專利名稱：一種靶向粘附殼聚糖材料及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤治療的核酸藥物，具體地說是應(yīng)用一種具有靶向粘附性的天然多
糖材料制備成納米載體，能有效保護(hù)和靶向性運(yùn)輸核酸藥物進(jìn)入細(xì)胞，并實(shí)現(xiàn)釋放。
背景技術(shù)：
基因治療在替代功能障礙基因和腫瘤治療方面具有良好的應(yīng)用前景。基因治療有 3個(gè)基本要素目的基因、表達(dá)載體和遞送載體。以RNA[dsRNA或小RNA(siRNA、 microRNA 或shRNA)]為目的基因介導(dǎo)的RNA干擾(RNAinterference)是特異性結(jié)合與其序列互補(bǔ)的 信使RNA(mRNA)，經(jīng)核酸酶降解mRNA而阻斷其編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)基因沉默，因而在癌 癥和流感、肝炎等病毒感染疾病治療領(lǐng)域有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。但裸的小RNA血 液穩(wěn)定性差、難以進(jìn)入細(xì)胞且可引起非特異性免疫剌激，而限制了其臨床應(yīng)用。同樣，以質(zhì) 粒DNA為表達(dá)載體包裝siRNA形成的shRNA能否安全有效地運(yùn)載基因到指定地點(diǎn)決定了基 因治療在臨床上應(yīng)用的成敗。 為解決DNA或RNA的遞送這一瓶頸問題，近年來人們開展了基因遞送方法和遞送 載體的研究。其中基因槍法、電穿孔法、聲穿孔法、激光照射法、磁轉(zhuǎn)換法等物理和機(jī)械運(yùn)輸 方法存在組織穿透力差、毒性及侵蝕性、潛在副作用、效率低等缺陷。而腺病毒、腺相關(guān)病 毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒等病毒載體又有免疫原性強(qiáng)、基因裝載量小、制備工藝復(fù)雜、價(jià)格昂 貴、純化及質(zhì)量監(jiān)控困難、潛在的毒性和致癌性、靶向特異性差、儲藏不穩(wěn)定等弊病。普遍使 用的非病毒載體中的陽離子脂質(zhì)體經(jīng)靜脈注射進(jìn)入體內(nèi)后，首先與血清蛋白結(jié)合，易被單 核巨噬細(xì)胞作為異物吞噬，很難進(jìn)入靶細(xì)胞，其本身也具有一定毒性，制備產(chǎn)率低。其它非 病毒載體如聚乙烯亞胺、聚賴氨酸等也存在著穩(wěn)定性差和毒性等不足。通過對比發(fā)現(xiàn)，膠
原、殼聚糖等天然材料是優(yōu)良的基因載體，但轉(zhuǎn)染效率較低的缺點(diǎn)阻礙了其進(jìn)一步在基因 治療中的應(yīng)用。 殼聚糖作為天然多糖中唯一的堿性多糖，除具有生物相容性好、可生物降解，無毒 等特點(diǎn)之外，比膠原還有著潛在的物理化學(xué)修飾性，可以通過增加靶向修飾而提高基因的 轉(zhuǎn)染效率。然而通常氨基較羥基的反應(yīng)活性更高，常被利用作為接枝反應(yīng)位點(diǎn)，以犧牲殼聚 糖分子鏈上的部分氨基為代價(jià)就是犧牲了殼聚糖獨(dú)有的生物活性，也影響了它作為載體的
基因容量。 因此，本發(fā)明應(yīng)用一種新型羥基選擇性修飾的靶向粘附殼聚糖改性材料作為基因 載體，賦予了殼聚糖載體新的耙向粘附功能，克服同類耙向材料利用EDC、 NHS接枝在氨基， 占用基因容量、影響接枝效率的不足(粘附肽同時(shí)具有氨基和羧基，也容易自我連接，增大 空間位阻)；也克服了同類靶向材料作為載體的毒性問題[Nucleic Acids Research, 2004， 32(19) ， e149]。并且通過接枝親水性肽，增強(qiáng)了殼聚糖在近中性環(huán)境下的溶解性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種新型羥基選擇性修飾的靶向粘附殼聚糖材料的應(yīng)用，本發(fā)明把一種易于制備、穩(wěn)定、生物相容性好、有生物活性、安全(無毒、可降解)、可溶解的靶 向粘附殼聚糖材料，應(yīng)用作為DNA、 RNA等核酸藥物的納米載體，以增強(qiáng)對其保護(hù)作用和靶 向粘附腫瘤細(xì)胞的運(yùn)輸，使其更好地實(shí)現(xiàn)基因治療功能。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為； —種靶向粘附殼聚糖材料的應(yīng)用，首先經(jīng)光化學(xué)激活的基團(tuán)選擇性接枝細(xì)胞粘附 性肽得到的改性殼聚糖材料，再與帶負(fù)電荷的DNA(20bp-10kb)和RNA[dsRNA(500-700bp)、 小RNA (siRNA、 microRNA或shRNA)]等核酸藥物通過自組裝的方法制備成粒徑在 100-500nm、表面荷正電10_30mV的納米顆粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞并實(shí)現(xiàn)釋放，達(dá)到疾病治療效果。
