專利名稱：溶酶體靶向肽及其應(yīng)用的制作方法
溶酶體靶向肽及其應(yīng)用相關(guān)申請(qǐng)的引用本專利申請(qǐng)要求于2008年5月7日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/051，336和 2009年1月12日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/144，106的權(quán)益，將其各自的內(nèi)容以其整 體作為參考并入本文。
背景技術(shù)：
通常，在細(xì)胞溶質(zhì)中合成了哺乳動(dòng)物的溶酶體酶并且溶酶體酶穿過(guò)ER，在此它們 被N-連接的高甘露糖型碳水化合物糖基化。在高爾基體中，通過(guò)添加將溶酶體蛋白靶向溶 酶體的甘露糖-6-磷酸(M6P)修飾了這些蛋白上的高甘露糖碳水化合物。通過(guò)與兩個(gè)M6P 受體中任一個(gè)的相互作用將M6P-修飾的蛋白輸送到溶酶體中。最好的修飾形式是將兩個(gè) M6P添加到高甘露糖碳水化合物上。超過(guò)四十種溶酶體貯積病(LSD)是直接或間接地由缺少溶酶體中的一種或多種 溶酶體酶所造成的。正在積極進(jìn)行LSD的酶替代療法。療法通常要求以M6P依賴的方式將 LSD蛋白吸收并運(yùn)輸?shù)礁鞣N細(xì)胞類型的溶酶體中。一種可能的方法包括純化LSD蛋白并對(duì) 其進(jìn)行修飾以加入具有M6P的碳水化合物部分。由于與細(xì)胞表面上M6P受體的相互作用， 因此與未修飾的LSD蛋白相比，這種修飾材料可以更有效地被細(xì)胞吸收。本申請(qǐng)的發(fā)明人先前已開發(fā)了基于肽的靶向技術(shù)，該技術(shù)使得能夠更有效地將 治療性酶運(yùn)輸?shù)饺苊阁w中。由于用肽標(biāo)記替代M6P作為靶向溶酶體的部分，因此這種專 有技術(shù)稱為不依賴于糖基化作用的溶酶體靶向(Glycosylation Independent Lysosomal Targeting) (GILT)。在美國(guó)中請(qǐng)公開號(hào) 2003-0082176、2004-0006008、2003_0072761、 2005-0281805,2005-0244400 以及國(guó)際公開 WO 03/032913、WO 03/032727、W002/087510、 WO 03/102583.W0 2005/078077中說(shuō)明了 GILT技術(shù)的詳細(xì)內(nèi)容，將其全部披露內(nèi)容作為參 考并入本文。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了基于GILT技術(shù)的用于有效溶酶體靶向的進(jìn)一步改善的組合物和方 法。尤其是，本發(fā)明提供了使用抗弗林蛋白酶(furin-resistant)的溶酶體靶向肽用于將 溶酶體酶靶向溶酶體的方法和組合物。本發(fā)明還提供了使用對(duì)胰島素受體具有降低或減小 的結(jié)合親和力的溶酶體靶向肽用于將溶酶體酶靶向溶酶體的方法和組合物。本發(fā)明包含以 下意外發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的抗弗林蛋白酶的溶酶體靶向肽對(duì)胰島素受體具有降低的結(jié)合親 和力。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了抗弗林蛋白酶的IGF-II突變蛋白。在一些實(shí)施 方式中，本發(fā)明提供了抗弗林蛋白酶的IGF-II突變蛋白，其具有與成熟人IGF-II(SEQ ID NO 1)至少70%相同的氨基酸序列以及消除了至少一個(gè)弗林蛋白酶切割(裂解)位點(diǎn)的突變。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了 IGF-II突變蛋白，其包含與成熟人IGF-II(SEQID NO 1)相比至少70%相同的氨基酸序列以及與野生型人IGF-II相比降低或減小了對(duì)胰 島素受體的結(jié)合親和力的突變。在一些實(shí)施方式中，相對(duì)于天然存在的人IGF-II對(duì)IGF-I受體的親和力，抗弗林 蛋白酶的IGF-II突變蛋白對(duì)IGF-I受體具有減小的結(jié)合親和力。