本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)及育種領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因大豆及其應(yīng)用，更具體地，本發(fā)明涉及抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆制備方法、檢測技術(shù)與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：大豆是我國重要的蛋白和油料作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有不可或缺的地位。利用基因工程手段將與抗除草劑有關(guān)的基因轉(zhuǎn)入大豆，育成高抗除草劑大豆品種，可節(jié)約大豆生產(chǎn)中人工除草的成本，降低草害，提高大豆的產(chǎn)量。草甘磷是一種非選擇性的廣譜除草劑，具有高效、低毒、無殘留等優(yōu)點，尤其是對人畜毒害小，是全球應(yīng)用最廣的除草劑之一。草甘膦主要通過抑制5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP合成酶，EPSPS)的活性而阻斷芳香族氨基酸的合成，最終導(dǎo)致受試植物死亡。近年來包括美國和中國在內(nèi)的國家，草甘膦產(chǎn)量急劇增加還與系列轉(zhuǎn)基因抗草甘膦品種的選育和大面積的推廣有直接的關(guān)系。我國目前年產(chǎn)草甘膦約3萬噸，實際生產(chǎn)能力超過4.5萬噸，已成為繼美國之后世界第二大生產(chǎn)和出口國。在轉(zhuǎn)基因抗草甘膦作物方面的研究取得了一些成果，但目前尚無轉(zhuǎn)抗草甘膦基因作物進入商品化階段的報道，這與我國作為世界草甘膦生產(chǎn)和出口第二大國的地位是極不相稱的。特別是入關(guān)以后，這種來自外部的沖擊對我國植物抗草甘膦基因工程研究和草甘膦生產(chǎn)所造成的不利影響將越來越嚴重。EPSP合成酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphatesynthase,EPSPS)是生物體內(nèi)芳香族氨基酸——色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸生物合成過程中的關(guān)鍵性酶；草甘磷是通過抑制EPSP合成酶的活性而阻斷芳香族氨基酸的合成最終導(dǎo)致受試植物死亡。但是某些細菌的EPSP合成酶的活性不被草甘膦所抑制，所以將細菌EPSPS基因的表達在植物體內(nèi)，可以使植物免受除草劑的傷害?？钩輨┺D(zhuǎn)基因大豆的培育，不僅有科學(xué)理論意義，而且有巨大的應(yīng)用價值。將抗除草劑草甘膦的g10-epsps基因轉(zhuǎn)入大豆，通過草甘膦直接篩選得到草甘膦抗性明顯提高的株系，這個技術(shù)的應(yīng)用將為培育無標記基因的高效抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物開辟一條更直接更有效的道路。浙江大學(xué)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將從耐輻射球菌中篩選獲得的抗除草劑基因g10-epsps(CN102321640B)整合到栽培大豆品種“華春3號”中，獲得了32個抗除草性得到提高的轉(zhuǎn)基因大豆新株系。通過實驗研究和中間試驗，已明確了以上株系的遺傳、分子特征及目的基因表達特性，生物學(xué)試驗已證實了基因的整合與表達。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種涉及抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆制備方法、檢測技術(shù)與應(yīng)用。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種大豆轉(zhuǎn)化事件ZUTS-33，所述轉(zhuǎn)化事件ZUTS-33中含有一個外源插入序列，所述外源插入序列的5'端與內(nèi)源基因組DNA構(gòu)成的連接序列如SEQIDNO:1所示，所述外源插入序列的3'端與內(nèi)源基因組DNA構(gòu)成的連接序列如SEQIDNO:2所示。作為本發(fā)明的大豆轉(zhuǎn)化事件ZUTS-33的改進：所述轉(zhuǎn)化事件ZUTS-33的基因組中含有一個外源插入序列，所述外源插入序列的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。本發(fā)明還同時提供了用于鑒定轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33的檢測方法，包括以下步驟：a)設(shè)計特異性識別鑒定5’端T-DNA插入的序列或其互補序列的第一對引物序列SEQIDNO:4(鑒定5’端基因組上序列的引物)和SEQIDNO:5(鑒定T-DNA插入序列的引物)；b)設(shè)計特異性識別鑒定3’端T-DNA插入的序列或其互補序列的第二對引物序列SEQIDNO:6(鑒定5’端基因組上序列的引物)；和SEQIDNO:7(鑒定T-DNA插入序列的引物)。本發(fā)明還同時提供了一種檢測生物樣品中事件ZUTS-33或其子代的方法，包括以下步驟：(a)從所述生物樣品提取DNA樣品；(b)提供DNA引物對，(c)提供DNA擴增反應(yīng)條件；(d)進行DNA擴增反應(yīng)，獲得DNA擴增子；(e)檢測所述DNA擴增產(chǎn)物，其中所述的DNA擴增子SEQIDNO:8和SEQIDNO:9，在所述DNA擴增反應(yīng)中的檢出表明事ZUTS-33的存在。本發(fā)明還同時提供了檢測事件ZUTS-33中外源插入DNA分子的方法，所述方法包括將包含DNA的樣品與多核苷酸探針接觸，所述多核苷酸探針在嚴謹雜交條件(即，滿足雜交溫度在52℃的條件)下，可以特異性檢出ZUTS-33轉(zhuǎn)化事件的DNA，表明ZUTS-33事件的存在，所述多核苷酸探針如SEQIDNO:10所示的序列。