所述細(xì)胞粘附肽為含有細(xì)胞粘附因子RGD (Arg-Gly-Asp)序列的多肽GRGDY， RGD 作為整合素的受體，其選擇性部分依賴于RGD的構(gòu)象以及RGD周圍的氨基酸殘基；其序列 為RGD四肽、五肽、六肽、RGD環(huán)肽、雙線肽或RGD模擬肽，肽鏈長度范圍在3-12個(gè)氨基酸殘 基，它們均可以采用所述方法接枝到殼聚糖上，都是采用光敏性交聯(lián)劑的-NHS酯鍵斷裂與 肽鏈的_NH2發(fā)生反應(yīng)重新生成酰胺鍵，可制備出安全、無毒、可降解、生物相容性好、有生物 學(xué)功能、在弱酸性條件下溶解的靶向粘附殼聚糖材料；其結(jié)構(gòu)單元為 其中R為去掉Ce-OH的CTS分子。 所述靶向粘附殼聚糖材料與DNA或小RNA通過自組裝方式形成穩(wěn)定、粒徑 100-500nm、表面荷正電10_30mV的納米顆粒，能夠保護(hù)DNA或RNA等免受相應(yīng)酶降解，且利 于轉(zhuǎn)染細(xì)胞并在胞內(nèi)釋放。 所述自組裝方式的操作條件為，靶向粘附殼聚糖質(zhì)量濃度0.01mg/ml-lg/ml， DNA或RNA摩爾濃度都是lnM-lM，在pH5. 0-6. 0的NaAc-HAc條件下，通過磁力攪拌，在 10min-24h自組裝成納米顆粒。所述核酸藥物為20bp-10kb的DNA ;所述RNA為500-700bp的dsRNA或小RNA，包 括19bp-25bp的siRNA、20-24bp的microRNA、或19bp-29bp的shRNA。
所述核酸藥物為用于治療腫瘤的藥物。 所述殼聚糖上光化學(xué)交聯(lián)細(xì)胞粘附性肽的過程為，在雙功能光敏性交聯(lián)劑的作用 下，通過紫外光化學(xué)激活的基團(tuán)選擇性接枝反應(yīng)，將細(xì)胞粘附性肽接枝到殼聚糖的羥基上， 在無需氨基保護(hù)和脫保護(hù)的繁瑣反應(yīng)條件下可保留氨基活性，通過透析方法分離未反應(yīng)物 質(zhì)，冷凍干燥或真空干燥得生物相容性好、可降解、可溶解的靶向粘附殼聚糖材料；
具體步驟如下 1)按光敏交聯(lián)劑與殼聚糖中氨基葡萄糖殘基的物質(zhì)量之比為l : 1-1 : 50計(jì)量， 稱取光敏交聯(lián)劑，加入到水、水_乙醇或pH7. 0-9. 0緩沖液中，得光敏交聯(lián)劑溶液；
隨后向光敏交聯(lián)劑溶液中加入細(xì)胞粘附性肽的水溶液或緩沖液，光敏交聯(lián)劑與細(xì) 胞粘附性肽的物質(zhì)量之比為1 : 1-1 : 50，光敏交聯(lián)劑終濃度liim-10M，室溫下避光反應(yīng)60-120min，形成細(xì)胞粘附性肽_光敏交聯(lián)劑及未反應(yīng)的原料的混合液； 所述光敏交聯(lián)劑為兩端分別具有特征基團(tuán)-NHS與_N3的sulfo-SANPAH、 SANPAH、
ANB-NOS或sulfo-SAND ; 2)按光敏交聯(lián)劑與殼聚糖中氨基葡萄糖殘基的物質(zhì)量之比為l : 1-1 : 50計(jì)量， 向上述混合液加入殼聚糖溶液，充分混勻后，光照4min-120min ; 所述殼聚糖溶液為0. 1-4 % w/v殼聚糖溶液，Mw = 10kDa-1500kDa， DD = 40% -98% ; 3)將上述反應(yīng)后的混合溶液加入到透析袋中，殼聚糖分子量>透析袋的截留分子
量麗CO >肽鏈和交聯(lián)劑的分子量，透析至透析出的水溶液在254nm與220nm檢測不到紫外
吸收變化時(shí)，再將透析袋內(nèi)得到的溶液冷凍干燥或真空干燥，得到產(chǎn)物。所述緩沖液為pH7. 0-9. 0，無氨基緩沖液20mM磷酸鈉緩沖液，0. 15M NaCl ;20mM
HEPES ;100mM碳酸鹽/重碳酸鹽緩沖液；或者50mM硼酸鹽緩沖液； 所述光敏交聯(lián)劑與細(xì)胞粘附性肽的物質(zhì)量之比l : 1-1 : IO;光敏交聯(lián)劑終濃度 100 ii m-2M ;400W > UV > 6W， 290_460nm。 本發(fā)明應(yīng)用靶向粘附殼聚糖新材料作為核酸藥物載體具有如下優(yōu)點(diǎn) 1.采用小分子交聯(lián)劑和細(xì)胞粘附肽，便于與反應(yīng)的中間產(chǎn)物以及未交聯(lián)的化學(xué)交