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了靶向的治療性融合蛋白，其包含溶酶體酶；和具 有與成熟人IGF-II (SEQ ID NO 1)至少70%相同的氨基酸序列的IGF-II突變蛋白，其中 所述IGF-II突變蛋白抗弗林蛋白酶的切割并且以不依賴于甘露糖-6-磷酸的方式與人的 非陽(yáng)離子依賴型(陽(yáng)離子非依賴型，cation-independent)甘露糖_6_磷酸受體結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了靶向的治療性融合蛋白，其包含溶酶體酶；和 IGF-II突變蛋白，所述IGF-II突變蛋白具有與成熟人IGF-II (SEQ ID NO=D至少70%相 同的氨基酸序列，并且相對(duì)于天然存在的人IGF-II對(duì)胰島素受體的親和力，所述IGF-II突 變蛋白對(duì)胰島素受體具有減小的結(jié)合親和力；其中所述IGF-II突變蛋白以不依賴于甘露 糖-6-磷酸的方式與人的非陽(yáng)離子依賴型甘露糖-6-磷酸受體結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了靶向的治療性融合蛋白，其包含溶酶體酶；和 IGF-II突變蛋白，所述IGF-II突變蛋白具有與成熟人IGF-II (SEQ ID NO 1)至少70%相 同的氨基酸序列，并且相對(duì)于天然存在的人IGF-II對(duì)胰島素受體的親和力，所述IGF-II突 變蛋白對(duì)胰島素受體具有減小的結(jié)合親和力；其中所述IGF-II突變蛋白抗弗林蛋白酶的 切割并且以不依賴于甘露糖-6-磷酸的方式與人的非陽(yáng)離子依賴型甘露糖-6-磷酸受體結(jié)
I=I O在一些實(shí)施方式中，適合于本發(fā)明的IGF-II突變蛋白包含在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 1 的氨基酸30-40的區(qū)域內(nèi)的突變。在一些實(shí)施方式中，適合于本發(fā)明的IGF-II突變蛋白包 含在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :1的氨基酸34-40的區(qū)域內(nèi)的突變使得所述突變消除了至少一個(gè)弗 林蛋白酶切割位點(diǎn)。在一些實(shí)施方式中，適合的突變?yōu)榘被崛〈?、缺失?或插入。在一 些實(shí)施方式中，所述突變?yōu)樵趯?duì)應(yīng)于SEQ ID NO 1的Arg37或Arg40的位置處的氨基酸取 代。在一些實(shí)施方式中，所述氨基酸取代為L(zhǎng)ys或Ala取代。在一些實(shí)施方式中，適合的突變?yōu)閷?duì)應(yīng)于下列位置的氨基酸殘基的缺失或替代， 所述位置選自由 SEQ ID NO 1 的 31-40、32-40、33-40、34-40、30-39、31-39、32-39、34-37、 32-39、33-39、34-39、35-39、36-39、37-40、34-40、以及它們的組合組成的組。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的IGF-II突變蛋白進(jìn)一步包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 1的位置2-7的氨基酸的缺失或替代。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的IGF-II突變蛋白 進(jìn)一步包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 1的位置1-7的氨基酸的缺失或替代。在一些實(shí)施方式中， 根據(jù)本發(fā)明的IGF-II突變蛋白進(jìn)一步包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO=I的位置62-67的氨基酸的 缺失或替代。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的IGF-II突變蛋白進(jìn)一步包含對(duì)應(yīng)于SEQID NO :1的Tyr27、Leu43或kr26的位置處的氨基酸取代。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的 IGF-II突變蛋白至少包含選自由Tyr27Leu、Leu43VaUer26Phe以及它們的組合組成的組 中的氨基酸取代。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的IGF-II突變蛋白包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 1的位置48-55的氨基酸。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的IGF-II突變蛋白包含選 自由對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 1的位置8、48、49、50、M和55的氨基酸組成的組中的至少三種氨 基酸。