本發(fā)明還同時提供了檢測來源于ZUTS-33事件的植物材料的方法，為以下任意一種方法：方法一、該方法包括如下步驟：(a)獲得用于分析的樣品；(b)制備樣品的蛋白質(zhì)提取物；(c)提供抗體，該抗體被設(shè)計成結(jié)合如權(quán)利要求1所述植物中包含的g10-epsps蛋白質(zhì)；(d)溫育所述抗體和蛋白樣品，(e)檢測該抗體是否已經(jīng)結(jié)合；已經(jīng)結(jié)合的抗體的存在表明該樣品來源于ZUTS-33事件；方法二，該方法包括如下步驟：(a)獲得用于分析的樣品；(b)制備樣品的蛋白質(zhì)提取物；(c)提供檢測試紙條，該檢測條被設(shè)計成檢測存在于樣品中的g10-epsps蛋白質(zhì)的存在；(d)溫育檢測條和樣品；(e)檢測g10-epsps蛋白質(zhì)是否存在；g10-epsps蛋白質(zhì)的存在表明該樣品來源于ZUTS-33事件。本發(fā)明還同時提供了用于大豆轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒載體，將權(quán)利要求1所述的核苷酸序列和至少一個控制表達的多核苷酸功能性地連接；表達載體為pSOY19。本發(fā)明還同時提供了一種構(gòu)建抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的方法，通過將外源DNA序列插入受體華春3號大豆基因組第19號染色體的第2854906..2855152區(qū)間，得到轉(zhuǎn)基因大豆；所述外源DNA序列如SEQIDNO:3所示。本發(fā)明還同時提供了用檢測大豆轉(zhuǎn)化事件的引物：第一對引物為：如SEQIDNO:4、SEQIDNO:5所述；第二對引物為：如SEQIDNO:6和SEQIDNO:7所述。本發(fā)明還同時提供了用檢測大豆轉(zhuǎn)化事件的核苷酸探針和抗體：所述核苷酸探針如SEQIDNO:10所示；所述抗體可以特異性識別ZUTS-33轉(zhuǎn)化事件中外源基因g10-epsps的基因表達，g10-epsps的核苷酸序列如SEQIDNO:11所示。即，g10-epsps基因的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列為：G10-EPSPSP含1332個堿基(如SEQIDNO:11所示)，編碼444個氨基酸，序列如下：EKGSDALPATFDVIVHPARELRGELRAQPSKNYTTRYLLAAALAEGETRVVGVATSEDAEAMLRCLRDWGAGVELVGDDAVIRGFGARPQAGVTLNPGNAAAVARLLMGVAALTSGTTFVTDYPDSLGKRPQGDLLEALERLGAWVSSNDGRLPISVSGPVRGGTVEVSAERSSQYASALMFLGPLLPDGLELRLTGDIKSHAPLRQTLDTLSDFGVRATASDDLRRISIPGGQKYRPGRVLVPGDYPGSAAILTAAALLPGEVRLSNLREHDLQGEKEAVNVLREMGADIVREGDTLTVRGGRPLHAVTRDGDSFTDAVQALTAAAAFAEGDTTWENVATLRLKECDRISDTRAELERLGLRARETADSLSVTGSAHLAGGITADGHGDHRMIMLLTLLGLRADAPLRITGAHHIRKSYPQFFAHLEALGARFEYAEATAYRS。具體而言：本發(fā)明還同時提供了上述轉(zhuǎn)化事件在育種中的應(yīng)用；和包含事件ZUTS-33的植物，以及上述植物產(chǎn)生的種子。本發(fā)明還同時提供了一種大豆品種，該大豆品種在其第19號染色體短臂上的2854906—2855152區(qū)間的物理位置上，含有一個g10-epsps基因。本發(fā)明涉及具抗草甘膦能力轉(zhuǎn)基因大豆培育技術(shù)、位于轉(zhuǎn)基因序列側(cè)翼的大豆基組DNA的轉(zhuǎn)基因大豆植物。更具體地，本發(fā)明涉及構(gòu)建抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的方法，即通過將外源DNA序列插入受體華春3號大豆基因組第19號染色體的第2854906..2855152區(qū)間，得到的轉(zhuǎn)基因大豆。本發(fā)明的檢測方法可以鑒定插入的T-DNA和植物基因組DNA結(jié)合區(qū)域并進一步鑒定轉(zhuǎn)基因大豆及其后代的細胞、組織、器官等。本發(fā)明涉及一種構(gòu)建體、一種大豆細胞、組織和器官，一種轉(zhuǎn)化事件ZUTS-33，一種用檢測大豆轉(zhuǎn)化事件的引物，一種用檢測大豆轉(zhuǎn)化事件的核苷酸探針，一種用檢測大豆轉(zhuǎn)化事件的抗體，一種用于大豆轉(zhuǎn)化事件的檢測試紙條,一種用于大豆轉(zhuǎn)化事件的檢測試劑盒。本發(fā)明的構(gòu)建體包括：第一表達盒，包含用在植物中表達的適合啟動子是來源于花椰菜花葉病毒的35S啟動子驅(qū)動和適合的聚腺苷酸化信號，該啟動子可操作地連接編碼g10-epsps的基因；第二個盒子包含g10-epsps的基因,g10-epsps是裝載在雙元載體pSOY19上的，基因編碼區(qū)5’端含有一個來源于擬南芥的葉綠體蛋白前導(dǎo)序列，使目的基因表達產(chǎn)物運往葉綠體組織。該載體的T-DNA區(qū)域只含有g(shù)10-epsps基因的表達框。特別指出，g10-epsps表達時同時可以用做選擇性標記的基因，因此插入序列中沒有抗生素標記基因或報告基因的存在。具體而言，為表達載體pSOY19。利用該構(gòu)建體，能夠有效地將g10-epsps的基因引入大豆品種華春3號的植株中，從而得到攜帶外源基因的大豆植株。由此，可以有效地用于大豆雜交，得到的雜交種也為非轉(zhuǎn)基因。由此，可以通過常規(guī)技術(shù)，例如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將前述構(gòu)建體引入到大豆的細胞、組織或器官中，以使得到可以后續(xù)用于研究、雜交的樣本。因而，在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種大豆細胞、組織或器官。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該大豆細胞、組織或器官中含有前面所述的構(gòu)建體。本發(fā)明提出了一種制備大豆種子的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括以下步驟：將前面所述的構(gòu)建體引入到大豆植株中；以及將所述大豆植株自體受精，以獲得含有前面所述的構(gòu)建體的種子。