聯(lián)劑、肽分離，使產(chǎn)品純化的同時(shí)，降低化學(xué)毒性。 2.采用小分子交聯(lián)劑和粘附肽，減小空間位阻，通過自組裝制備出的納米顆粒粒 徑100nm-500nm之間。并且表面帶荷正電10_30mV，易于穿透帶負(fù)電的細(xì)胞膜，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn) 染。 3.接枝位置在殼聚糖的羥基，不占用氨基。使更多的氨基因質(zhì)子化作用帶正電荷， 從而復(fù)合更多帶負(fù)電荷的核酸藥物。 4.連接的粘附肽呈親水性，因此改性材料在弱酸性條件下溶解性更好，便于納米 載體在生理環(huán)境下的應(yīng)用。 5.用于核酸藥物載體的材料，其改性的反應(yīng)條件溫和，快速，其制備納米載體工藝 簡便易行。 6.以殼聚糖為基礎(chǔ)材料，靶向修飾后作為基因載體，承襲了殼聚糖載體的優(yōu)點(diǎn)，功 能卻進(jìn)一步增強(qiáng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示新材料無細(xì)胞毒性，便于降解釋放，轉(zhuǎn)染效率和保護(hù)效 率達(dá)到商品化脂質(zhì)體的水平。


圖1為根據(jù)實(shí)施例1得到GRGD-SANPAH-CTS/miRNA納米顆粒透射電鏡圖。證明形 成了粒徑在200-300nm的、適合細(xì)胞轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定納米顆粒。 圖2為根據(jù)實(shí)施例2得到的RGD環(huán)肽-SANPAH_CTS/siRNA的粒徑分布。證明形成 了粒徑在100nm-500nm的、適合細(xì)胞轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定納米顆粒。納米顆粒得粒徑分散度好。
圖3為根據(jù)實(shí)施例3得到的GRGDY-SAND-CTS/DNA的聚丙烯凝膠電泳圖譜。證明 所載DNA被保護(hù)，防止酶的降解(3泳道為DNA對照)。 圖4為根據(jù)實(shí)施例4得到的GRGDY-SANPAH-CTS/siRNA轉(zhuǎn)染效果的激光共聚焦照 片。表明新材料作為基因載體，可保護(hù)裸基因并轉(zhuǎn)染細(xì)胞，而裸siRNA在進(jìn)入細(xì)胞后會被核
6酸酶降解(3h以上被完全降解)。其效果可達(dá)到商品化脂質(zhì)體的水平。(粒徑< 2 i！ m即可 進(jìn)細(xì)胞，< 500nm基因載體效果更好)。另外，細(xì)胞狀態(tài)良好，說明修飾材料透析過程已除去 化學(xué)試劑，對細(xì)胞安全無毒性。
具體實(shí)施例方式
在殼聚糖分子上基團(tuán)選擇性地接枝含細(xì)胞粘附因子RGD的多肽GRGDY，具體地說 是利用雙功能(N-羥基琥珀酰亞胺/疊氮化物)光敏性交聯(lián)劑sulfo-SANPAH，在殼聚糖 C6-0H修飾親水性GRGDY來增加材料的靶向粘附性和水溶性；同時(shí)被保留的C廠叫，在弱酸 環(huán)境中進(jìn)行氨基質(zhì)子化帶正電荷，進(jìn)一步利用靜電交聯(lián)原理復(fù)合更多帶負(fù)電的核酸藥物， 形成穩(wěn)定的納米顆粒。由于含細(xì)胞粘附因子RGD的多肽有靶向腫瘤表面過表達(dá)的整合素受 體的特性，因此可以實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的靶向運(yùn)輸。
具體步驟為 1.細(xì)胞粘附肽與光敏交聯(lián)劑在全水體系或水與乙醇或乙醇的體系中，兩者連接后 再加入CTS溶液，通過UV光化學(xué)激活4-120min，制備得到新材料細(xì)胞粘附肽_光敏交聯(lián) 劑-殼聚糖。 2.將上述反應(yīng)后的混合溶液加入到透析袋中，殼聚糖分子量>透析袋的截留分子 量麗CO >肽鏈和交聯(lián)劑的分子量，透析至透析出的水液體在254nm與220nm檢測不到紫外 吸收變化時(shí)，再將透析袋內(nèi)得到的溶液冷凍干燥，得到產(chǎn)物。 3.將產(chǎn)物與小RNA(siRNA、 miRNA)或DNA利用靜電作用原理在弱酸性(pH5. O-pH 6. 0)條件下，通過磁力攪拌，自組裝成納米顆粒。 4.將納米粒進(jìn)行粒徑、電位檢測，所得納米顆粒適合轉(zhuǎn)染；經(jīng)聚丙烯凝膠電泳檢
測其穩(wěn)定性良好。 5.能有效轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 6.動物實(shí)驗(yàn)取得明顯治療效果。 靶向粘附殼聚糖材料的制備例1 1.室溫下，將0. lg殼聚糖(Mw = 1500kDa， DD = 40% )溶解于100mL摩爾濃度 0. 05M的醋酸水溶液中，將溶液pH調(diào)整到pH5. 0，形成透明的0. 1 % (w/v)殼聚糖溶液；