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的IGF-II突變蛋白包含在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:1的位置M和55的位置處的氨基酸，每個(gè)所述氨基酸在pH 7.4下不帶電或帶負(fù)電。在一些實(shí)施方 式中，相對(duì)于天然存在的人IGF-II對(duì)IGF-I受體的親和力，所述IGF-II突變蛋白對(duì)IGF-I 受體具有減小的結(jié)合親和力。在一些實(shí)施方式中，適合于本發(fā)明的溶酶體酶為人酸性α -葡萄糖苷酶(GAA)、或 其功能性變體。在一些實(shí)施方式中，適合于本發(fā)明的溶酶體酶包含人GAA的氨基酸70-952。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的靶向的治療性融合蛋白進(jìn)一步包含在溶酶體酶與抗 弗林蛋白酶的IGF-II突變蛋白之間的間隔區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述間隔區(qū)包含氨基酸 序列 Gly-Ala-Pro0本發(fā)明還提供了編碼如以上各個(gè)實(shí)施方式中所描述的IGF-II突變蛋白或靶向的 治療性融合蛋白的核酸。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含本發(fā)明的核酸的各種細(xì)胞。本發(fā)明提供了適合于治療溶酶體貯積病的藥物組合物，該藥物組合物包含治療有 效量的本發(fā)明的靶向的治療性融合蛋白。本發(fā)明進(jìn)一步提供了治療溶酶體貯積病的方法， 該方法包括向需要治療的受試者給予根據(jù)本發(fā)明的靶向的治療性融合蛋白。在一些實(shí)施方 式中，溶酶體貯積病為蓬珀病(全身性糖原病，Pompe Disease)。在一些實(shí)施方式中，溶酶體 貯積病為法布里病(Fabry Disease)。在一些實(shí)施方式中，溶酶體貯積病為高歇病(Gaucher Disease)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)靶向的治療性融合蛋白的方法，該方法包 括以下步驟在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有本發(fā)明的核酸，具 體地，如本文中各個(gè)實(shí)施方式所述的；和在允許靶向的治療性融合蛋白表達(dá)的條件下進(jìn)行 所述培養(yǎng)。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)靶向的治療性融合蛋白的方法，該方法包 括以下步驟在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)弗林蛋白酶缺陷型細(xì)胞(例如，弗林蛋白酶缺陷型哺乳 動(dòng)物細(xì)胞)，其中弗林蛋白酶缺陷型細(xì)胞具有編碼包含溶酶體酶和IGF-II突變蛋白的融合 蛋白的核酸，所述IGF-II突變蛋白具有與成熟人IGF-II (SEQ ID NO=D至少70%相同的 氨基酸序列，其中IGF-II突變蛋白以不依賴于甘露糖-6-磷酸的方式與人的非陽(yáng)離子依賴 型甘露糖-6-磷酸受體結(jié)合；并且其中所述培養(yǎng)是在允許靶向的治療性融合蛋白表達(dá)的條 件下進(jìn)行的。在隨后的詳細(xì)說(shuō)明中，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)勢(shì)將是顯而易見(jiàn)的。然而，應(yīng) 當(dāng)理解，在說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施方式的同時(shí)，詳細(xì)描述僅通過(guò)示例的方式給出，而不進(jìn)行限制。 根據(jù)詳細(xì)說(shuō)明，本發(fā)明范圍內(nèi)的各種變化和改變對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)會(huì)是顯而易見(jiàn) 的。