本發(fā)明還提出了一種特異的側(cè)翼序列，所述"側(cè)翼序列"又稱為"旁側(cè)序列"。5’端旁側(cè)序列如SEQIDNO:1所示，3’端旁側(cè)序列如SEQIDNO:2所示。在本發(fā)明中，所述側(cè)翼序列可用于開發(fā)生物樣品中的事件ZUTS-33的特異性鑒定方法。在一些實施方案中，還公開了ZUTS-33的左邊界和右邊界的側(cè)翼區(qū)域序列，這些側(cè)翼序列可用于設(shè)計特定的引物和探針。本發(fā)明提供了檢測來源于ZUTS-33轉(zhuǎn)基因事件的植物材料的方法，該方法包括獲得用于分析的樣品；從樣品提取DNA；提供設(shè)計用于結(jié)合多核苷酸的引物對，該多核苷酸包含SEQIDNO:4，5和SEQIDNO:6，7的核苷酸序列；擴增位于引物結(jié)合位點之間的區(qū)域；并且檢測擴增產(chǎn)物的存在。因為可以得到SEQIDNO：8，9的插入核苷酸序列。所以可以利用分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的參數(shù)，設(shè)計該檢測方法中使用的本發(fā)明提供的引物對?；镜脑?，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，是聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)。利用瓊脂糖凝膠電泳大小分離后，通過用渙化乙綻染色和用UV光激發(fā)可以觀察來自于該PCR反應(yīng)的擴增產(chǎn)物。本發(fā)明的另一個方面提供了檢測來源于ZUTS-33事件的植物材料的方法，該方法包括獲得用于分析的樣品：提供探針，該探針被設(shè)計成當多核苷酸是單鏈時結(jié)合所述多核苷酸的互補序列，該多核苷酸來自SEQIDNO:10；雜交所述探針和樣品；并且檢測該探針是否已經(jīng)雜交。在進一步實施方式中，所述探針核苷酸來自SEQIDNO:10。例如，探針可以是PCR產(chǎn)物或限制消化片段。在進一步實施方式中，可以用熒光、放射性、酶性或其它適合的標記標記這里所述的探針，以能夠檢測到雜交。在本發(fā)明進一步實施方式中，提供了在嚴格條件下雜交探針和樣品，并且檢測探針是否已經(jīng)雜交的方法。嚴格雜交條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并且包括，例如在約65℃，在含有6xSSC,0.01％SDS和0.25％脫脂奶粉的溶液中雜交，接著在相同的溫度，在含有O.2xSSC和0.1％SDS的溶液中洗滌。基于雜交原理，用于檢測來源于ZUTS-33事件的植物材料的適合技術(shù)包括但不限于Southern印跡，Northern印跡和原位雜交。這些技術(shù)包括溫育探針和樣品，洗滌以移除未結(jié)合的探針和檢測探針是否已經(jīng)雜交。所述的檢測方法取決于探針所附標記的類型，例如，通過X光片曝光和顯影可以檢測放射性標的探針。做為可替代的方案，通過底物轉(zhuǎn)化實現(xiàn)顏色變化可以檢測酶標記的探針。在本發(fā)明的進一步方面，提供了檢測來源于ZUTS-33事件的植物材料的方法，該方法包括獲得用于分析的樣品；制備樣品總蛋白；提供設(shè)計的抗體，該抗體可結(jié)合植物中所包含的g10-epsps蛋白質(zhì)；溫育所述的抗體和樣品；檢測是否該抗體已經(jīng)結(jié)合。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述g10-epsps蛋白質(zhì)包含SEQIDNO:11序列?；谒隹贵w結(jié)合，檢測來源于ZUTS-33事件的植物材料的適合方法包括，但不限于Western印跡，酶聯(lián)免疫吸附測定法(EL1SA)分析。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這些免疫學(xué)技術(shù)。典型的步驟包括:溫育樣品和結(jié)合g10-epsps蛋白質(zhì)的抗體，沖洗以移除未結(jié)合的抗體，和檢測是否抗體已經(jīng)結(jié)合。許多這種檢測方法是基于酶促反應(yīng)的，例如可以用酶諸如辣根過氧化物酶標記抗體，并且在應(yīng)用適合的底物后，檢測顏色改變。適合的抗體可以是單克隆和相應(yīng)的配對抗體。在本發(fā)明的另一方面，提供了檢測來源于ZUTS-33事件的植物材料的方法，該方法包括獲得用于分析的樣品；制備樣品的蛋白質(zhì)提取物；提供設(shè)計用來檢測樣品中g(shù)10-epsps蛋白質(zhì)的存在的檢測條；溫育檢測條和樣品；和檢測g10-epsps蛋白質(zhì)是否存在。用于ZUTS-33的可替代的基于抗體的檢測方法利用檢測試紙條(dipsticks)。典型的步驟包括溫育檢測試紙條和樣品，并且觀察檢測試紙條上存在或不存在有色條帶。有色條帶表明樣品中蛋白質(zhì)的存在。這種測量棒(dipsticks)或檢測試紙條。本發(fā)明是公布的一個轉(zhuǎn)基因事件，主要保護轉(zhuǎn)基因事件中的旁側(cè)序列。檢測技術(shù)利用最新發(fā)明的g10-epsps檢測試紙條與ELISA定量檢測試劑盒(例如為2016101095633的《檢測轉(zhuǎn)基因蛋白g10-epsps的膠體金速測試紙及其使用法》和2016101109176的《轉(zhuǎn)基因蛋白g10-epsps的定量檢測方法及所用試劑盒》)；其他均為現(xiàn)有技術(shù)。附圖說明下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細說明。圖1為pSOY19表達載體的示意圖。圖2為轉(zhuǎn)基因后代的EPSPS引物的PCR檢測結(jié)果圖；Ctr+：質(zhì)粒陽性對照，Ctr-：非轉(zhuǎn)基因的陰性對照，ZUTS-33：轉(zhuǎn)基因的陽性植株。圖3為ZUTS-33轉(zhuǎn)基因大豆葉片中g(shù)10-epsps蛋白表達分析圖；Lane1：Ctr+大腸桿菌表達的g10-epsps蛋白；Lane2-3：ZUTS-33轉(zhuǎn)基因大豆不同株系的葉片中g(shù)10-epsps蛋白；Lane4：Ctr-受體華春3號大豆葉片總蛋白。