2.稱取光敏交聯(lián)劑SANPAH(按光敏交聯(lián)劑與殼聚糖中氨基葡萄糖殘基的物質(zhì)量 之比為l : 1計(jì)量)，加入到乙醇中，隨后向光敏交聯(lián)劑溶液中加入SANPAH與RGD環(huán)肽物質(zhì) 量之比為1 : 2的RGD環(huán)肽水溶液，光敏交聯(lián)劑終濃度10 ii M。室溫下避光反應(yīng)90min，形 成RGD環(huán)肽-SANPAH及未反應(yīng)的原料的混合液； 3.按光敏交聯(lián)劑與殼聚糖中氨基葡萄糖殘基的物質(zhì)量之比為1 : 1的量，在RGD
環(huán)肽-SANPAH及其原料混合物中加入殼聚糖溶液，充分混勻后，UV光照4min。 4.將上述反應(yīng)混合溶液加入到截留分子量=14kDa的透析袋中，透析至透析出的
水溶液在254nm與220nm檢測不到紫外吸收變化。 5.將透析袋內(nèi)得到溶液冷凍干燥，得到產(chǎn)物。 靶向粘附殼聚糖材料的制備例2 1.室溫下，將4g殼聚糖(Mw = 10kDa， DD = 60% )溶解于100mL摩爾濃度0. 1M 的醋酸水溶液中，將溶液pH調(diào)整到pH5. 5，形成透明的4% (w/v)殼聚糖溶液；敏交聯(lián)劑SANPAH(按光敏交聯(lián)劑與殼聚糖中氨基葡萄糖殘基的物質(zhì)量 之比為l : 6計(jì)量)，加入到乙醇中，隨后向光敏交聯(lián)劑溶液中加入SANPAH與GRGD物質(zhì)量 之比為1 : 20的GRGD水溶液，光敏交聯(lián)劑終濃度0. lmM。室溫下避光反應(yīng)120min，形成 GRGD-SANPAH及未反應(yīng)的原料的混合液； 3.按光敏交聯(lián)劑與殼聚糖中氨基葡萄糖殘基的物質(zhì)量之比為1 : 6的量，在 GRGD-SANPAH及其原料混合物中加入殼聚糖溶液，充分混勻后，UV光照30min。
4.將上述反應(yīng)混合溶液加入到截留分子量=14kDa的透析袋中，透析至透析出的 水溶液在254nm與220nm檢測不到紫外吸收變化。 5.將透析袋內(nèi)得到溶液冷凍干燥，得到產(chǎn)物。證實(shí)此方法適用于同類含RGD的肽
和同類光敏性交聯(lián)劑。 靶向粘附殼聚糖材料的制備例3 1.室溫下，將lg殼聚糖(Mw = 148kDa，DD = 80% )溶解于lOOmL摩爾濃度O. 05M 的醋酸水溶液中，將溶液pH調(diào)整到pH4. 5，形成透明的1 % (w/v)殼聚糖溶液；
2. sulfo-SANPAH與GRGDY按物質(zhì)量之比為1 : 1，分別加入到水中，光敏交聯(lián)劑終 濃度2M， GRGDY與sulfo-SANPAH在室溫下避光反應(yīng)120min，形成GRGDY-SANPAH及其未反 應(yīng)的原料的混合液； 3.按光敏交聯(lián)劑與殼聚糖中氨基葡萄糖殘基的物質(zhì)量之比為1 : 2的量，在 GRGDY-SANPAH及其原料混合物中加入殼聚糖溶液，充分混勻后，UV光照15min。
4.將上述反應(yīng)混合溶液加入到截留分子量=14kDa的透析袋中，透析至透析出的 水溶液在254nm與220nm檢測不到紫外吸收變化。 5.將透析袋內(nèi)得到紅色溶液-5(TC冷凍干燥，得到紅色絮狀產(chǎn)物。
實(shí)施例1 1. GRGDY與sulfo-SANPAH在緩沖液體系中，兩者連接后再加入CTS溶液，通過UV 光化學(xué)激活，制備得到新材料GRGDY-SANPAH-CTS (mCTS)。
具體為 1)室溫下，將lg殼聚糖(Mw = 230kDa，DD = 95% )溶解于100mL摩爾濃度0. 1M 的醋酸水溶液中，將溶液pH調(diào)整到pH4. 0，形成透明的1 % (w/v)殼聚糖溶液；
2)稱取光敏交聯(lián)劑sulfo-SANPAH(按光敏交聯(lián)劑與殼聚糖中氨基葡萄糖殘基的 物質(zhì)量之比為l : IO計(jì)量)，加入緩沖液(20mM磷酸鈉緩沖液，0. 15M NaCl)中，隨后向光敏 交聯(lián)劑溶液中加入sulfo-SANPAH與GRGDY物質(zhì)量之比為1 : 10的GRGDY緩沖液(20mM磷酸 鈉緩沖液，O. 15M NaCl)，光敏交聯(lián)劑終濃度5M。室溫下避光反應(yīng)90min，形成GRGDY-SANPAH 及未反應(yīng)的原料的混合液； 3)按光敏交聯(lián)劑與殼聚糖中氨基葡萄糖殘基的物質(zhì)量之比為1 : IO的量，在
