本發(fā)明屬于診斷領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及EGFR的T790M突變的診斷方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
：肺癌是全世界發(fā)病率和死亡率均列第一的惡性腫瘤。由于肺癌發(fā)生機(jī)制的多樣性和治療監(jiān)控工具的局限性，大多數(shù)患者往往不能得益于臨床治療。比如，化學(xué)治療肺癌的疾病緩解率僅為15％-20％。大規(guī)模的臨床試驗(yàn)證實(shí)，以表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(TKI)為代表的靶向藥物，對(duì)EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌患者具有顯著療效，可延長(zhǎng)其無疾病進(jìn)展生存期和總生存期。然而，臨床上對(duì)于TKI藥物有效的患者，在用藥后期均會(huì)產(chǎn)生耐藥性，研究顯示，其中50％患者在19外顯子缺失或L858R等敏感性突變的基礎(chǔ)上，又發(fā)生了第20外顯子790位密碼子的突變(T790M)。最新研究表明，由阿斯利康研發(fā)的第三代EGFR抑制劑，對(duì)已有EGFR-TKI有抗性并且存在T790M突變的NSCLC患者有較佳的治療效果。因此在臨床用藥選擇時(shí)，除敏感突變外，T790M耐藥突變的檢測(cè)也尤為重要。用于EGFR基因T790M突變檢測(cè)的樣本主要包括腫瘤組織樣本和血液樣本。組織樣本成份復(fù)雜，除了腫瘤組織DNA，也含有部分正常組織DNA，加上腫瘤本身的異質(zhì)性，其帶檢測(cè)突變?cè)跇颖局兴嫉谋壤陀?0％。此外，在臨床實(shí)踐中，并非所有患者都能獲得組織標(biāo)本。尤其對(duì)于發(fā)病即為中晚期的肺癌患者來說，腫瘤組織標(biāo)本往往經(jīng)穿刺獲得，組織量少，難以滿足檢測(cè)要求。另一方面，腫瘤的生物學(xué)特性在經(jīng)過一系列治療后會(huì)發(fā)生改變，再次獲取組織標(biāo)本比較困難。循環(huán)腫瘤DNA(CtDNA)是一種無細(xì)胞狀態(tài)的胞外游離DNA，由凋亡的腫瘤細(xì)胞釋放，存在于腫瘤患者外周血中，具有腫瘤細(xì)胞的遺傳特征。由于外周血取樣的方便和及時(shí)性，對(duì)于EGFR-TKI耐藥的 患者，檢測(cè)外周血中的CtDNA，即可獲得T790M的突變信息。但是，血液樣本中除了來自于腫瘤組織的含有突變的CtDNA之外，還含有大量來自于正常細(xì)胞代謝所產(chǎn)生的野生型DNA，其突變比例往往低于1％。目前常用的檢測(cè)EGFR基因T790M突變的方法有測(cè)序法和ARMS-PCR法。測(cè)序法靈敏度較低約20％，且操作復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。ARMS-PCR方法能夠達(dá)到1％的靈敏度，對(duì)于突變比例較高的腫瘤組織樣本尚能夠滿足檢測(cè)需求，但是對(duì)于突變含量低的組織樣本，尤其是血液樣本，難以有效檢測(cè)。本發(fā)明人前期研發(fā)的EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒，其對(duì)T790M位點(diǎn)有較好的檢出率。但是，臨床應(yīng)用中仍然發(fā)現(xiàn)一些問題，在檢測(cè)效率方面有待進(jìn)一步提高。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供EGFR的T790M突變的診斷方法及試劑盒。在本發(fā)明的第一方面，提供一種檢測(cè)EGFR基因T790M突變的試劑盒，所述的試劑盒中包括：(a)與EGFR基因T790M突變位點(diǎn)及鄰近位點(diǎn)的序列互補(bǔ)的前引物，所述的前引物長(zhǎng)度為10-25bp，且該前引物的3’末端序列包含“5’-ACTCATCAT-3’”序列或該序列中第2-8位(較佳地第3-7位)中任一堿基由其它堿基替換而形成的序列；(b)后引物；該后引物和前引物擴(kuò)增包含基因突變位點(diǎn)在內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為50-100bp；和(c)特異性針對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的探針，所述的探針攜帶可檢測(cè)標(biāo)記。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的前引物的長(zhǎng)度為10-20bp；較佳地為12-20bp。在另一優(yōu)選例中，所述的該序列中第2-8位(較佳地第3-7位)中任一堿基由其它堿基替換而形成的序列包括：“5’-ACACATCAT-3’”。在另一優(yōu)選例中，所述的可檢測(cè)標(biāo)記是熒光標(biāo)記。