具有腫瘤靶向及穿膜的小肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種小肽及其作為靶向造影劑和抗腫瘤藥物載體的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤特異性的細(xì)胞表面受體能夠吸引靶向分子，使腫瘤細(xì)胞選擇性制劑得以設(shè)計與開發(fā)，用于腫瘤的診斷和治療。很多腫瘤受體靶向肽作為主動靶向載體。在前期研宄中，我們從人結(jié)締組織生長因子CTGF中提取了 Plc肽(CIRTPKISKPIKFELSG)，它能與人整合素av β 3特異性結(jié)合。同時利用超順磁性氧化鐵USP1s，這種肽成功地應(yīng)用于α ν β 3陽性表達(dá)的原發(fā)性肝癌Bel 7402的核磁共振(MRI)檢查中。
[0003]抗菌肽是從人工合成或天然肽和蛋白質(zhì)中提取，其中大部分是一種陽離子肽，能直接與磷脂雙分子層作用。這些肽不僅可以穿透細(xì)胞膜，還可以通過疏水螺旋結(jié)構(gòu)插入細(xì)胞質(zhì)膜的機(jī)制將物質(zhì)運送進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞內(nèi)。
[0004]然而，擁有的其他二級結(jié)構(gòu)的小肽(如β片層結(jié)構(gòu))，是否可以起到同樣的作用尚待研宄。S-thanatin (Ts，GSKKPVPIIYCNRRSGKCQRM)，一種具有受限于二硫鍵的反向β折疊結(jié)構(gòu)的抗菌肽，對革蘭氏陰性菌和陽性菌具有廣譜抗菌活性。
[0005]Ts的殺菌作用是以一種膜依賴性的方式與細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)。我們的研宄表明Ts通過β折疊結(jié)構(gòu)與細(xì)菌脂多糖結(jié)合，其疏水端插入細(xì)胞膜導(dǎo)致膜的通透性增高。細(xì)胞膜的通透性增高和膜去極化破壞了細(xì)胞的能量代謝，從而導(dǎo)致了細(xì)胞死亡。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]解決的技術(shù)問題:本發(fā)明提供了一種具有腫瘤靶向及穿膜的小肽及其應(yīng)用，它是由α νβ 3結(jié)合肽Plc與Ts用氨基酸GS連接形成。
[0008]技術(shù)方案:一種具有腫瘤靶向及穿膜的小肽，氨基酸序列為GSKKPVPIIYCNRRSGKCQRMGSIRTPKISKPIKFELSGo該肽能與整合素α ν β 3結(jié)合，并能快速穿過細(xì)胞膜，分子量為4362.27，等電點為 11.15。
[0009]所述小肽在制備靶向造影劑或抗腫瘤藥物載體中的應(yīng)用。
[0010]一種靶向造影劑，含有權(quán)利要求1所述的小肽。
[0011]一種抗腫瘤藥物載體，含有權(quán)利要求1所述的小肽。
[0012]有益效果:本發(fā)明的小肽(PTS)在體外表現(xiàn)出較低的溶血毒性；流式細(xì)胞術(shù)顯示FITC-PTS能特異性結(jié)合MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞；激光共聚焦顯微鏡觀察FITC-PTS的熒光主要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；體內(nèi)近紅外熒光成像技術(shù)顯示α νβ 3陽性MDA-MB-231腫瘤檢測到Cy5.5-PTS探針高信號。
【附圖說明】
[0013]圖1為PTS純度鑒定圖。
[0014]圖2為PTS質(zhì)譜鑒定圖。
[0015]圖3為PTS，Plc和Ts的溶血毒性示意圖:人類紅細(xì)胞與不同濃度的多肽在PBS溶液中37°C孵育15 min。三組間沒有顯著差異(P>0.05)。
[0016]圖4為流式細(xì)胞術(shù)檢測熒光探針與MDA-MB-231細(xì)胞的結(jié)合情況示意圖:A為對照組，細(xì)胞與PBS孵育；B為細(xì)胞與抗α νβ 3單克隆抗體孵育后加入FITC標(biāo)記的羊抗小鼠二抗；(:為細(xì)胞與FITC-PTS孵育山為細(xì)胞與FlTC-Plc孵育；Ε為細(xì)胞與FITC-Ts孵育；F為細(xì)胞與游離Plc孵育后加入FITC-PTS ；G為細(xì)胞與抗α V β 3單克隆抗體孵育后加FITC-PTS。