圖4為不同世代ZUTS-33轉(zhuǎn)基因大豆葉片中g(shù)10-epsps蛋白表達分析圖；Lane1：Ctr+大腸桿菌表達的g10-epsps蛋白；Lane2(T1)：ZUTS-33轉(zhuǎn)基因大豆的T1代葉片中g(shù)10-epsps蛋白；Lane3(T2)：ZUTS-33轉(zhuǎn)基因大豆的T2代葉片中g(shù)10-epsps蛋白；Lane4(T3)：ZUTS-33轉(zhuǎn)基因大豆的T3代葉片中g(shù)10-epsps蛋白；Lane5(T4)：ZUTS-33轉(zhuǎn)基因大豆的T4代葉片中g(shù)10-epsps蛋白；Lane6：Ctr-野生型受體華春3號大豆葉片總蛋白。圖5為大豆各組織中的g10-epsps蛋白表達分析圖；Lane1：Ctr+大腸桿菌表達的g10-epsps蛋白；Lane2：ZUTS-33轉(zhuǎn)基因大豆的根中g(shù)10-epsps蛋白；Lane3：ZUTS-33轉(zhuǎn)基因大豆的莖中g(shù)10-epsps蛋白；Lane4：ZUTS-33轉(zhuǎn)基因大豆的葉片中g(shù)10-epsps蛋白；Lane5：ZUTS-33轉(zhuǎn)基因大豆的籽粒中g(shù)10-epsps蛋白；Lane6：Ctr-野生型受體華春3號大豆葉片總蛋白。圖6為T-DNA插入位置及側(cè)翼序列物理位置圖；ZUTS-33轉(zhuǎn)化事件中，T-DNA括入在大豆第19號染色體短臂近著絲粒處，物理位置為Chr19:2854906..2855152，T-DNA整合導(dǎo)致整合位點處基因組序列缺失245個堿基，缺失序列如SEQIDNO:12所示，該缺失序列未破壞大豆內(nèi)源基因編碼區(qū)。圖7為Southern雜交檢測插入基因的拷貝數(shù)；A.T-DNA區(qū)域的序列結(jié)構(gòu)及Southern雜交預(yù)期結(jié)果。所列的質(zhì)粒和探針位置可知，當pSOY19質(zhì)粒中T-DNA序列進入大豆基因組后，轉(zhuǎn)基因植物基因組DNA經(jīng)HindⅢ和XbaⅠ酶切，用G10探針檢測時，應(yīng)出現(xiàn)大于3kb的條帶，條帶具體大小與插入位點旁鄰基因組序列中相應(yīng)的酶切位點的位置有關(guān)；每一次插入都會在Southern雜交結(jié)果中出現(xiàn)一個雜交帶，也就是說，雜交條帶的數(shù)目代表了插入片段的拷貝數(shù)。B.Southern雜交結(jié)果。ZUTS-33用HindⅢ和XbaⅠ酶切后分別得到了4.9kb和4.7kb左右的條帶(7B)，兩個株系中目的基因都是單拷貝插入(圖7B)圖8為g10-epsps檢測試紙條結(jié)果；A.試紙條圖例說明，陽性檢測結(jié)果在C和T的位置上有紅色條帶；陰性檢測結(jié)果C的位置上有紅色條帶，T位置上無紅色條帶；無效的檢測試紙條在C和T的位置上均無紅色條帶；B.1號試紙條為孟山都CP4轉(zhuǎn)基因大豆葉片蛋白提取液檢測結(jié)果，T位置上無紅色條帶，結(jié)果為g10-epsps陰性；2號試紙條為受體材料華春3號大豆葉片蛋白提取液檢測結(jié)果，T位置上無紅色條帶，結(jié)果為g10-epsps陰性；3-5號試紙條為ZUTS-33轉(zhuǎn)基因大豆葉片蛋白提取液檢測結(jié)果，檢測結(jié)果為g10-epsps陽性。具體實施方式下面根據(jù)具體的實施例對本發(fā)明進行說明。需要說明的是，這些實施例僅僅是為了說明本發(fā)明，而不能以任何方式解釋為對本發(fā)明的限制。另外，除非特別說明，在下面的實施例中所涉及的方法為常規(guī)方法，可以參照《分子克隆實驗指南》第三版或者相關(guān)產(chǎn)品進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。所涉及的參考文獻如下Liu,Y.G.Mitsukawa,N.Oosumi,T.andWhittier,R.F.(1995).EfficientisolationandmappingofArabidopsisthalianaT-DNAinsertjunctionsbythermalasymmetricinterlacedPCR.PlantJ8,457-463(Liu,Y.G.Mitsukawa,N.Oosumi,T.andWhittier,R.F.(1995).利用巢式聚合酶鏈式反應(yīng)方法高效提取并鑒定擬南芥外源插入片段，PlantJ8,457-463)。Song,Z.Y.,Tian,J.L.,Fu,W.Z.,Li,L.,Lu,L.H.,Zhou,L.,Shan,Z.H.,Tang,G.X.,andShou,H.X.(2013).ScreeningChinesesoybeangenotypesforAgrobacterium-mediatedgenetictransformationsuitabilityJZhejiangUnivSciB14,289-298(Song,Z.Y.,Tian,J.L.,Fu,W.Z.,Li,L.,Lu,L.H.,Zhou,L.,Shan,Z.H.,Tang,G.X.,andShou,H.X.(2013).農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因大豆品種的篩選，JZhejiangUnivSciB14,289-298)。實施例1、載體構(gòu)建目的基因與載體構(gòu)建的圖譜：本試驗轉(zhuǎn)基因大豆是通過農(nóng)桿菌攜帶如圖1所示的雙元質(zhì)粒pSOY19轉(zhuǎn)化而成的。該載體從T-DNA區(qū)域從右邊界(T-Border-RB)(序列如SEQIDNO:1所述)到左邊界(T-Border-LB)(序列如SEQIDNO:2所述)區(qū)域全長6284bp，該區(qū)域中除多克隆位點外主要由4個部分組成：1)、能在植物中產(chǎn)生組成型表達的花椰菜花葉病毒35蛋白的啟動子CaMV35Spromoter)；2)、來自擬南芥的信號肽Ch-L,該信號肽可引導(dǎo)其同一表達框編碼的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運至葉綠體內(nèi)，Ch-L編碼的葉綠體引導(dǎo)肽的核苷酸序列如SEQIDNO:13所述，Ch-L編碼的葉綠體引導(dǎo)肽的推導(dǎo)的氨基酸序列為：MAQVSRICNGVQNPSLISNLSKSSQRKSPLSVSLKTQQHPRAYPISSSWGLKKSGMTLIGSELRPLKVMSSVSTA。3)、來自DeinococcusradioduransR1的g10-epsps耐草甘膦基因(序列如SEQIDNO:3所述)，該基因序列與Ch-L位于同一讀碼框；4)CaMV35S蛋白的終止子。LB和RB是T-DNA的邊界。載體中各種元件的名稱、大小和功能等信息列于表1。