GRGDY-SANPAH及其原料混合物中加入殼聚糖溶液，充分混勻后，UV光照60min。 4)將上述反應(yīng)混合溶液加入到截留分子量=14kDa的透析袋中，透析至透析出的
水溶液在254nm與220nm檢測不到紫外吸收變化。5)將透析袋內(nèi)得到紅色溶液-501:冷凍干燥，得到紅色絮狀產(chǎn)物。 2.耙向粘附殼聚糖質(zhì)量濃度O. 01mg/ml，siRNA摩爾濃度lnM在pH5. 5的NaAc-HAc
條件下，通過磁力攪拌，在5h自組裝成200-300nm左右的納米顆粒。(siRNA序列見
8Biomaterials， 2008， 29， 506-512)。 將納米粒進(jìn)行透射電鏡觀察。證明形成了粒徑在100nm-500nm的、適合細(xì)胞轉(zhuǎn)染
的穩(wěn)定納米顆粒。 3. mCTS/siRNA細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染，體外在無血清培養(yǎng)液中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。 1)mCTS/siRNA， siRNA序列見[Biomaterials， 2008， 29， 506-512]，轉(zhuǎn)染步驟見。 2)脂質(zhì)體TKO轉(zhuǎn)染(其步驟依照Mirus TransIT-TKO transfection ReagentProtocol、Biomaterials， 2008， 29， 506-512進(jìn)行)作為陽性對照。
3)裸siRNA轉(zhuǎn)染(上海吉瑪制藥，B01001、B02001產(chǎn)品)為陰性對照。
4.動物試驗(yàn)，將納米粒溶液進(jìn)行小鼠尾靜脈注射，在過表達(dá)整合素受體的腫瘤 細(xì)胞表面，利用RGD序列靶向識別，進(jìn)行受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用，釋放到細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮 作用。(參照脂質(zhì)體動物試驗(yàn)和CTS載體動物試驗(yàn)，[MOLECULAR THERAPY，2006,14(4)， 476-484] ;Genetic Vaccines andTher即y， 2008， 6 :7)，證實(shí)腫瘤明顯縮小，治療效果良好。
實(shí)施例2 1. GRGDY與sulfo-SANPAH在緩沖液體系中，兩者連接后再加入CTS溶液，通過UV 光化學(xué)激活，制備得到新材料GRGDY-SANPAH-CTS (mCTS)。
具體為 1)室溫下，將3g殼聚糖(Mw = 90kDa，DD = 90% )溶解于100mL摩爾濃度0. 05M 的醋酸水溶液中，將溶液pH調(diào)整到pH4. 5，形成透明的3% (w/v)殼聚糖溶液；
2) sulfo-SANPAH與GRGDY按物質(zhì)量之比為1 : 2，分別加入到相同體積的乙醇和 水中，然后混合，光敏交聯(lián)劑終濃度lmM，GRGDY與sulfo-SANPAH在室溫下避光反應(yīng)60min， 形成GRGDY-SANPAH及其未反應(yīng)的原料的混合液； 3)按光敏交聯(lián)劑與殼聚糖中氨基葡萄糖殘基的物質(zhì)量之比為1 : 5計(jì)量，向上述 反應(yīng)混合液加入殼聚糖溶液，充分混勻后，UV光照45min。 4)將上述反應(yīng)混合溶液加入到截留分子量(麗C0) 14kDa透析袋中，透析至透析出 的水溶液在254nm與220nm檢測不到紫外吸收變化，再將透析袋內(nèi)得到的溶液真空干燥，得 到產(chǎn)物。 2.靶向粘附殼聚糖質(zhì)量濃度0. lg/ml， miRNA(上海吉瑪制藥，M05產(chǎn)品)摩爾濃 度O. 1M，在pH5.0的NaAc-HAc條件下，通過磁力攪拌，在24h自組裝成400nm左右的納米顆 粒。 將納米粒進(jìn)行納米粒度儀檢測。證明形成了粒徑在100nm-500nm的、適合細(xì)胞轉(zhuǎn) 染的穩(wěn)定納米顆粒。粒徑分散性良好。
3.mCTS/miRNA細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染。 4.動物試驗(yàn)，將納米粒溶液進(jìn)行小鼠尾靜脈注射，在過表達(dá)整合素受體的腫瘤 細(xì)胞表面，利用RGD序列靶向識別，進(jìn)行受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用，釋放到細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮 作用。(參照脂質(zhì)體動物試驗(yàn)和CTS載體動物試驗(yàn)，[MOLECULAR THERAPY，2006,14(4)， 476-484] ;Genetic Vaccines andTher即y， 2008， 6 :7)，證實(shí)腫瘤明顯縮小，治療效果良好。