附圖僅是出于說(shuō)明的目的，而不是為了限制。圖1示出了 ZC-701的N末端的圖。方框中的兩個(gè)氨基酸殘基是切割事件的位點(diǎn)。 第一個(gè)是信號(hào)肽切割位點(diǎn)，第二個(gè)是弗林蛋白酶切割位點(diǎn)。圖2示出了用肽N-糖苷酶F (N-糖酰胺酶F，肽_N_聚糖酶F，PNGaseF)處理后的 ZC-701的示例性SDS-PAGE分析。右側(cè)的泳道已另外用弗林蛋白酶處理。圖3左側(cè)修飾了弗林蛋白酶切割位點(diǎn)的示例性ZC-701突變體的示意圖。中間細(xì)胞培養(yǎng)3-7天后，用肽N-糖苷酶處理的突變體的示例性SDS-PAGE分析。右側(cè)用弗林蛋 白酶處理的肽N-糖苷酶處理過(guò)的突變體的示例性SDS-PAGE分析。圖4示出了示例性的競(jìng)爭(zhēng)性IGF-II受體結(jié)合結(jié)果。圖5示出了另外的示例性的競(jìng)爭(zhēng)性IGF-II受體結(jié)合結(jié)果。圖6示出了示例性胰島素受體競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定結(jié)果。圖7示出了示例性IGF-I受體競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定結(jié)果。圖8示出了某種胰島素受體結(jié)合測(cè)定的示例性結(jié)果。圖9示出了某種胰島素受體結(jié)合測(cè)定的示例性結(jié)果。圖10示出了從瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中部分純化的GILT-標(biāo)記的GAA的示例性分析。用構(gòu)件 (構(gòu)建體，構(gòu)建物，construct) 1479、1487或ZC-701轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。收獲后，用疏水作 用層析(HIC)部分純化培養(yǎng)上清液。在進(jìn)行電泳前，用肽N-糖苷酶處理所有樣品。左側(cè)部 分部分純化蛋白的SDS-PAGE。將純化的ZC-701B12顯示為對(duì)照。右側(cè)部分部分純化蛋 白的免疫印跡分析。使用了所指明的第一抗體。底側(cè)部分另外用外源弗林蛋白酶處理。構(gòu) 件1487所編碼的蛋白在序列上與構(gòu)件1461 (R37A)所編碼的相同。構(gòu)件1479所編碼的蛋 白與構(gòu)件1459 (R37K)所編碼的相同。圖11示出了示例性抗弗林蛋白酶的GILT-標(biāo)記的GAA吸收至大鼠L6成肌細(xì)胞中 的示例性吸收結(jié)果。蛋白1479、1487、ZC-701和純化的ZC-701的分別為4. 5ηΜ、4. 4ηΜ, 5. OnM和2. 6ηΜ。構(gòu)件1487所編碼的蛋白在序列上與圖3中構(gòu)件1461所編碼的(R37A)相 同。構(gòu)件1479所編碼的蛋白與圖3中構(gòu)件1459所編碼的(R37K)相同。定義轉(zhuǎn)佳如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)佳”表示受試者狀況的預(yù)防、減輕或緩和或者受試 者狀況的改善。轉(zhuǎn)佳包括，但不要求疾病病況的完全恢復(fù)或完全預(yù)防。在一些實(shí)施方式中， 轉(zhuǎn)佳包括相關(guān)疾病組織的溶酶體內(nèi)部所累積的材料的減少。抗弗林蛋白酶的IGF-II突變蛋白如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“抗弗林蛋白酶的 IGF-II突變蛋白”是指基于IGF-II的肽，該基于IGF-II的肽包含這樣的改變的氨基酸序 列，該改變的氨基酸序列消除了至少一個(gè)天然弗林蛋白酶切割位點(diǎn)或改變了接近于或鄰近 于天然弗林蛋白酶切割位點(diǎn)的序列的使得與野生型人IGF-II肽相比，防止、抑制、降低或 減慢了弗林蛋白酶的切割。如本文所使用的，抗弗林蛋白酶的IGF-II突變蛋白還稱為對(duì)弗 林蛋白酶耐受的IGF-II突變蛋白。弗林蛋白酶切割位點(diǎn)如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“弗林蛋白酶切割位點(diǎn)”(還稱為“弗 林蛋白酶切割位點(diǎn)”或“弗林蛋白酶切割序列”)是指用作弗林蛋白酶或類弗林蛋白酶的酶 促蛋白酶切割的識(shí)別序列的肽或蛋白質(zhì)的氨基酸序列。通常，弗林蛋白酶切割位點(diǎn)具有共 有序列Arg-X-X-Arg(SEQ IDNO :2)，X為任何氨基酸。所述切割位點(diǎn)位于所述序列中羧基末 端的精氨酸(Arg)殘基之后。在一些實(shí)施方式中，弗林蛋白酶切割位點(diǎn)可以具有共有序列 Lys/Arg-X-X-X-Lys/Arg-Arg(SEQ ID NO :3)，X為任何氨基酸。所述切割位點(diǎn)位于所述序 列中羧基末端的精氨酸(Arg)殘基之后。弗林蛋白酶如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“弗林蛋白酶”是指可以識(shí)別并切割如本文所定 義的弗林蛋白酶切割位點(diǎn)的任何蛋白酶，包括弗林蛋白酶或類弗林蛋白酶。弗林蛋白酶還 稱為成對(duì)堿性氨基酸切割酶(PACE)。弗林蛋白酶屬于類枯草桿菌蛋白酶前蛋白轉(zhuǎn)化酶家族。編碼弗林蛋白酶的基因被稱為FUR(FES上游區(qū))。 弗林蛋白酶缺陷型細(xì)胞如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“弗林蛋白酶缺陷型細(xì)胞”是指弗 林蛋白酶活性被抑制、降低或消除的任何細(xì)胞。弗林蛋白酶缺陷型細(xì)胞包括不產(chǎn)生弗林蛋 白酶或產(chǎn)生降低量的弗林蛋白酶或缺陷型弗林蛋白酶的哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