在另一優(yōu)選例中，SEQIDNO:1，SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5或SEQIDNO:6。在另一優(yōu)選例中，所述的前引物是選自下組所示核苷酸序列的前引物： SEQIDNO:7，SEQIDNO:8，SEQIDNO:9，SEQIDNO:10或SEQIDNO:11。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括：與EGFR基因T790M突變位點(diǎn)及鄰近位點(diǎn)的序列互補(bǔ)的前引物b，所述的前引物b長(zhǎng)度為10-25bp，且該前引物b的3’末端序列包含“5’-GCTCATCAT-3’”序列或該序列中第2-8位(較佳地第3-7位)中任一堿基由其它堿基替換而形成的序列；較佳地為“5’-GCACATCAT-3’”。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括SEQIDNO:12所示的前引物。在另一優(yōu)選例中，所述的后引物具有如SEQIDNO:14所示的核苷酸序列，且所述的后引物長(zhǎng)度為16-25bp；較佳地為16-20bp；如18bp。在另一優(yōu)選例中，所述的前引物的核苷酸序列中，還設(shè)置一個(gè)與EGFR基因模板中相應(yīng)位點(diǎn)堿基錯(cuò)配的堿基。在另一優(yōu)選例中，所述的錯(cuò)配的堿基位于EGFR基因T790M突變待測(cè)堿基5’端第6個(gè)堿基。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括：(d)靶向點(diǎn)基因突變位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的野生型位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)性Block寡聚核苷酸，其與野生型基因完全互補(bǔ)，與突變基因部分互補(bǔ)。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中，所述的Block寡聚核苷酸是硫代修飾的。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中，所述的競(jìng)爭(zhēng)性Block寡聚核苷酸包括：SEQIDNO:18和SEQIDNO:19所示核苷酸序列的寡聚核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括(但不限于)：DNA擴(kuò)增試劑，PCR擴(kuò)增緩沖液，說明操作方法的使用說明書。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的試劑盒的用途，用于檢測(cè)EGFR基因T790M(對(duì)應(yīng)于EGFR第790位氨基酸，其密碼子由ACG突變?yōu)锳TG)突變的試劑盒。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的用途為非診斷性的用途。例如，僅應(yīng)用于在實(shí)驗(yàn)室中分析EGFR的變異情況。在本發(fā)明的另一方面，提供一種檢測(cè)EGFR基因T790M突變的方法，所述方法包括：(i)以待測(cè)基因?yàn)槟０?，以所述的試劑盒中的試劑進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(ii)分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，確定待測(cè)樣品中EGFR基因T790M突變類型。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述方法中，若經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，對(duì)應(yīng)于EGFR第790位氨基酸，其密碼子由ACG突變?yōu)锳TG，則判斷為發(fā)生T790M突變。在另一優(yōu)選例中，所述的方法為非診斷性的方法。例如，僅在實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用該方法分析EGFR的變異情況。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。具體實(shí)施方式本發(fā)明人致力于提高EGFR基因突變檢測(cè)的檢測(cè)效率，在進(jìn)行大樣本量的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，EGFR基因中T790M位點(diǎn)前存在的另一單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(SNP：G>A；其變異頻率為41.83％；后文中稱為“前SNP”)是影響T790M突變檢測(cè)效率的因素。