質(zhì)粒圖中標注了后續(xù)Southern雜交所用的限制性內(nèi)切酶HindIII和XbaI的作用位點。通過裝配下述DNA元件，構(gòu)建如圖1所示的被稱為pSOY19的表達載體。表1、pSOY19載體中各種元件的信息表g10-epsps是裝載在雙元載體pSOY19上的，該載體的T-DNA區(qū)域只含有g(shù)10-epsps基因的表達框，目的基因由來源于花椰菜花葉病毒的35S啟動子驅(qū)動，基因編碼區(qū)5’端含有一個來源于擬南芥的葉綠體蛋白前導(dǎo)序列，使目的基因表達產(chǎn)物運往葉綠體組織。特別指出，插入序列中沒有抗生素標記基因或報告基因的存在。實施例2、大豆轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因方法：大豆轉(zhuǎn)基因采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法(Songetal.,2013)，該方法是農(nóng)桿菌將雙元質(zhì)粒T-DNA左右邊界之間的區(qū)段整合到植物細胞中。轉(zhuǎn)化中的受體細胞是萌動種子子葉節(jié)間未分化的腋芽，將實施例1中構(gòu)建好的帶有g(shù)10-epsps的雙元載體pSOY19轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，農(nóng)桿菌侵染后植物組織與農(nóng)桿菌經(jīng)過4天的共侵染，再將已侵染后的組織置于含有草甘膦和抗生素的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行篩選培養(yǎng)，共四周。培養(yǎng)基中的草甘膦和抗生素分別用于阻止非轉(zhuǎn)化細胞和農(nóng)桿菌的生長。經(jīng)四周叢生芽誘導(dǎo)后，含有大量叢生芽的大豆子葉節(jié)部位被轉(zhuǎn)入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含有草甘膦和抗生素，轉(zhuǎn)基因的幼芽由于具備對草甘膦的抗性，能在含草甘膦的培養(yǎng)基中伸長，伸長后的幼苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)后，生根后幼苗移入土壤中。移入土壤的幼苗在成活后，通過PCR、RT-PCR、Western雜交及草甘膦抗性檢測，篩選獲得轉(zhuǎn)基因植株基因組中含有目的基因的表達盒，而且目的基因表達正常。ZUTS-33轉(zhuǎn)基因大豆是通過以上轉(zhuǎn)基因程序獲得的。實施例3、轉(zhuǎn)基因?qū)W的鑒定和篩選1、大豆葉片DNA提取和PCR鑒定1.1SDS法提取DNA1)、取0.05g磨碎的葉片或種子，加700μlSDS提取液和3μl10mg/ml的蛋白酶K(葉片材料無需加蛋白酶K)，混勻，60℃水浴40min-1h(葉片材料待呈現(xiàn)褐色后取出)，每隔10min顛倒混勻一次。2)、加等體積的酚/氯仿(1：1)輕輕顛倒混勻10min，靜置30min以上，10000g離心10min，取上清液。3)、加等體積的酚/氯仿(1：1)混勻，靜置10min。10000g離心10min，取上清，加2倍體積的無水乙醇，沉淀，靜置10min以上。10,000g離心1min，倒掉上清，用70％或75％的乙醇洗滌沉淀兩次。風(fēng)干，加400μl滅菌蒸餾水溶解。加4μl10mg/mlRNA酶，37℃水浴1h。4)、加等體積氯仿/異戊醇(24：1)，搖勻10min，靜置。10000g離心10min，取上清，加2倍體積的無水乙醇，沉淀。10000g離心1min，倒掉上清，用70％或75％的乙醇洗沉淀兩次。風(fēng)干DNA，加50μl無菌蒸餾水溶解，-20℃保存。5)、紫外分光光度計SpectrophotometerND-1000檢測DNA濃度，每次上樣量為1.5μl。瓊脂糖電泳檢測DNA濃度：配制0.8％瓊脂糖電泳液，加適量EB。電泳條件U＝120V，I＝140mA。經(jīng)檢測，所得DNA濃度為：1μg/μl。1.2目的基因的PCR檢測1)通過多聚酶鏈式反應(yīng)(PCR)檢測目的基因是否已經(jīng)整合到大豆基因組中。目的基因的引物序列如表2所示。PCR反應(yīng)體系為：基因組DNA2μl，2.5mM的dNTP0.8μl，10xPCRloadingbuffer2μl，10μMprimer1和10μMprimer2各0.2μl，Taq酶0.3μl，ddH2O14.5μl，總體積為20μl。PCR反應(yīng)程序為：94℃，5min；94℃，30s；56℃，30s；72℃，30s；32個循環(huán)以后72℃，10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，制作1％的瓊脂糖凝膠，將PCR產(chǎn)物點樣電泳20分鐘，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照。采用g10-epsps基因內(nèi)部引物擴增，目的條帶為1133bp，如圖2中所示。轉(zhuǎn)基因陽性株系均能擴增出目的條帶，ZUTS-33為本發(fā)明公布的研究材料。表2.目的基因PCR檢測引物序列信息1.3大豆葉片蛋白的提取、ELISA和Western檢測在各轉(zhuǎn)基因株系PCR陽性植株中取葉片樣本提取總蛋白進行Western檢測。具體方法如下：大豆V3期葉片樣品在液氮中研磨至粉末狀后移至離心管中，加入預(yù)冷的蛋白提取液(0.1M醋酸鉀，20mMCaCl2，2mMEDTA，0.1mM苯甲基磺酰氟，20％甘油，pH5.4)，混合均勻，12000g，4℃，離心15min，取上清。用10％SDS-PAGE膠電泳分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜置于TBSTM(0.01MTris-HCl，0.5MNaCl，0.05％Tween-20，5％脫脂奶粉)中，室溫孵育1h；在TBSTM中按1/500加入兔抗g10-epsps蛋白的抗體，孵育1h；用TBST(0.01MTris-HCl，0.5MNaCl，0.05％Tween-20)洗膜3次，每次5min；在TBSTM中按1/10000加入山羊抗兔二抗，孵育1h；用TBST洗膜3次，每次5min。顯色的方法有二種，包括辣根過氧化物酶HRP-ECL發(fā)光法或堿性磷酸酶AP-NBT/BICP顯色法。HRP-ECL發(fā)光法：將發(fā)光液按1：1比例稀釋混合至1ml。