本發(fā)明涉及一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因蛋白cry1ab/ac的膠體金免疫檢測(cè)盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：蘇云金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis，簡(jiǎn)稱bt)殺蟲晶體蛋白基因抗蟲基因在棉花和玉米等作物上得到了很成功的應(yīng)用。根據(jù)編碼基因序列的同源性和編碼蛋白的殺蟲譜，bt殺蟲晶體蛋白劃分為cry族和cryt族，每一類下又分為數(shù)量不等的亞類。目前在植物中表達(dá)的bt基因有btcry1aa，cry1ab，cry1ac，cry2aa，cry3bb，cry9c。btcry1ab/ac蛋白具有非常高的相似度，目前市場(chǎng)上商業(yè)化的作物中的轉(zhuǎn)btcry1ac蛋白基因已包含btcry1ab蛋白基因。免疫檢測(cè)試劑盒已廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花、玉米種子質(zhì)量檢測(cè)、真?zhèn)舞b定，食品中轉(zhuǎn)基因成分分析及生物安全性的研究。但是現(xiàn)有的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因蛋白cry1ab/ac方法較為繁瑣，而且靈敏度不高，不能滿足市場(chǎng)的需求。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因蛋白cry1ab/ac方法較為繁瑣，而且靈敏度不高，不能滿足市場(chǎng)的需求的缺陷，提供一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因蛋白cry1ab/ac的膠體金免疫檢測(cè)盒及其應(yīng)用。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因蛋白cry1ab/ac的膠體金免疫檢測(cè)盒，包括預(yù)處理pcr管和檢測(cè)試紙；所述檢測(cè)試紙由樣品墊、標(biāo)記墊、硝酸纖維素膜和吸收墊順次搭接粘貼在底板上構(gòu)成；所述標(biāo)記墊上涂覆有膠體金標(biāo)記的抗地高辛抗體，所述硝酸纖維素膜包括包被有抗fitc抗體的檢測(cè)區(qū)和包被有二抗的控制區(qū)；所述預(yù)處理pcr管內(nèi)包括地高辛標(biāo)記序列、fitc標(biāo)記序列、taq酶、dntp和buffer，所述地高辛標(biāo)記序列為gctcctacaaatgccatcattgc，所述fitc標(biāo)記序列為gatagtgggattgtgcgtcatccc。進(jìn)一步的，所述的檢測(cè)試紙中的樣品墊的大小為4mm×15mm，標(biāo)記墊的大小為3mm×4mm，硝酸纖維素膜的大小為4mm×28mm，吸收墊的大小為4mm×19mm。進(jìn)一步的，所述的檢測(cè)試紙的整體外部包裹有外殼，該外殼上對(duì)應(yīng)于所述樣品墊處設(shè)置有加樣孔，外殼上對(duì)應(yīng)于檢測(cè)區(qū)(t)和控制區(qū)(c)處設(shè)置有觀察孔。進(jìn)一步的，所述抗地高辛抗體的涂覆量為5ng-50ng，硝酸纖維素膜上抗fitc抗體的量為0.4μg-1.2μg。進(jìn)一步的，所述抗地高辛抗體的涂覆量為40ng，硝酸纖維素膜上抗fitc抗體的量為0.8μg。進(jìn)一步的，所述檢測(cè)試紙的干燥溫度為37℃，時(shí)間為30min。本發(fā)明的具體檢測(cè)步驟及原理如下：核酸引物對(duì)分別修飾地高辛與fitc，對(duì)提取的檢測(cè)樣本進(jìn)行pcr反應(yīng)；在加樣孔中加入反應(yīng)產(chǎn)物溶液并水平放置；反應(yīng)產(chǎn)物溶液沿樣品墊滲透至膠體金標(biāo)記抗體的試紙條，如果樣品溶液中含核酸那么pcr擴(kuò)增產(chǎn)物將與檢測(cè)卡上的抗地高辛抗體結(jié)合，并與nc膜上的抗fitc抗體結(jié)合，8-10min后，可于觀察孔中觀察到檢測(cè)區(qū)(t)的顏色變化，即t出現(xiàn)陽(yáng)性條帶；如果樣品溶液中不含對(duì)應(yīng)核酸，那么檢測(cè)區(qū)則觀察不到陽(yáng)性條帶。而無論樣品溶液中是否含對(duì)應(yīng)核酸，當(dāng)樣品溶液到達(dá)硝酸纖維素膜時(shí)，檢測(cè)卡上的抗地高辛抗體均可與控制區(qū)包被的二抗結(jié)合，從而顯色。因此，本發(fā)明專利核酸膠體金免疫檢測(cè)卡的結(jié)果判斷規(guī)則為：陰性結(jié)果(-)：只出現(xiàn)1條c線；陽(yáng)性結(jié)果(+)：同時(shí)出現(xiàn)t線和c線；本發(fā)明的檢測(cè)盒可以應(yīng)用在檢測(cè)cry1ab/ac中，較現(xiàn)有的凝膠電泳紫外成像檢測(cè)相比，具有以下特有優(yōu)勢(shì)。(1)操作簡(jiǎn)單，不需要專門的儀器設(shè)備，可直接肉眼觀察pcr擴(kuò)增結(jié)果；(2)檢測(cè)時(shí)間短，僅需8-10min；結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一，即陰性結(jié)果(-)，只出現(xiàn)1條c線；陽(yáng)性(+)：同時(shí)出現(xiàn)t線和c線。本發(fā)明專利的檢測(cè)核酸膠體金免疫檢測(cè)卡可針對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行快速、現(xiàn)場(chǎng)和靈敏的檢測(cè)。附圖說明附圖用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實(shí)施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：圖1是本發(fā)明的檢測(cè)試紙的結(jié)構(gòu)示意圖；其中，1為結(jié)果觀察孔，2為控制區(qū)(c)，3為檢測(cè)區(qū)(t)，4為加樣孔。具體實(shí)施方式以下對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實(shí)施例首先，制作檢測(cè)試紙?jiān)谏蠈拥乃芰习蹇l上設(shè)置兩個(gè)孔，加樣孔和觀察孔，加樣孔大小為3mm×7mm，觀察孔大小為4mm×18mm。在塑料卡條下方并排粘貼樣品墊和固定有膠體金標(biāo)記的特異性單克隆抗體的金標(biāo)墊、醋酸纖維素膜以及吸收墊。在金標(biāo)墊上固定40ng抗地高辛抗體，在醋酸纖維素膜上的檢測(cè)區(qū)固定0.8μg抗fitc抗體以及在控制區(qū)固定二抗。然后置于37℃真空干燥30min，如圖1所示。然后，設(shè)計(jì)地高辛標(biāo)記序列、fitc標(biāo)記序列的目標(biāo)核酸引物名稱序列修飾cry1ac引物1gctcctacaaatgccatcattgc地高辛cry1ac引物2gatagtgggattgtgcgtcatcccfitc接下來對(duì)不同的待測(cè)樣本進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr擴(kuò)增方法如下：pcr驗(yàn)證以ddh2o為陰性對(duì)照，陽(yáng)性樣本基因組為陽(yáng)性對(duì)照最后檢測(cè)結(jié)果的判斷如下：樣本名稱樣本屬性檢測(cè)結(jié)果結(jié)果判斷樣本1含有cry1act、c顯色cry1ac檢出樣本2不含cry1acc顯色，t不顯色cry1ac未檢出最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12