對(duì)于含有該SNP變異的樣本，僅采用與該位點(diǎn)為野生型等位基因(野生型中為G)的模板完全匹配的引物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，由于引物中存在不匹配的堿基，會(huì)降低檢測(cè)效率。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人進(jìn)一步優(yōu)化了檢測(cè)EGFR基因T790M位點(diǎn)突變的檢測(cè)試劑。如本文所用，所述的“前引物”與“正向引物”可互換使用，是指針對(duì)EGFR基因的突變位點(diǎn)的引物，所述前引物與突變型模板基本上匹配(例如，存在一個(gè)堿基的錯(cuò)配)或完全匹配。如本文所用，所述的“后引物”與“反向引物”可互換使用。本發(fā)明中，所述的“后引物”對(duì)應(yīng)于EGFR基因的非SNP位點(diǎn)。通常，利用該“后引物”與“前引物”進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得一個(gè)具有合理長(zhǎng)度的擴(kuò)增產(chǎn)物，例如長(zhǎng)度為50-150bp；較佳地為50-100bp。如本文所用，“互補(bǔ)”是指核苷酸的序列之間(如本發(fā)明中前引物序列與EGFR基因T790M突變位點(diǎn)及鄰近位點(diǎn)的序列之間)可以以一種可預(yù)見的方式發(fā)生相互作用，如形成二級(jí)結(jié)構(gòu)(如莖環(huán)結(jié)構(gòu))。通常，兩條“基本上互補(bǔ)”的核苷酸序列互相之間至少有70％的核苷酸是互補(bǔ)的；更優(yōu)選的，至少有80％或90％的核苷酸是互補(bǔ)的。本發(fā)明中，兩條足夠互補(bǔ)的分子之間可以具有1-2個(gè)(較佳地為1個(gè))不配對(duì)的核苷酸。如本文所用，堿基的“匹配”、“配對(duì)”或“完全互補(bǔ)”是指兩條核苷酸序列中相應(yīng)的堿基構(gòu)成了鍵(如氫鍵)的連接，例如“A”與“T”之間可形成鍵。兩條序列中足夠多核苷酸的“配對(duì)”可使得兩條序列發(fā)生互補(bǔ)。如本文所用，堿基的“基本上匹配”是指兩條核苷酸序列中絕大多數(shù)的堿基構(gòu)成了鍵(如氫鍵)的連接，存在個(gè)別(例如1個(gè))堿基的“錯(cuò)配”。如本文所用，所述的堿基“錯(cuò)配”是指兩條核苷酸序列中，存在位置關(guān)系相應(yīng)的兩個(gè)堿基，它們之間不構(gòu)成鍵(如氫鍵)的連接。本發(fā)明以EGFR基因T790M突變?yōu)闄z測(cè)對(duì)象，兼顧了T790M位點(diǎn)前的“前SNP”的影響，設(shè)計(jì)兩種前引物，分別與T790M突變位點(diǎn)以及上述“前SNP”的兩種等位基因型完全互補(bǔ)，以提高檢測(cè)的靈敏度。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)EGFR基因T790M突變的試劑盒，其包括：(a)與EGFR基因T790M突變位點(diǎn)及鄰近位點(diǎn)的序列互補(bǔ)的前引物，所述的前引物長(zhǎng)度為10-25bp，且該前引物的3’末端序列包含“5’-ACTCATCAT-3’”；(b)后引物；該后引物和前引物擴(kuò)增包含基因突變位點(diǎn)在內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為50-100bp；和(c)特異性針對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的探針，所述的探針攜帶可檢測(cè)標(biāo)記。所述的前引物的長(zhǎng)度可以是10-25bp，較佳地可以是10-20bp。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人進(jìn)一步考察了不同長(zhǎng)度的前引物對(duì)于突變基因與野生基因的分辨能力，長(zhǎng)度為12-20bp的引物長(zhǎng)度是更為理想的。作為本發(fā)明的優(yōu)選形式，所述的前引物是選自下組所示核苷酸序列的前 引物：SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5或SEQIDNO:6。組織和血液樣本中，除了突變型DNA，還含有大量野生型DNA，對(duì)于檢測(cè)的特異性造成了干擾。因此，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，針對(duì)EGFR基因T790M突變位點(diǎn)以及上述“前SNP”的兩種等位基因型，還應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性Block寡聚核苷酸來排除野生型DNA的干擾，以進(jìn)一步提高檢測(cè)的特異性。Block寡聚核苷酸與野生型基因完全互補(bǔ)，而與突變基因部分互補(bǔ)，在有野生型基因存在的情況下，Block寡聚核苷酸能夠封閉野生型基因，防止野生型基因擴(kuò)增造成的假陽性。