實(shí)施例3 1. GRGDY與sulfo-SANPAH在緩沖液體系中，兩者連接后再加入CTS溶液，通過UV光化學(xué)激活，制備得到新材料GRGDY-SANPAH-CTS (mCTS)。
具體為 1)室溫下，將lg殼聚糖(Mw = 50kDa， DD = 80% )溶解于lOOmL摩爾濃度0. 1M 的醋酸水溶液中，將溶液pH調(diào)整到pH6. 0，形成透明的1 % (w/v)殼聚糖溶液；
2)稱取光敏交聯(lián)劑sulfo-SANPAH(按光敏交聯(lián)劑與殼聚糖中氨基葡萄糖殘基的 物質(zhì)量之比為1 : 50計(jì)量)，加入到乙醇中，隨后向光敏交聯(lián)劑溶液中加入sulfo-SANPAH 與GRGDY物質(zhì)量之比為1 : 50的GRGDY水溶液，光敏交聯(lián)劑終濃度1 P M。室溫下避光反應(yīng) 90min，形成GRGDY-SANPAH及未反應(yīng)的原料的混合液； 3)按光敏交聯(lián)劑與殼聚糖中氨基葡萄糖殘基的物質(zhì)量之比為1 : 50計(jì)量，向上述 反應(yīng)混合液加入殼聚糖溶液，充分混勻后，UV光照120min。 4)將上述反應(yīng)混合溶液加入到截留分子量(麗CO) 14kDa透析袋中，透析至透析出 的水溶液在254nm與220nm檢測不到紫外吸收變化，再將透析袋內(nèi)得到的溶液冷凍干燥，得 到產(chǎn)物。 2.耙向粘附殼聚糖質(zhì)量濃度lg/ml， DNA摩爾濃度1M，在p朋.0的NaAc-HAc條件 下，通過磁力攪拌，在lh自組裝成500nm左右的納米顆粒。質(zhì)粒DNA為pGFP、 pCX-EGFP、 pSUPER RNAi system (pSuperior. puro、pSUPER皿neo、 pSUPERIOR、 pSUPER皿neo+gfp)。 過程參考南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007， 27 (5) ， 595-598。 進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)成像。證明所載DNA被保護(hù)，防止酶的降 解(3泳道為DNA對照)。 3.mCTS/DNA細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染，(過程參考?xì)ぞ厶禽d基因納米粒子的研究，2005， 22(6) :1171-117)。 4.動物試驗(yàn)，將納米粒溶液進(jìn)行小鼠尾靜脈注射，在過表達(dá)整合素受體的腫瘤 細(xì)胞表面，利用RGD序列靶向識別，進(jìn)行受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用，釋放到細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮 作用。(參照脂質(zhì)體動物試驗(yàn)和CTS載體動物試驗(yàn)，[MOLECULAR THERAPY，2006,14(4)， 476-484] ;Genetic Vaccines andTher即y， 2008， 6 :7)，證實(shí)腫瘤明顯縮小，治療效果良好。
實(shí)施例4 1. GRGDY與sulfo-SANPAH在緩沖液體系中，兩者連接后再加入CTS溶液，通過UV 光化學(xué)激活，制備得到新材料GRGDY-SANPAH-CTS (mCTS)。
具體為 1)室溫下，將2g殼聚糖(Mw = 230kDa，DD = 95% )溶解于lOOmL摩爾濃度0. 1M 的醋酸水溶液中，將溶液pH調(diào)整到pH4. O，形成透明的2% (w/v)殼聚糖溶液；
2)稱取光敏交聯(lián)劑sulfo-SANPAH(按光敏交聯(lián)劑與殼聚糖中氨基葡萄糖殘基 的物質(zhì)量之比為l : 20計(jì)量)，加入緩沖液(20mM磷酸鈉緩沖液，0. 15M NaCl)中，隨后 向光敏交聯(lián)劑溶液中加入sulfo-SANPAH與GRGDY物質(zhì)量之比為1 : 5的GRGDY緩沖液 (20mM磷酸鈉緩沖液，0. 15M NaCl)，光敏交聯(lián)劑終濃度IOM。室溫下避光反應(yīng)90min，形成 GRGDY-SANPAH及未反應(yīng)的原料的混合液； 3)按光敏交聯(lián)劑與殼聚糖中氨基葡萄糖殘基的物質(zhì)量之比為1 : 20的量，在