[0017]圖5為熒光探針的細(xì)胞定位示意圖:MDA-MB-231細(xì)胞分別與PBS (對照組)，F(xiàn)ITC-PTS, FITC-Plc, FITC-Ts,游離 Plc 和抗 α ν β 3 單克隆抗體加 FITC-PTS孵育 30min，采用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光分布情況。
[0018]圖6為熒光探針作用于MDA-MB-231細(xì)胞膜的原理圖:A為FITC-PTS首先與腫瘤細(xì)胞表面的整合素ανβ3結(jié)合，其β折疊結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜緊密連接，然后FITC標(biāo)記的疏水性頭部插入磷脂雙分子層并快速滲透進(jìn)入細(xì)胞；Β為FlTC-Plc與腫瘤細(xì)胞表面的整合素α ν β 3結(jié)合；C為FITC-Ts對細(xì)胞膜不起作用。
[0019]圖7為體內(nèi)近紅外熒光成像圖:Α為注射Cy5.5-PTS探針的MDA_MB_231腫瘤模型的24h在體近紅外熒光成像；B為靜脈注射Cy5.5-PTS 8h后離體組織器官的成像(左，明視野；右，近紅外熒光成像)1，肌肉；2，肺；3，腎；4，脾；5，骨；6，心臟；7，肝臟；8，腫瘤。C為靜脈注射不同熒光探針Cy5.5-PTS (左)、Cy5.5-Plc (中)及Cy5.5_Ts (右)8 h時近紅外成像比較。
[0020]圖8為比較三種探針在不同時間點的腫瘤與正常組織熒光強(qiáng)度比值示意圖(T/N) *，P〈0.05,不同時間點實驗Cy5.5- PTS組與Cy5.5- Plc組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；#，P〈0.05，不同時間點實驗Cy5.5- PTS組與Cy5.5- Ts組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0021]圖9 MDA-MB-231腫瘤的組織學(xué)評估圖:A為腫瘤組織HE染色圖為腫瘤的免疫組織化學(xué)染色圖。
【具體實施方式】
[0022]本發(fā)明中，我們通過氨基酸SG將Ts的C端和Plc的N端相連，設(shè)計形成一種雜合肽PTS。Plc和Ts仍然保留其生物活性。當(dāng)用熒光基團(tuán)FITC或Cy5.5標(biāo)記PTS后，預(yù)期熒光探針(FITC-PTS或Cy5.5-PTS)會與α ν β 3陽性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的特異性結(jié)合力，并且可以快速滲透細(xì)胞膜。通過流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞體外結(jié)合和熒光探針攝取情況。采用體內(nèi)近紅外熒光成像(NIRF)評估PTS對乳腺癌MDA-MB-231的腫瘤靶向性。
[0023]實施例1.PTS的合成和鑒定
PTS由上?？齐纳锛夹g(shù)公司采用固相合成的方法制備，純度>95%(圖1)，質(zhì)譜鑒定結(jié)果與預(yù)期分子量一致(圖2)。
[0024]實施例2.溶血試驗
人類紅細(xì)胞用PH7.4的PBS溶液洗三次并重懸。加入PTS，Plc，和Ts，終濃度為0-1.0mmol/L，37°C孵育15min，5, 600Xg離心I min，檢測上清液在350 nm處的吸光度。按以下公式計算溶血百分率:溶血百分率(％) = (A-AB)/(Ap-AB) X100。Ab:空白對照，即未加入多肽；AP:陽性對照，S卩加入0.2% Triton X-100導(dǎo)致完全溶血。實驗結(jié)果顯示:三種肽均顯示較低的溶血活性，溶血百分率無顯著差異(K0.05)(圖3)。
[0025]實施例3.流式細(xì)胞術(shù)
人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞用含10% FBS的DMEM于37°C、5%