更為優(yōu)選地，所述的競(jìng)爭(zhēng)性Block寡聚核苷酸包括：SEQIDNO:18和SEQIDNO:19所示核苷酸序列的寡聚核苷酸。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的前引物的核苷酸序列中，還設(shè)置一個(gè)與EGFR基因模板中相應(yīng)位點(diǎn)堿基錯(cuò)配的堿基。該錯(cuò)配的堿基設(shè)置于EGFR基因T790M突變位點(diǎn)以及“前SNP”位點(diǎn)以外的區(qū)域上。錯(cuò)配堿基的設(shè)置有利于進(jìn)一步提高檢測(cè)的特異性。更優(yōu)選地，包含錯(cuò)配堿基的前引物序列具有“5’-ACTCATCAT-3’”中第2-8位中任一堿基由其它堿基替換而形成的序列。更為優(yōu)選地，所述的前引物是選自下組所示核苷酸序列的前引物：SEQIDNO:7，SEQIDNO:8，SEQIDNO:9，SEQIDNO:10或SEQIDNO:11，這些前引物中均引入了錯(cuò)配的堿基，檢測(cè)特異性更好。所述的特異性針對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的探針可對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行特異性檢測(cè)。較佳地，所述的探針是帶有可檢測(cè)標(biāo)記的探針，如熒光探針。例如，所述的探針是TaqmanMGB探針，從而便于實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)。TaqMan探針法的核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號(hào)。由于探針與模板是特異性結(jié)合，所以熒光信號(hào)的強(qiáng)弱就代表了模板的數(shù)量。TaqMan探針根據(jù)其3′端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)的不同分為兩種：普通的TaqMan探針和TaqManMGB探針。TaqManMGB探針的淬滅基團(tuán)采用非熒光淬滅基團(tuán)(Non-FluorescentQuencher)，本身不產(chǎn)生熒光，可以大大降低本底信號(hào)的強(qiáng)度。同時(shí)探針上還連接有MGB(MinorGrooveBinder)修飾基團(tuán)。例如，可以選擇FAM熒光信號(hào)或ROX熒光信號(hào)。本發(fā)明所述試劑盒中還包括(但不限于)：DNA擴(kuò)增試劑，PCR擴(kuò)增緩沖液，鎂離子等。以及還可包括說明操作方法的使用說明書，從而有利于本領(lǐng) 域技術(shù)人員方便地實(shí)施檢測(cè)。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)EGFR基因T790M突變的方法，所述方法包括：(i)以待測(cè)基因?yàn)槟０?，以所述的試劑盒中的試劑進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(ii)分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，確定待測(cè)樣品中EGFR基因T790M突變類型。若經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，對(duì)應(yīng)于EGFR第790位氨基酸，其密碼子由ACG突變?yōu)锳TG，則判斷為發(fā)生T790M突變。本發(fā)明所述的方法，可以是臨床診斷方法，也可以是非診斷性的方法。例如，僅在實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用該方法分析EGFR的變異情況，進(jìn)行研究分析，這種實(shí)施方式不面對(duì)患者，不給出診斷結(jié)果，屬于非診斷性的方法。由于每個(gè)樣本的SNP位點(diǎn)是突變還是野生型是未知的，所以在實(shí)際樣本檢測(cè)時(shí)，分別采用兩種前引物和相應(yīng)的BLOCK寡核苷酸單獨(dú)檢測(cè)，只要任何一種引物的檢測(cè)結(jié)果是陽性，則該樣本為T790M突變陽性。這樣，不論SNP位點(diǎn)為野生或突變型，均有相匹配的引物，因而檢出率高于以往只用一種引物(通常是只與野生型SNP配對(duì))的情況。本發(fā)明結(jié)合了兩種高分辨引物，競(jìng)爭(zhēng)性Block寡聚核苷酸和熒光特異探針技術(shù)，可以更準(zhǔn)確和靈敏地檢測(cè)樣本中的T790M突變，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.01％，顯著高于測(cè)序法和傳統(tǒng)的ARMS-PCR方法，尤其是在對(duì)T790M突變含量低的血液樣本的檢測(cè)上顯現(xiàn)了極大的優(yōu)勢(shì)，可用于患者耐藥情況的跟蹤檢測(cè)，為醫(yī)生提供更詳細(xì)的信息，及時(shí)做出用藥調(diào)整。