GRGDY-SANPAH及其原料混合物中加入殼聚糖溶液，充分混勻后，UV光照90min。 4)將上述反應(yīng)混合溶液加入到截留分子量=14kDa的透析袋中，透析至透析液在
10254nm與220nm檢測不到紫外吸收變化。
5)將透析袋內(nèi)得到紅色溶液-s(rc冷凍干燥，得到紅色絮狀產(chǎn)物。 2.革E向粘附殼聚糖質(zhì)量濃度0.01g/ml， siRNA摩爾濃度10iiM，在pH5.5的
NaAc-HAc條件下，通過磁力攪拌，在lOmin自組裝成300nm左右的納米顆粒。 3. mCTS/siRNA細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染，體外在無血清培養(yǎng)液中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。 1)mCTS/siRNA， siRNA序列見[Biomaterials， 2008， 29， 506-512]，轉(zhuǎn)染步驟見。 2)脂質(zhì)體TKO轉(zhuǎn)染(其步驟依照Mirus TransIT-TKO transfection ReagentProtocol、Biomaterials， 2008， 29， 506-512進(jìn)行)作為陽性對照。
3)裸siRNA轉(zhuǎn)染(上海吉瑪制藥，B01001、B02001產(chǎn)品)為陰性對照。
用激光共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果靶向修飾CTS納米粒與商品化脂質(zhì)體陽性對照一 樣保護(hù)siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，而裸siRNA在進(jìn)入細(xì)胞后會被核酸酶降解(3h以上被完全降 解)。另外，細(xì)胞狀態(tài)良好，說明修飾材料透析過程已除去化學(xué)試劑，對細(xì)胞安全無毒性。
4.動物試驗(yàn)，將納米粒溶液進(jìn)行小鼠尾靜脈注射，在過表達(dá)整合素受體的腫瘤 細(xì)胞表面，利用RGD序列靶向識別，進(jìn)行受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用，釋放到細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮 作用。(參照脂質(zhì)體動物試驗(yàn)和CTS載體動物試驗(yàn)，[MOLECULAR THERAPY，2006,14(4)， 476-484] ;Genetic Vaccines andTher即y， 2008， 6 :7)，證實(shí)腫瘤明顯縮小，治療效果良好。
1權(quán)利要求
一種靶向粘附殼聚糖材料，其特征在于所述殼聚糖上光化學(xué)交聯(lián)細(xì)胞粘附性肽的過程為，在雙功能光敏性交聯(lián)劑的作用下，通過紫外光化學(xué)激活的基團(tuán)選擇性接枝反應(yīng)，將細(xì)胞粘附性肽接枝到殼聚糖的羥基上，在無需氨基保護(hù)和脫保護(hù)的繁瑣反應(yīng)條件下可保留氨基活性，通過透析方法分離未反應(yīng)物質(zhì)，冷凍干燥或真空干燥得生物相容性好、可降解、可溶解的靶向粘附殼聚糖材料。
2. 按照權(quán)利要求1所述的殼聚糖材料，其特征在于所述殼聚糖上光化學(xué)交聯(lián)細(xì)胞粘 附性肽的具體步驟如下，1) 按光敏交聯(lián)劑與殼聚糖中氨基葡萄糖殘基的物質(zhì)量之比為i : i-i : 50計(jì)量，稱取光敏交聯(lián)劑，加入到水、水-乙醇或PH7. 0-9. 0緩沖液中，得光敏交聯(lián)劑溶液；隨后向光敏交聯(lián)劑溶液中加入細(xì)胞粘附性肽的水溶液或緩沖液，光敏交聯(lián)劑與細(xì)胞粘附性肽的物質(zhì)量之比為l : 1-1 : 50，光敏交聯(lián)劑終濃度liim-10M，室溫下避光反應(yīng) 60-120min，形成細(xì)胞粘附性肽_光敏交聯(lián)劑及未反應(yīng)的原料的混合液；所述光敏交聯(lián)劑為兩端分別具有特征基團(tuán)-NHS與-N3的sulfo-SANPAH、 SANPAH、 ANB-NOS或sulfo-SAND ;2) 按光敏交聯(lián)劑與殼聚糖中氨基葡萄糖殘基的物質(zhì)量之比為l : 1-1 : 50計(jì)量，向上 述混合液加入殼聚糖溶液，充分混勻后，光照4min-120min ;所述殼聚糖溶液為0. 1-4% w/v殼聚糖溶液，Mw = 10kDa-1500kDa， DD = 40% -98% ;3) 將上述反應(yīng)后的混合溶液加入到透析袋中，殼聚糖分子量>透析袋的截留分子量 麗CO >肽鏈和交聯(lián)劑的分子量，透析至透析出的水溶液在254nm與220nm檢測不到紫外吸 收變化時(shí)，再將透析袋內(nèi)得到的溶液冷凍干燥或真空干燥，得到產(chǎn)物。