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于1ml發(fā)光液的液滴上，黑暗放置5min左右后濾紙貼角吸干，置于化學(xué)發(fā)光掃描儀內(nèi)自動曝光掃描成像。結(jié)果如圖3所示，根據(jù)圖3，我們得知：ZUTS-33轉(zhuǎn)基因大豆葉片總蛋白中檢測到與預(yù)期g10-epsps蛋白大小相符的目標蛋白條帶。正對照Ctr+大腸桿菌中表達的g10-epsps；負對照Ctr-受體大豆華春3號大豆葉片總蛋白材料。雙抗體間接酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA)可用于有效地檢測g10-epsps蛋白質(zhì)含量，用大腸桿菌中表達后純化的g10-epsps蛋白質(zhì)作為標準參照蛋白，建立標準曲線，然后通過外推法得到測試樣品中的g10-epsps含量。方法簡述如下：從待檢樣本(根，莖，葉片，籽粒)中提取蛋白，得蛋白提取液；用g10-epsps定量檢測試劑盒對蛋白提取液進行檢測，檢測過程包括加樣、孵育、洗滌、加酶、孵育、洗滌、顯色、終止和讀數(shù)；通過用g10-epsps蛋白標準品制作的濃度-吸光度標準曲線，計算待檢樣品中的g10-epsps蛋白濃度。表3、轉(zhuǎn)基因大豆株系ZUTS-33葉，莖，根，籽粒EPSPS表達量轉(zhuǎn)基因材料編號葉(μg/g)莖(μg/g)根(μg/g)籽粒(μg/g)I-L2-177.9443.6530.49420.88I-L2-258.0168.2165.98309.11I-L2-325.0625.4825.02218.22II-L2-182.2228.3525.02703.43II-L2-250.5029.2848.05467.35II-L2-369.8755.6551.991019.15III-L2-175.9926.5028.03403.83III-L2-253.4227.4733.64611.68III-L2-370.7529.5610.14313.19平均值63.6239.0135.37496.32標準差19.5215.6516.97247.62根據(jù)上述表3，我們得知：ZUTS-33轉(zhuǎn)基因大豆在根，莖，葉籽粒中均能檢測到g10-epsps蛋白的表達。實施例4、轉(zhuǎn)基因株系目的基因的遺傳穩(wěn)定性本次中間試驗中對ZUTS33轉(zhuǎn)基因事件目的基因g10-epsps的遺傳分離情況進行了分析。田間種植的三個轉(zhuǎn)基因事件、三個除草劑劑量處理和三個重復(fù)的植株均表現(xiàn)出穩(wěn)定的除草劑抗性。對各小區(qū)植株進行取樣，PCR鑒定的方法分析了目的基因是否存豐，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各轉(zhuǎn)基因植株的目的基因存在與否與其對草甘膦的抗性重合，三個轉(zhuǎn)基因事件在田間種植的植株在g10-epsps基因插入位點表現(xiàn)為純合。轉(zhuǎn)基因株系目的基因的表達：為了檢測目標蛋白g10-epsps在各轉(zhuǎn)基因世代中的穩(wěn)定性，試驗中對轉(zhuǎn)基因株系ZUTS-33不同世代的植株葉片提取蛋白后進行Western雜交分析。由圖4可見，轉(zhuǎn)基因株系ZUTS-33不同世代植株葉片中均能檢測到很高含量的g10-epsps蛋白，目的基因表達在各世代間穩(wěn)定。為了檢測目標蛋白g10-epsps在轉(zhuǎn)基因植株不同部位的表達，試驗對轉(zhuǎn)基因株系ZUTS-33T3代植株根、莖、葉和種子樣品提取蛋白后進行Western雜交分析。由圖5可見，轉(zhuǎn)基因株系ZUTS-33植株根、莖和葉片中均能檢測到很高含量的g10-epsps蛋白。實施例5、轉(zhuǎn)化事件的側(cè)翼序列分析以實施例3中所得到的轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33純合植株的基因組DNA為模板，pSOY19載體作為陽性對照，大豆轉(zhuǎn)化受體華春3號作為陰性對照，利用TAIL-PCR擴增T-DNA旁側(cè)序列，獲得轉(zhuǎn)化事件ZUTS-33的T-DNA旁側(cè)序列，并分析驗證T-DNA的整合方式。利用普通PCR驗證推測的T-DNA整合方式，并分析外源基因是否插入大豆內(nèi)源基因內(nèi)部。通過熱不對稱PCR擴增獲得了插入序列右邊界旁的側(cè)翼序列。TAIL-PCR的所用的引物見表4。表4、TAIL-PCR引物序列引物名稱引物序列(5’-3’)RB0bCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTRB1bACGATGGACTCCAGTCCGGCCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCRB2bGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTAD2NGTCGASWGANAWGAA將提取的大豆基因組DNA適當稀釋，測定并記錄其在260nm和280nm的紫外光吸收率，以一個OD260值相當于1μg/μLDNA濃度來計算純化的DNA濃度。DNA溶液OD260/OD280的比值在1.7～2.0之間。4℃保存一周內(nèi)使用。根據(jù)劉耀光等人設(shè)計的改進過的熱不對稱交錯PCR法(THERMALASYMMETRICINTERLACEDPCRTAIL-PCR)(Liuetal.,1995；)，在外源括入的T-DNA上設(shè)計3條嵌套的特異引物(SPECIALPRIMER,RB0b,RB1b,RB2b)，將RB0b與隨機簡并引物(LONGARBITRARYDEGENERATEPRIMER，LAD)組合，而RB1b和RB2b分別與錨走引物AD2組合，以基因組DNA為模板，根據(jù)引物長短和特異性差異設(shè)計不對稱的溫度循環(huán)，進行TAIL-PCR。其中，反應(yīng)流程如表5所示。根據(jù)不同的引物設(shè)定PCR擴增條件，并將PCR產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠檢測。