本發(fā)明的試劑盒，可以適用于絕大多數(shù)的復(fù)雜樣本，包括血液標(biāo)本，F(xiàn)FPE樣本；并可用于血液樣本耐藥基因的跟蹤檢測(cè)，及時(shí)的做出用藥調(diào)整。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。材料與方法1、試劑定量PCR檢測(cè)試劑RealtimePCRMasterMix購自日本TOYOBO公司。組織基因組抽提試劑QIAampDNAFFPETissueKit與全血基因組抽提試劑QIAampDNAbloodMiniKit均購自QIAGENChina(shanghai)Co.，Ltd.。血漿游離DNA抽提試劑，核酸提取純化試劑盒(吸附柱法)購自格諾思博生物科技南通有限公司。熒光定量PCR擴(kuò)增儀ABI7300購自AppliedBiosystems公司。PCR所用引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司。TaqmanMGB探針購自LifeTechnologies公司。其余試劑均購自SigmaAldrich公司。2、寡聚核苷酸序列突變檢測(cè)所用引物、TaqmanMGB探針與Block寡聚核苷酸序列見表1。表1、突變檢測(cè)所用引物、探針與Block寡聚核苷酸序列注：引物名稱中，首字母F表示正向引物，首字母R表示反向引物，首字母B表示Block寡聚核苷酸，首字母P表示MGB探針。F-Exon4、R-Exon4、P-Exon4用于檢測(cè)EGFR基因保守區(qū)域4號(hào)外顯子。3、質(zhì)粒構(gòu)建取健康人抗凝血200微升，用全血基因組抽提試劑盒(QIAampDNAbloodMiniKit)抽提得到基因組，用表2中對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增引物(SEQIDNO:20，SEQIDNO:21)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-TVector連接，再將連接產(chǎn)物加入到100微升的DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30分鐘，加入500微升SOC培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)60分鐘，培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液涂布在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-瓊脂平板培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)，形成單菌落。挑選白色菌落，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果證明已成功構(gòu)建“前SNP”與20外顯子T790M位點(diǎn)均為野生型的質(zhì)粒，并命名為T-SNP(wt)-790(wt)。其它質(zhì)粒的構(gòu)建方法如下：以野生型質(zhì)粒T-SNP(wt)-790(wt)為模板，用表2中對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增引物(SEQIDNO:22-SEQIDNO:27)進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物用DpnI酶消化2小時(shí)后，膠回收酶切產(chǎn)物，再將回收產(chǎn)物加入到100微升的DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，與pMD18-TVector進(jìn)行連接，后續(xù)方法同上，經(jīng) 測(cè)序驗(yàn)證正確。構(gòu)建的質(zhì)粒及所用引物見表2。表2、質(zhì)粒類型及構(gòu)建所用引物注：引物名稱中，首字母F表示正向引物，首字母R表示反向引物，首字母B表示Block寡聚核苷酸，首字母P表示MGB探針。4、組織和血漿游離DNA的提取抽提切片樣本的DNA時(shí)，使用QIAGEN公司的石蠟組織DNA提取試劑盒。抽提血漿游離DNA時(shí)，使用格諾思博生物科技南通有限公司的核酸提取純化試劑盒(吸附柱法)。實(shí)施例實(shí)施例1、引物的選擇本發(fā)明人將檢測(cè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)于前引物上，即前引物的3’末端堿基與T790M位點(diǎn)突變型完全互補(bǔ)，因此前引物是區(qū)分突變型與野生型基因的關(guān)鍵。