3. 按照權(quán)利要求2所述的殼聚糖材料，其特征在于所述緩沖液為pH7. 0-9. O，無氨基 緩沖液20mM磷酸鈉緩沖液，O. 15M NaCl ;20mMHEPES ;100mM碳酸鹽/重碳酸鹽緩沖液；或 者50mM硼酸鹽緩沖液；所述光敏交聯(lián)劑與細(xì)胞粘附性肽的物質(zhì)量之比1 : i-i : io;光敏交聯(lián)劑終濃度 100 ii m-2M ;400W > UV > 6W， 290-460nm。
4. 一種權(quán)利要求1所述靶向粘附殼聚糖材料的應(yīng)用，其特征在于利用在殼聚糖上光 化學(xué)交聯(lián)細(xì)胞粘附性肽的方法得到的靶向粘附殼聚糖材料，可用于制備DNA或RNA等核酸 藥物的納米載體。
5. 按照權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述細(xì)胞粘附肽為含有細(xì)胞粘附因子RGD 序列的多肽GRGDY， RGD作為整合素的受體，其選擇性部分依賴于RGD的構(gòu)象以及RGD周圍 的氨基酸殘基；其序列為RGD四肽、五肽、六肽、RGD環(huán)肽、雙線肽或RGD模擬肽，肽鏈長度 范圍在3-12個(gè)氨基酸殘基，它們均可以采用權(quán)利要求1所述方法接枝到殼聚糖上，都是利 用光敏性交聯(lián)劑的-NHS酯鍵斷裂與肽鏈的_NH2發(fā)生反應(yīng)重新生成酰胺鍵河制備出安全、 無毒、可降解、生物相容性好、有生物學(xué)功能、在弱酸性條件下溶解的靶向粘附殼聚糖材料； 其結(jié)構(gòu)單元為<formula>formula see original document page 3</formula>其中R為去掉C6-0H的CTS分子。
6. 按照權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述靶向粘附殼聚糖材料與DNA或RNA通 過自組裝方式形成穩(wěn)定、粒徑100-500nm、表面荷正電10_30mV的納米顆粒，靶向粘附殼聚 糖材料作為納米載體能夠保護(hù)DNA或RNA免受相應(yīng)酶降解，且利于轉(zhuǎn)染細(xì)胞并在胞內(nèi)釋放。
7. 按照權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述自組裝方式的操作條件為，靶向粘 附殼聚糖質(zhì)量濃度0. 01mg/ml-lg/ml， DNA或RNA摩爾濃度都是lnM-lM，在pH5. 0-6. 0的 NaAc-HAc條件下，通過磁力攪拌，在10min_24h自組裝成納米顆粒。
8. 按照權(quán)利要求4或6所述的應(yīng)用，其特征在于所述核酸藥物為20bp-10kb的DNA ; 所述RNA為500-700bp的dsRNA或小RNA，包括19bp_25bp的siRNA、20-24bp的microRNA、 或19bp-29bp的shRNA。
9. 按照權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述核酸藥物為靶向腫瘤細(xì)胞表面整合 素受體的核酸藥物，其為用于治療腫瘤的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種靶向粘附殼聚糖材料的應(yīng)用。在雙功能(N-羥基琥珀酰亞胺/疊氮化物)光敏性交聯(lián)劑的作用下，通過UV光化學(xué)激活的接枝反應(yīng)，將細(xì)胞粘附性肽接枝到殼聚糖上，得到的安全(無毒、可降解)、生物相容性好、有生物學(xué)功能、在弱酸性條件下溶解性明顯增強(qiáng)的靶向粘附殼聚糖材料，通過自組裝方式可形成穩(wěn)定、粒徑100-500nm、表面荷正電10-30mV的納米顆粒，可作為DNA(20bp-10kb)或RNA[dsRNA(500-700bp)、小RNA(siRNA、microRNA或shRNA)]等核酸藥物的載體，在保護(hù)所載DNA或RNA免受相應(yīng)酶降解的同時(shí)，可靶向腫瘤細(xì)胞表面過表達(dá)的整合素受體，利于轉(zhuǎn)染細(xì)胞并在胞內(nèi)釋放以治療腫瘤。
文檔編號A61K48/00GK101747451SQ20081022927
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月3日
發(fā)明者于煒婷, 劉袖洞, 楊艷, 馬小軍 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所