表5、TAILPCR的條件如下：將獲得的旁側(cè)序列進行測序分析，并與數(shù)據(jù)庫https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html，發(fā)布時間2010，GlycinemaxWm82.a2.v1(Soybean)中大豆基因組序列進行比對，發(fā)現(xiàn)在ZUTS-33轉(zhuǎn)化事件中，T-DNA括入在大豆第19號染色體短臂近著絲粒處，物理位置為Chr19:2855152..2854906，未插入大豆內(nèi)源基因編碼區(qū)，上游基因Glyma.19G024400的物理位置為Chr19:2831599..2837777，距上游基因的起始密碼23554bp。下游基因Glyma.19G024500的物理位置為Chr19:2893626..2895846，距下游基因的終止密碼子40940bp。T-DNA整合導(dǎo)致整合位點處基因組序列缺失245個堿基，缺失序列如SEQIDNO:12所示，該缺失序列未破壞大豆內(nèi)源基因編碼區(qū)(圖6)。利用序列如前SEQIDNO:4和5所描述的插入位點5‘端兩對引物及利用序列如前SEQIDNO:6和7所描述插入位點3’端的兩對引物進行PCR進一步確認插入基因組內(nèi)的旁側(cè)序列，PCR擴增結(jié)果，5‘端插入序列的旁側(cè)序列如序列如前SEQIDNO:8所示，3‘端插入的旁側(cè)序列如前SEQIDNO:9所示。通過分析轉(zhuǎn)化事件中外源T-DNA片段的測序結(jié)果，驗證了T-DNA插入大豆基因組的旁側(cè)序列。實施例6、轉(zhuǎn)化事件中外源基因整合穩(wěn)定性分析為了驗證上述轉(zhuǎn)化事件中外源基因括入物的拷貝數(shù)和完整性，本發(fā)明采用Southernblot印記分析的方法對上述轉(zhuǎn)化事件進行分析。根據(jù)載體中的T-DNA序列設(shè)計探針，其中用于檢測轉(zhuǎn)化事件ZUTS-33中目的基因(包含g10-epsps)的探針序列如SEQIDNO:10所示.以轉(zhuǎn)基因大豆株系ZUTS-33的T2、T3和T4代植株，和轉(zhuǎn)化受體材料華春3號為實驗材料，通過以下的實驗流程進行Southernblot印記分析。1、DNA提取按中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T674操作，提取大豆基因組DNA。將DNA適當稀釋，測定并記錄其在260nm和280nm的紫外光吸收率，以一個OD260值相當于50mg/mlDNA濃度來計算純化的DNA濃度。DNA溶液。D260/0D280的比值在1.7～2.0之間。依據(jù)測得的濃度將DNA溶液稀釋到100ng/μL，4℃保存一周內(nèi)使用。分別用HindⅢ和XbaⅠ充分酶切消化轉(zhuǎn)化體ZUTS-33T2、T3和T4代植株基因組DNA30μg。2、地高辛標記探針(隨機引物法)1ug模板DNA，用無菌ddH2O稀釋到16ul；沸水浴煮10min，立即放入冰中；混勻DIG-HighPrime，取4ulDIG-HighPrime到上述20ul變性DNA中，混勻，稍加離心；37℃反應(yīng)過夜(約20小時)；加入2ulO.2MEDTA(Ph8.0)或650C10min終止反應(yīng)。3、檢測探針效率將對照探針和標記好的探針進行一系列稀釋后，直接點在膜上，通過標準檢測未確定目的探針的標記效率。4、電泳和轉(zhuǎn)膜(1)制備1％瓊脂糖凝膠，恒壓45V電泳過夜；(2)指示劑距加樣孔6-8cm左右時停止電泳。切掉加樣孔及多余的膠，切掉左下角作標記；(3)將凝膠浸入200ml，0.25MHCl中進行脫口票嶺處理約5-10min；(4)將凝膠取出在去離子水中漂洗一下后，浸入變性液中，2X15min；(5)將凝膠取出，在去離子水中漂洗一下，然后浸入中和液中，2X15min；(6)將凝膠取出在去離子水中漂洗一下后，進行毛細轉(zhuǎn)移；(7)DNA的毛細轉(zhuǎn)移：大培養(yǎng)皿中盛20XSSC→上架玻璃板→玻璃板上鋪厚濾紙→趕氣泡→將凝膠加樣孔朝下放在濾紙橋上→周圍用Parafilm膜蓋住→膠上放等大的尼龍膜→趕氣泡→膜上放四層與膜等大的濾紙→趕氣泡→上放10cm厚的紙巾→放玻璃板→上壓500g重物；(8)毛細轉(zhuǎn)移24h，取出膜在2XSSC中洗一下，夾于濾紙中，夾于濾紙中，254nmUV，紫外交聯(lián)30min。5、雜交(1)預(yù)雜交:將膜浸入預(yù)熱到雜交溫度的(52℃)DIGEasyHyb中，10ml/100cm2，在雜交箱中52℃，60rpm，預(yù)雜交1h；(2)將DNA探針(約25ng/mlDIGEasyHyb)在100℃變性10min后，立即放到冰上，冷卻10min；(3)將變性的DNA探針加到預(yù)熱的(52℃)DIGEasyHyb中(3.5ml/100cm2膜)，輕柔淚勻，避免泡沫；(4)倒掉預(yù)雜交液，將雜交液倒入雜交瓶中，52℃，60rpm，雜交12-16小時；(5)雜交結(jié)束，回收雜交液，-20℃可保存1年，再用時68℃加熱10min重新變性探針。6、洗膜1)低嚴謹性(高鹽，低溫):充足的2XSSC+O.l％SDS，室溫60rpm洗滌2X15min；2)高嚴謹性(低鹽，高溫):0.5XSSC+0.1％SDS(預(yù)熱到洗滌溫度)，60rpm洗滌2X15min。注:如果探針>150bp且G/C％較高，應(yīng)當在680C洗膜；短于100bp時，洗滌溫度同雜交溫度。7、檢測應(yīng)用化學(xué)發(fā)光檢測法，所有操作都在室溫進行。1)雜交結(jié)束并洗膜后，在Washingbuffer中短暫沖洗膜約1-5min；2)在80mlBlockingsolution中封閉30min(輕搖)；3)在20mlAntibodysolution中反應(yīng)40min；4)轉(zhuǎn)移膜入新容器，用Washingbuffer洗兩次，每次15min；5)在20mlDetectionbuffer中平衡2-5min的將膜DNA面朝上小心放入雜交袋中，吸取1mlCSPDready-to-use(Kit瓶5)均勻應(yīng)用到膜上，立即將雜交袋的上層蓋在膜上，使底物均勻布滿膜表面，并且避免氣泡產(chǎn)生，室溫反應(yīng)5min；6)擠出多余液體，將雜交袋的邊緣封住(防止膜干燥)；的將膜放在3rC，10min，以強化發(fā)光反應(yīng):的曝光X膠片15-25min，觀察結(jié)果。結(jié)論如下：ZUTS-33的基因組DNA分別用HindⅢ和XbaⅠ充分酶切后，根據(jù)目的基因設(shè)計探針進行Southernblot結(jié)果顯示該株系T2、T3和T4代植株的單株HindⅢ的酶切結(jié)果中均有4.9kb的信號條帶(表6、圖7)，XbaⅠ的酶切結(jié)果中均有4.7kb的信號條帶(表6,圖7)實際觀察片段與轉(zhuǎn)化體上預(yù)期片段大小(即4.9kb與4.7kb)相符(表明均為1個拷貝。