不依賴于糖基化作用的溶酶體靶向如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“不依賴于糖基化作用 的溶酶體靶向”(還稱作“GILT”)是指不依賴于甘露糖-6-磷酸的溶酶體靶向。人酸性α-葡萄糖苷酶如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“人酸性α-葡萄糖苷酶”(還稱 為“GAA” )是指能夠降低哺乳動(dòng)物溶酶體中糖原水平或者能夠挽救一種或多種蓬珀病癥狀 或使其轉(zhuǎn)佳的人GAA的前體野生型或功能性變體。改善、提高或降低如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“改善”、“提高”或“降低”或語(yǔ)法上等價(jià) 的表達(dá)表示相對(duì)于基線測(cè)量(如，在開始本文所述的治療前在相同個(gè)體中的測(cè)量)或相對(duì) 于未使用本文所述治療的對(duì)照個(gè)體(或多個(gè)對(duì)照個(gè)體)中的測(cè)量的值?！皩?duì)照個(gè)體”是被與 所治療個(gè)體相同形式的溶酶體貯積病(例如，蓬珀病)困擾的個(gè)體，其與所治療的個(gè)體年齡 大致相同(以確保治療個(gè)體和對(duì)照個(gè)體中的疾病階段是可比較的)。個(gè)體、受試者、患者如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“受試者”、“個(gè)體，，或“患者，，是指人或 非人哺乳動(dòng)物受試者。所治療的個(gè)體(還稱為“患者”或“受試者”)是患有溶酶體貯積病 (例如，蓬珀病(即嬰兒、少年或成年發(fā)病的蓬珀病))或具有發(fā)展溶酶體貯積病(例如，蓬 珀病)的可能的個(gè)體(胎兒、嬰兒、兒童、青少年或成年的人)。溶酶體貯積病如本文所使用的，“溶酶體貯積病”是指由缺乏在溶酶體中將大分 子分解成肽、氨基酸、單糖、核酸和脂肪酸所需要的至少一種酶(例如，酸性水解酶)所引起 的一組遺傳疾病。因此，患有溶酶體貯積病的個(gè)體在溶酶體中具有積累的材料。表1中列 出了示例性的溶酶體貯積病。溶酶體酶如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“溶酶體酶”是指能夠減少哺乳動(dòng)物溶酶體中積 累的材料或者能夠挽救一種或多種溶酶體貯積病癥狀或使其轉(zhuǎn)佳的任何酶。適合于本發(fā)明 的溶酶體酶包括野生型或修飾的溶酶體酶并且能夠使用重組和合成方法產(chǎn)生或者可以從 天然來(lái)源純化。表1中列出了示例性的溶酶體酶。間隔區(qū)如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“間隔區(qū)”(還稱為“接頭”)是指融合蛋白中兩 個(gè)蛋白部分之間的肽序列。間隔區(qū)通常設(shè)計(jì)為柔性的或設(shè)計(jì)為插入至兩個(gè)蛋白部分之間 的如α-螺旋的結(jié)構(gòu)中。間隔區(qū)可以相對(duì)較短，如序列Gly-Ala-Pro (SEQ ID NO :4)或 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro (SEQ ID NO 5)，或者能夠更長(zhǎng)，如，例如，長(zhǎng)度為10-25個(gè)氨基酸。治療有效量如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指以適用于任何醫(yī)學(xué)治療的 合理獲益/風(fēng)險(xiǎn)比對(duì)所治療的受試者起治療效果的靶向的治療性融合蛋白的量。治療效果 可以是客觀的(即，通過(guò)一些測(cè)試或標(biāo)志物測(cè)量)或者可以是主觀的(即，受試者給出效果 說(shuō)明或感受效果)。具體地，“治療有效量”是指對(duì)治療、轉(zhuǎn)佳或預(yù)防所需疾病或病況有效， 或表現(xiàn)出可檢測(cè)的治療或預(yù)防效果的治療性融合蛋白或組合物的量，如通過(guò)轉(zhuǎn)佳與所述疾 病有關(guān)的癥狀、預(yù)防或延緩所述疾病的發(fā)病和/或還減輕了所述疾病癥狀的嚴(yán)重程度或頻 率。通常以可以包含多個(gè)單位劑量的劑量方案給予治療有效量。