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，由于EGFR基因中在T790M位點(diǎn)相應(yīng)堿基前存在“前SNP”，對(duì)于含有該SNP變異的樣本，僅采用與該位點(diǎn)為野生型等位基因的模板完全匹配的引物，進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，由于引物中存在不匹配的堿基，會(huì)降低檢測(cè)效率。因此，本發(fā)明人設(shè)計(jì)了兩種前引物，分別與T790M突變位點(diǎn)以及上述“前SNP”的兩種等位基因型完全互補(bǔ)。以“前SNP”為變異型的T790M突變檢測(cè)為例，將“前SNP”為變異型、T790M位點(diǎn)為突變型質(zhì)粒[T-SNP(mut)-790(mut)]共20拷貝，摻入到2.0×104拷貝的對(duì)應(yīng)的野生型質(zhì)粒[T-SNP(mut)-790(wt)]中，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，計(jì)算兩者Ct的差值，△Ct＝Ct野生型-Ct突變型。本實(shí)施例應(yīng)用的不同長(zhǎng)度的前引物序列見表3，后引物是R-790，探針是P-790。表3、不同長(zhǎng)度的前引物序列擴(kuò)增反應(yīng)體系見表4。表4、擴(kuò)增反應(yīng)體系組份用量RealtimePCRMasterMix25μL擴(kuò)增引物300nM探針100nM擴(kuò)增模板5μL反應(yīng)程序見表5，在步驟3中61℃退火時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)，檢測(cè)熒光選擇FAM與ROX。表5、擴(kuò)增反應(yīng)程序步驟循環(huán)數(shù)溫度時(shí)間1195℃2min25095℃10sec35061℃30sec結(jié)果見表6。表6、引物的選擇以上結(jié)果顯示，前引物長(zhǎng)度對(duì)于T790M突變檢測(cè)分辨能力有一定的影響，較佳的前引物長(zhǎng)度為12-20bp。在前引物中引入一個(gè)錯(cuò)配堿基，可進(jìn)一步提高檢測(cè)的特異性。實(shí)施例2、競(jìng)爭(zhēng)性Block寡聚核苷酸的作用本發(fā)明人針對(duì)EGFR基因T790M突變位點(diǎn)以及上述“前SNP”的兩種等位基因型，分別設(shè)計(jì)了競(jìng)爭(zhēng)性Block寡聚核苷酸。Block寡聚核苷酸與野生型基因完全互補(bǔ)，而與突變基因部分互補(bǔ)，在有野生型基因存在的情況下，Block寡聚核苷酸能夠封閉野生型基因，防止野生型基因的擴(kuò)增造成假陽性，因此可以提高檢測(cè)的特異性。以“前SNP”為變異型的T790M突變檢測(cè)為例，將“前SNP”為變異型、T790M位點(diǎn)為突變型質(zhì)粒[T-SNP(mut)-790(mut)]共20拷貝，摻入到2.0×104拷貝的對(duì)應(yīng)的野生型質(zhì)粒[T-SNP(mut)-790(wt)]中，在加入或不加競(jìng)爭(zhēng)性Block寡聚核苷酸的條件下，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，計(jì)算兩者CT的差值，以考察Block寡聚核苷酸的作用。本實(shí)施例應(yīng)用的前引物是F-SNP(mut)-9，后引物是R-790，探針是P-790， Block寡聚核苷酸是B-SNP(mut)。擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同實(shí)施例1。結(jié)果見表7。表7、Block效果以上結(jié)果顯示，針對(duì)“前SNP”為變異型的T790M的突變檢測(cè)，在加入競(jìng)爭(zhēng)性Block寡聚核苷酸后，△CT由4.7增加到6.6。由此可見，在有野生型背景存在的情況下，加入競(jìng)爭(zhēng)性Block寡聚核苷酸能夠提高突變檢測(cè)的特異性。實(shí)施例3、擴(kuò)增效率比較將“前SNP”為變異型或野生型，T790M位點(diǎn)為突變型的兩種質(zhì)粒[T-SNP(mut)-790(mut)，T-SNP(wt)-790(mut)]，經(jīng)紫外定量，分別稀釋至4000、400、40、4和0.4拷貝/uL，作為模板，向PCR反應(yīng)體系中加入5μL模板(則每個(gè)反應(yīng)的模板數(shù)分別為20000、2000、200、20和2拷貝/反應(yīng))，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，比較Ct值和擴(kuò)增效率的差異。本實(shí)施例應(yīng)用的兩種質(zhì)粒模板及對(duì)應(yīng)的前引物和Block寡聚核苷酸見表8，后引物是R-790，探針是P-790。擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同實(shí)施例1。