血樣有20ul血清，純化出的目的抗體量也不能用來偶聯(lián)磁珠來富集抗原，而且購買磁珠自己偶聯(lián)成本太高，我們要監(jiān)測的樣本量也相對比較大(4個項目，20只小鼠)。

我們的巧妙設(shè)計的能幫助我們在細胞融合前，就能得知那些小鼠產(chǎn)生的多抗抗體可以直接能富集人的l1cam蛋白，準確的選定待融合陽性實驗小鼠，在后續(xù)單克隆抗體的篩選過程中，也能在早期確定哪些些單克隆抗體具備我們想要的生物學(xué)功能的，從而有目的的選擇一些有價值的細胞進行亞克隆，提高工作效率，降低成本。

綜上所述，由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明所采用的多肽抗原，合成簡單，成本較低，很容易獲得，本發(fā)明所涉及的抗體篩選方法，設(shè)計巧妙，避免了人血漿中的igg對篩選的影響。

本發(fā)明采用設(shè)計多肽抗原免疫，巧妙的抗體篩選設(shè)計，以一種非常簡單的方式就獲得具有與16周左右的人胎腦懸浮液免疫原獲得的具有富集人l1cam蛋白相同功能活性的抗體，而且有些抗體還可以用于wb方式識別人l1cam的各種形式蛋白的生物學(xué)功能。

附圖說明

本發(fā)明將通過例子并參照附圖的方式說明，其中：

圖1是本發(fā)明實施例2dnastar軟件分析結(jié)果圖；

圖2是本發(fā)明實施例2檢測一結(jié)果圖；

圖3是本發(fā)明實施例2檢測二結(jié)果圖；

圖4是本發(fā)明實施例2檢測三結(jié)果圖；

圖5是本發(fā)明實施例2檢測四結(jié)果圖。

具體實施方式

本說明書中公開的所有特征，或公開的所有方法或過程中的步驟，除了互相排斥的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。

本說明書中公開的任一特征，除非特別敘述，均可被其他等效或具有類似目的的替代特征加以替換。即，除非特別敘述，每個特征只是一系列等效或類似特征中的一個例子而已。

實施例1：

l1cam蛋白的抗原表位分析：利用dnastar軟件，通過分析蛋白各區(qū)段的抗原性、表面暴露性、親水性、以及柔性，確定l1cam的1071-1086位氨基酸regsqrkhskrhihkd和第854-869位氨基酸regsqrkhskrhihkd兩段各16個氨基酸作為合成的氨基酸序列，為方便偶聯(lián)到載體上，在兩段多肽的n端各加上半胱氨酸(cys)得到(c)nqssytqwdlqpdtdy，(c)regsqrkhskrhihkd根據(jù)多肽首尾字母以及多肽數(shù)目分別命名為cy-17和cd-17。

多肽的合成，自動合成儀合成并純化；將兩段合成的多肽采用edc偶聯(lián)方法與載體蛋白klh偶聯(lián)，形成cy-17-klh和cd-17-klh偶聯(lián)物，然后在ph7.4的pbs里透析換液。

抗體制備方法以及流程：

1、純后將與佐劑乳化好的cd-17-klh和cy-17-klh按照80ug/只/次的劑量進行皮下注射免疫，共免疫四次，每次免疫的時間間隔為2周，初次免疫用完全佐劑，隨后的3次免疫用不完全佐劑，免疫結(jié)束后，采集免疫小鼠血清進行抗體的免疫效價以及生物學(xué)功能檢測。選擇血清效價高又滿足生物學(xué)活性要求的小鼠進行最終的加強免疫，加強免疫為不用任何佐劑，直接按照50ug劑量進行小鼠腹腔免疫。三天后進行細胞融合。

2、對融合后的細胞進行篩選，并對篩選到的陽性克隆進行生物活性檢測，看能否很好的與人新鮮血漿中的l1cam進行很好的結(jié)合。

3、將具有良好生物學(xué)功能的細胞株進行亞克隆，多次亞克隆后，挑選單克隆細胞，并對表達的抗體進行生物學(xué)活性驗證。

4、對生物活性驗證過的細胞株進行抗體制備，并再次進行活性驗證，以確保所生產(chǎn)抗體的質(zhì)量。

實施例2：

利用dnastar軟件分析l1cam胞外區(qū)蛋白序列的相關(guān)區(qū)域的抗原性、表面暴露性、親水性、以及柔性，確定l1cam的1071-1086位氨基酸regsqrkhskrhihkd和第854-869位氨基酸regsqrkhskrhihkd兩段各16個氨基酸作為合成的氨基酸序列，附圖1所示。