對(duì)于任何特定的治療性融 合白質(zhì)，可以例如根據(jù)給藥途徑、與其它藥劑的組合來(lái)改變治療有效量(和/或有效劑量方案內(nèi)的適當(dāng)單位劑量)。同樣，對(duì)于任何特定患者的具體治療有效量(和/或單位劑量)可 以取決于各種因素，包括正在治療的病癥和該病癥的嚴(yán)重程度；所使用的具體藥劑的活 性；所使用的具體組合物；患者的年齡、體重、一般健康情況、性別和飲食；所使用的具體融 合蛋白的給藥時(shí)間、給藥途徑和/或分泌或代謝速率；治療持續(xù)時(shí)間；以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中眾所 周知的類似因素。治療如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“治療(treatment) ” (還為“治療(treat) ”或“正治 療(treating)”)是指部分或完全減輕、轉(zhuǎn)佳、緩解、抑制、延緩特定疾病、病癥和/或病況的 一種或多種癥狀或特征的發(fā)生、減輕它們的嚴(yán)重程度和/或降低它們的發(fā)病率的治療性融 合蛋白的任何給藥。這種治療可以是對(duì)未表現(xiàn)出相關(guān)疾病、病癥和/或病況跡象的受試者， 和/或僅表現(xiàn)出所述疾病、病癥和/或病況的早期跡象的受試者?？商鎿Q地或另外，這種治 療可以是對(duì)表現(xiàn)出相關(guān)疾病、病癥和/或病況的一種或多種已確立跡象的受試者。例如，治 療可以是指改善了心臟狀態(tài)(例如，提高舒張末期和/或收縮末期容量，或者減輕、轉(zhuǎn)佳或 預(yù)防通常在蓬珀病中所發(fā)現(xiàn)的進(jìn)行性心肌病)或肺功能(例如，相對(duì)于基線量提高了哭喊 肺活量、和/或使哭喊期間的氧減飽和正常)；改善了神經(jīng)發(fā)育和/或運(yùn)動(dòng)技能(例如，提高 AIMS得分)；降低患有所述疾病個(gè)體的組織中的糖原水平；或這些效果的任何組合。在一些 實(shí)施方式中，治療包括糖原清除的改善，特別是在與蓬珀病有關(guān)的心肌病的減輕或預(yù)防中。如本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語(yǔ)“約，，和“大約”等同使用。在本申請(qǐng)中使用的有或沒(méi) 有用約/大約修飾的任何數(shù)字均表示覆蓋了相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所理解的任何正常 波動(dòng)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了基于不依賴于糖基化作用的溶酶體靶向(GILT)技術(shù)的用于靶向溶 酶體酶的改善的方法和組合物。尤其是，本發(fā)明提供了抗弗林蛋白酶和/或?qū)σ葝u素受體 具有降低或減少的結(jié)合親和力的IGF-II突變蛋白并且提供了包含本發(fā)明的IGF-II突變蛋 白的靶向的治療性融合蛋白。本發(fā)明還提供了制備和使用其的方法。將在隨后的部分中詳細(xì)地描述本發(fā)明的各個(gè)方面。以下部分的使用不意味著對(duì)本 發(fā)明的限制。每個(gè)部分可以適用于本發(fā)明的任何方面。在本申請(qǐng)中，除非另有說(shuō)明，否則使 用“或”表示“和/或”。溶酶體酶適合于本發(fā)明的溶酶體酶包括能夠降低哺乳動(dòng)物溶酶體中所積累的材料或者能 夠挽救或轉(zhuǎn)佳一種或多種溶酶體貯積病癥狀的任何酶。適合的溶酶體酶包括野生型或修飾 的溶酶體酶并且能夠使用重組或合成方法產(chǎn)生或者能夠從天然來(lái)源純化。表1中列出了示 例性的溶酶體酶。表1.溶酶體貯積病和相關(guān)的酶缺陷
權(quán)利要求
1.一種靶向的治療性融合蛋白，包含溶酶體酶；以及IGF-II突變蛋白，所述IGF-II突變蛋白具有與成熟人IGF-II (SEQ ID NO :1)至少70% 相同的氨基酸序列，其中，所述IGF-II突變蛋白抗弗林蛋白酶的切割并且以不依賴于甘露 糖-6-磷酸的方式與人的非陽(yáng)離子依賴型甘露糖-6-磷酸受體結(jié)合。
2.一種靶向的治療性融合蛋白，包含溶酶體酶；以及IGF-II突變蛋白，所述IGF-II突變蛋白具有與成熟人IGF-II (SEQ ID NO :1)至少70% 相同的氨基酸序列，并且相對(duì)于天然存在的人IGF-II對(duì)胰島素受體的親和力，所述IGF-II 突變蛋白對(duì)胰島素受體具有減小的結(jié)合親和力；其中，所述IGF-II突變蛋白以不依賴于甘露糖-6-磷酸的方式與人的非陽(yáng)離子依賴型 甘露糖-6-磷酸受體結(jié)合。