代際間條帶大小相同，拷貝數(shù)一致，表明轉(zhuǎn)化體ZUTS-33的目的基因在T2、T3和T4代之間穩(wěn)定遺傳。轉(zhuǎn)化體ZUTS-33的T2、T3和T4代植株中外源基因整合穩(wěn)定性的Southernblot分析結(jié)果以轉(zhuǎn)化受體華春3號DNA作為陰性對照，將質(zhì)粒DNA加入到華春3號基因組DNA中作為陽性對照，探針在此雜交條件下能夠與靶標序列順利結(jié)合。綜上所述，根據(jù)轉(zhuǎn)化體ZUTS-33上T-DNA序列、括入位點旁側(cè)序列、探針位置及酶切位點，可以預(yù)測雜交片段大小。將實際觀察與預(yù)測相比較，從而證實外源基因的拷貝數(shù)。表6、拷貝數(shù)檢測結(jié)果顯示：ZUTS-33用HindⅢ和XbaⅠ酶切后分別得到了4.9kb和4.7kb左右的條帶(圖7B)，目的基因是單拷貝插入(圖7B)。實施例7、通過ELISA方法檢測轉(zhuǎn)化事件中g(shù)10-epsps蛋白的表達分析分別提取轉(zhuǎn)基因大豆株系T4代三葉期根、莖、葉、六葉期，九葉期葉片，生育期的成熟籽粒時期種子的總蛋白，研究目標基因g10-epsps的蛋白在不同生長階段不同組織中的蛋白表達水平。目標基因g10-epsps的蛋白的氨基酸序列如前SEQIDNo.11所示。1、標準品配制用1mL稀釋液溶解EPSPS標準品凍干粉，此溶液濃度為2ppb(2ug/mL)；取2ppbEPSPS標準品300μL，加入TBA緩沖液(0.1MTris,0.1MNa2B4O7·10H2O,0.01MMgCl2,0.05％(v/v)Tween-20pH7.8，300μL，此溶液濃度為1ppb；取1ppbEPSPS標準品300μL，加入TBA緩沖液(0.1MTris,0.1MNa2B4O7·10H2O,0.01MMgCl2,0.05％(v/v)Tween-20pH7.8，300μL，此溶液濃度為0.5ppb；取0.5ppbEPSPS標準品300μL，加入TBA緩沖液(0.1MTris,0.1MNa2B4O7·10H2O,0.01MMgCl2,0.05％(v/v)Tween-20pH7.8，300μL，此溶液濃度為0.25ppb；取0.25ppbEPSPS標準品300μL，加入TBA緩沖液(0.1MTris,0.1MNa2B4O7·10H2O,0.01MMgCl2,0.05％(v/v)Tween-20pH7.8，300μL，此溶液濃度為0.125ppb。2、樣品蛋白制備(1)葉片前處理方法：取5-10mm2的葉片樣本，放入1.5mL離心管中搗碎，加入250μL的TBA緩沖液，振蕩混勻5分鐘，4000rpm離心3分鐘，取100μL上清用于分析。種子前處理方法：取0.1g碾碎后的種子樣本，放入1.5mL離心管中，加入1mlTBA緩沖液，振蕩混勻5分鐘，4000rpm離心3分鐘，取100μL上清用于分析。(2)加標準品或未知濃度樣品：將100μL的TBA緩沖液(空白對照)/標準品/未知濃度樣品加入到對應(yīng)的微孔中，輕輕振蕩混勻，25℃避光環(huán)境中反應(yīng)45min。(3)洗板：將孔內(nèi)液體甩干，用250μL洗滌液/孔，充分洗滌3次，每次間隔1min，用吸水紙拍干。(4)加酶標抗體：加入酶標抗體100μL/孔，輕輕振蕩混勻，25℃避光環(huán)境中反應(yīng)45min，取出重復(fù)步驟(3)所述的洗板。(5)顯色：加入顯色劑100μL/孔，置于25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15min。(6)終止與測定：加入100μL終止液/孔，輕輕振蕩混勻，酶標儀設(shè)定至450nm，測定每孔OD值(優(yōu)選用雙波長450/630nm進行檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))3、定量分析(1)標準品吸光度值的計算，標準品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)減去樣品提取液(本底)的吸光度值。(2)標準曲線的繪制與計算以標準品吸光度值為縱坐標，以EPSPS標準品濃度(ppb)的為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的吸光度值代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度。若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。4、轉(zhuǎn)化事件中各個發(fā)育時期不同器官的g10-epsps蛋白量ELISA結(jié)果表7ZUTS-33轉(zhuǎn)基因大豆葉，莖，根，籽粒EPSPS表達量根據(jù)上述表7，我們得知：ZUTS-33在營養(yǎng)生長的三葉期，六葉期，九葉期及生育期的大豆籽粒中均檢測到g10-epsps的表達。實施例8、通過檢測試紙條進行g(shù)10-epsps檢測1、將約2cm2的一片葉片組織放置在含有提取TBA緩沖液(0.1MTris,0.1MNa2B4O7·10H2O,0.01MMgCl2,0.05％(v/v)Tween-20pH7.8的試管中。通過用塑料攪拌器切割和浸解組織，從組織提取蛋白質(zhì)。葉片組織包括孟山都CP4轉(zhuǎn)基因大豆葉片作為陰性對照，受體大豆華春3號葉片作為陰性對照，ZUTS-33轉(zhuǎn)基因大豆葉片為待測材料。大豆種子的檢測方法：取粉碎好的大豆樣本1g，轉(zhuǎn)移到做好標記的容器中，加5mLPBS溶解，蓋好容器的蓋子，用力上下振蕩20～30s，確保樣品與提取緩沖液充分混勻。靜置等待固體物質(zhì)沉淀分層，將上清稀釋不同倍數(shù)加入樣品杯，待測。2測量棒檢測檢測條被放置在試管中，并且溫育5-10分鐘以產(chǎn)生結(jié)果。檢測條包含和對照抗體結(jié)合的第一條帶，和抗g10-epsps抗體結(jié)合的第二條帶。溫育后，檢測條結(jié)果視窗中雙紅色線表明存在g10-epsps。下邊的線表明g10-epsps蛋白質(zhì)的存在，而上邊的線是對照，表明該檢測方法正確地工作。檢測結(jié)果如圖8。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁1 2 3