免疫后采集小鼠血清，進行效價檢測，結(jié)果如下:

具有生物活性的單抗細胞株篩選，用細胞培養(yǎng)上清進行生物活性檢測：

檢測一，wb，上樣樣品：鼠腦組織列解液，一抗為細胞培養(yǎng)上清，二抗：羊抗鼠-hrp1：5000，箭頭位置表示目的條帶位置，。

檢測二，ip-wb，上樣樣品：細胞培養(yǎng)上清富集的人血清的l1cam，一抗為抗人l1cam抗體1:2000，二抗：羊抗鼠-hrp1：5000，其中陽性對照為5ug可以富集人血清的l1cam的商業(yè)化抗體體富集的人血清的l1cam，商業(yè)化抗體來自abcam，([uj127](ab3200))。

檢測三，ip-wb，上樣樣品：細胞培養(yǎng)上清富集的人血清的l1cam，一抗為抗人l1cam抗體1:2000，二抗：羊抗鼠-hrp1：5000。

cy-17和cd-17陽性克隆所生產(chǎn)抗體的生物活性功能驗證：

檢測四，ip-wb，上樣樣品：、cy-17和cd-17各個陽性克隆所生產(chǎn)抗體和陽性對照抗體(pc)各5ug富集人血清的l1cam，一抗為抗人l1cam抗體1:2000，二抗：羊抗鼠-hrp1：5000，陽性對照抗體來自abcam([uj127](ab3200))。

從抗體的活性驗證的結(jié)果來看，我們cy-17和cd-17兩條多肽所獲得的多個單克隆抗體均具有和知名生物公司abcam的商業(yè)化抗體相同的生物學(xué)功能。

實施例3：

1、用proteinabeads吸附抗l1cam的igg:

a在免疫血清檢測階段:用proteinabeads吸附少量(5ul)免疫鼠血清抗體4h，形成proteina-igg復(fù)合物(這里proteina只結(jié)合igg抗體，包括我們抗原刺激出來的igg，但不會結(jié)合血清中的其他蛋白成分)。

b在細胞株篩選階段，用proteinabeads吸附細胞培養(yǎng)上清，形成proteina-igg復(fù)合物，由于培養(yǎng)上清中的培養(yǎng)上清的igg濃度很低，所以我們用proteinabeads吸附1ml細胞培養(yǎng)上清。

c在抗體驗證階段，我們用proteinabeads吸附5ug抗體。

各個階段，我們在用proteinabeads吸附抗l1cam的igg過程中，均做了陽性對照實驗，以來自abcam([uj127](ab3200))的抗l1cam抗體作為陽性對照抗體，用來吸附l1cam。

2、用過量的proteinabeads預(yù)選吸附處理新鮮人血漿，盡可能的去除人血漿中的igg，排除人血漿中的人igg對整個實驗的干擾。

3、用步驟1所述的proteinabeads-igg復(fù)合物來吸附步驟2預(yù)吸附處理新鮮人血漿的l1cam蛋白，4度過夜吸附。

4、用預(yù)冷的pbs洗滌proteinabeads-igg-l1cam復(fù)合物3次，然后將洗滌過的proteinabeads-igg-l1cam復(fù)合物加上等體積的2xsds變性buffer，95度煮沸5min。

5、將煮沸后的樣品5000rpm離心5min，吸取上清，進行電泳，然后進行wb檢測，利用l1cam蛋白的wb檢測抗體作為一抗，配合相應(yīng)的二抗。

序列表

<110>四川百利藥業(yè)有限責任公司

<120>一種可用于富集人l1cam蛋白的單克隆抗體及其制備方法

<160>2

<210>1

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

cysarggluglyserglnarglyshisserlysarghisilehislysasp

151015

<210>2

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<400>2

cysasnglnsersertyrthrglntrpaspleuglnproaspthrasptyr

151015