結(jié)果見表9。表8、模板質(zhì)粒及對(duì)應(yīng)的前引物和Block寡聚核苷酸應(yīng)用模板質(zhì)粒前引物Block寡聚核苷酸T-SNP(mut)-790(mut)F-SNP(mut)-9B-SNP(mut)T-SNP(wt)-790(mut)F-SNP(wt)B-SNP(wt)表9、擴(kuò)增效率比較結(jié)果以上結(jié)果顯示，分別用與兩種質(zhì)粒模板完全配對(duì)(除引入的一個(gè)錯(cuò)配堿基外)的引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，各濃度梯度的模板Ct值和擴(kuò)增效率一致。實(shí)施例4、靈敏度將“前SNP”為變異型、T790M位點(diǎn)為突變型質(zhì)粒[T-SNP(mut)-790(mut)]梯度摻入到2.0×104拷貝的對(duì)應(yīng)的野生型質(zhì)粒[T-SNP(mut)-790(wt)]中，摻入比例見表10，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，考察兩種引物對(duì)于“前SNP”為變異型的T790M突變檢測(cè)的靈敏度。本實(shí)施例應(yīng)用的兩種前引物分別是F-SNP(mut)-9和F-SNP(wt)，后引物是R-790，探針是P-790，Block寡聚核苷酸分別是B-SNP(mut)和B-SNP(wt)。結(jié)果見表10。表10、靈敏度比較結(jié)果以上結(jié)果顯示，當(dāng)采用與突變型質(zhì)粒[T-SNP(mut)-790(mut)]完全配對(duì)(除引入的一個(gè)錯(cuò)配堿基外)的引物[F-SNP(mut)-9]進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，突變比例在0.01％時(shí)與野生型質(zhì)粒[T-SNP(mut)-790(wt)]仍有較好的區(qū)分度；當(dāng)采用“前SNP”錯(cuò)配的引物[F-SNP(wt)]進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，突變比例在0.01％和0.1％時(shí)與野生型質(zhì)粒的區(qū)分度不佳，檢測(cè)能力僅為1％。實(shí)施例5、對(duì)血漿樣本的檢出能力獲取150例臨床肺癌組織樣本及對(duì)應(yīng)的血漿樣本，對(duì)組織樣本一一進(jìn)行測(cè)序，確定這些樣本的“前SNP”和T790M位點(diǎn)的突變情況。提取對(duì)應(yīng)血漿樣本的基因組DNA，作為模板，分別向PCR反應(yīng)體系中加入5μL模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，考察兩種引物對(duì)于“前SNP”為變異型的臨床肺癌血漿樣本T790M突變的檢出能力。同時(shí)對(duì)EGFR基因第4外顯子的保守區(qū)域進(jìn)行檢測(cè)，作為對(duì)所提取的DNA模板的質(zhì)量和用量進(jìn)行質(zhì)控。通過計(jì)算△Ct(突變Ct值與Exon4質(zhì)控Ct值的差值)進(jìn)行判斷，△Ct<9，樣本為T790M突變陽性，否則為陰性或低于試劑盒的檢測(cè)下限。結(jié)果見表11。本實(shí)施例對(duì)于T790M突變檢測(cè)應(yīng)用的兩種前引物分別是F-SNP(mut)-9和F-SNP(wt)，后引物是R-790，探針是P-790，Block寡聚核苷酸分別是B-SNP(mut)和B-SNP(wt)；對(duì)于保守區(qū)域檢測(cè)應(yīng)用的前引物是F-Exon4，后引物是R-Exon4，探針是P-Exon4。表11、對(duì)血漿樣本檢出能力的比較結(jié)果以上結(jié)果顯示，150例組織樣本經(jīng)測(cè)序，發(fā)現(xiàn)39例T790M突變陽性，其中21例為“前SNP”野生型，18例為“前SNP”變異型。僅采用單一引物[F-SNP(wt)]進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，對(duì)于“前SNP”為野生型的樣本，檢出21例T790M 突變陽性。但是對(duì)于“前SNP”為變異型的樣本，僅檢出7例T790M突變陽性，其余11例為陰性，與對(duì)應(yīng)組織樣本測(cè)序結(jié)果的總體符合率為71.8％，說明“前SNP”錯(cuò)配的引物對(duì)于T790M突變含量低的樣本檢出能力低。而分別采用兩種前引物[F-SNP(mut)-9、F-SNP(wt)]進(jìn)行檢測(cè)，分別與“前SNP”突變型或野生型模板完全配對(duì)(除引入的一個(gè)錯(cuò)配堿基外)，擴(kuò)增效率較高，共檢出39例T790M突變陽性，與測(cè)序符合率為100％，極大提高了對(duì)于血漿樣本檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3