3.—種靶向的治療性融合蛋白，包含溶酶體酶；以及IGF-II突變蛋白，所述IGF-II突變蛋白具有與成熟人IGF-II (SEQ ID NO :1)至少70% 相同的氨基酸序列，并且相對(duì)于天然存在的人IGF-II對(duì)胰島素受體的親和力，所述IGF-II 突變蛋白對(duì)胰島素受體具有減小的結(jié)合親和力；其中，所述IGF-II突變蛋白抗弗林蛋白酶的切割并且以不依賴于甘露糖-6-磷酸的方 式與人的非陽(yáng)離子依賴型甘露糖-6-磷酸受體結(jié)合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的靶向的治療性融合蛋白，其中，所述IGF-II突變 蛋白包含在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 1的氨基酸30-40的區(qū)域內(nèi)的突變。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的靶向的治療性融合蛋白，其中，所述IGF-II突變 蛋白包含在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :1的氨基酸34-40的區(qū)域內(nèi)的突變，使得所述突變消除了至 少一個(gè)弗林蛋白酶切割位點(diǎn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的靶向的治療性融合蛋白，其中，所述突變?yōu)榘被崛〈?缺失和/或插入。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的靶向的治療性融合蛋白，其中，所述突變?yōu)閷?duì)應(yīng)于SEQID NO :1的Arg37或Arg40的位置處的氨基酸取代。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的靶向的治療性融合蛋白，其中，所述氨基酸取代為L(zhǎng)ys或Ala 取代。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的靶向的治療性融合蛋白，其中，所述突變?yōu)閷?duì)應(yīng)于下列位置 的氨基酸殘基的缺失或替代，所述位置選自由SEQID NO :1的31-40、32-40、33-40、34-40、 30-39、31-39、32-39、34-37、32-39、33-39、34-39、35-39、36-39、37-40、34-40、以及它們的 組合組成的組。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的靶向的治療性融合蛋白，其中，所述IGF-II突 變蛋白進(jìn)一步包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 1的位置2-7的氨基酸的缺失或替代。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的靶向的治療性融合蛋白，其中，所述IGF-II突 變蛋白進(jìn)一步包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 1的位置1-7的氨基酸的缺失或替代。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的靶向的治療性融合蛋白，其中，所述IGF-II突變蛋白進(jìn)一步包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 1的位置62-67的氨基酸的缺失或替代。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的靶向的治療性融合蛋白，其中，所述IGF-II突 變蛋白進(jìn)一步包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 1的Tyr27、Leu43或kr26的位置處的氨基酸取代。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的靶向的治療性融合蛋白，其中，所述IGF-II突變蛋白至少 包含選自由Tyr27Leu、Leu43Val、Serf6Wie、以及它們的組合組成的組中的氨基酸取代。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的靶向的治療性融合蛋白，其中，所述IGF-II突 變蛋白包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 1的位置48-55的氨基酸。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的靶向的治療性融合蛋白，其中，所述IGF-II突 變蛋白包含選自由對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 1的位置8、48、49、50、M和55的氨基酸組成的組中 的至少三種氨基酸。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的靶向的治療性融合蛋白，其中，所述IGF-II突 變蛋白包含在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 1的位置M和55的位置處的氨基酸，每個(gè)所述氨基酸在 PH 7. 4下不帶電或帶負(fù)電。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的靶向的治療性融合蛋白，其中，相對(duì)于天然存在 的人IGF-II對(duì)IGF-I受體的親和力，所述IGF-II突變蛋白對(duì)IGF-I受體具有減小的結(jié)合 親和力。
19.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的靶向的治療性融合蛋白，其中，所述溶酶體酶為 人酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)、或其功能性變體。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的靶向的治療性融合蛋白，其中，所述溶酶體酶包含人GAA的 氨基酸70-952。
21.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的靶向的治療性融合蛋白，其中，所述靶向的治療 性融合蛋白進(jìn)一步包含在所述溶酶體酶與所述IGF-II突變蛋白之間的間隔區(qū)。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的靶向的治療性融合蛋白，其中，所述間隔區(qū)包含氨基酸序 列 Gly-Ala-Pro。
23.—種編碼根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的靶向的治療性融合蛋白的核酸。
24.一種包含根據(jù)權(quán)利要求23所述的核酸的細(xì)胞。
25.一種適合于治療溶酶體貯積病的藥物組合物，包含根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所 述的靶向的治療性融合蛋白。
26.一種治療溶酶體貯積病的方法，包括向需要治療的受試者給予根據(jù)前述權(quán)利要求 中任一項(xiàng)所述的靶向的治療性融合蛋白。
27.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的方法，其中，所述溶酶體貯積病為蓬珀病。
28.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的方法，其中，所述溶酶體貯積病為法布里病。
29.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的方法，其中，所述溶酶體貯積病為高歇病。
30.一種生產(chǎn)靶向的治療性融合蛋白的方法，包括以下步驟在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有根據(jù)權(quán)利要求23所述的核酸；以及在允許所述靶向的治療性融合蛋白表達(dá)的條件下進(jìn)行所述培養(yǎng)。
31.一種生產(chǎn)靶向的治療性融合蛋白的方法，包括以下步驟在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)弗林蛋白酶缺陷型細(xì)胞，其中所述弗林蛋白酶缺陷型細(xì)胞具有編碼包含溶酶體酶和IGF-II突變蛋白的融合蛋白的 核酸，所述IGF-II突變蛋白具有與成熟人IGF-II (SEQ ID NO 1)至少70%相同的氨基酸 序列，其中，所述IGF-II突變蛋白以不依賴于甘露糖-6-磷酸的方式與人的非陽(yáng)離子依賴 型甘露糖-6-磷酸受體結(jié)合；以及其中，所述培養(yǎng)是在允許所述靶向的治療性融合蛋白表達(dá)的條件下進(jìn)行的。
全文摘要
本發(fā)明提供了基于GILT技術(shù)的用于有效溶酶體靶向的進(jìn)一步改善的組合物和方法。尤其是，本發(fā)明提供了使用抗弗林蛋白酶的溶酶體靶向肽用于將溶酶體酶靶向溶酶體的方法和組合物。本發(fā)明還提供了使用對(duì)胰島素受體具有降低或減小的結(jié)合親和力的溶酶體靶向肽用于將溶酶體酶靶向溶酶體的方法和組合物。
文檔編號(hào)C07K19/00GK102066422SQ200980123156
公開日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2009年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月7日
發(fā)明者喬納森·H·勒博茨, 約翰·瑪嘎 申請(qǐng)人:齊斯特治療公司