本發(fā)明涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及利用htrf技術(shù)篩選ubc12/dcn1小分子抑制劑的方法。

背景技術(shù)：

泛素(ubiquitin)可共價(jià)結(jié)合并修飾細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)，使其多聚泛素化被26s蛋白酶體識(shí)別而降解，這種蛋白質(zhì)翻譯后修飾已經(jīng)成為當(dāng)今細(xì)胞分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。目前各種類(lèi)泛素修飾蛋白也不斷被發(fā)現(xiàn)，如sumo(smallubiquitin-relatedmodifier)、nedd8(neuralprecursorcell-expresseddevelopmentallydownregulated8)、atg8(autophagygene8)和atg12等。其中，nedd8與泛素高度同源，具有60％的一致性和80％的相似性。nedd8特異性地結(jié)合到底物蛋白賴(lài)氨酸殘基上的修飾過(guò)程被稱(chēng)為neddylation，neddylation與泛素化類(lèi)似,也需要經(jīng)過(guò)nedd8特異性e1、e2、e3將nedd8傳遞到底物crls(cullin-ring-ubiquitinligases)上。nae(appbp1/uba3異質(zhì)二聚體)活化nedd8并將其轉(zhuǎn)移到e2結(jié)合酶ubc12或ube2f上，然后e2結(jié)合酶和e3連接酶相互作用使nedd8與crls上的cullin蛋白c端賴(lài)氨酸殘基結(jié)合，進(jìn)而活化crls加速其底物蛋白的降解(huangetal.,2009；lecketal.,2010；lietal.,2014)。neddylation通路異?？梢哉T發(fā)癌癥(gaoetal.,2014；lietal.,2014)及免疫應(yīng)答疾病(lenegrate,2012；mathewsonetal.,2013)。抑制neddylation通路可以引起細(xì)胞周期阻滯、衰老或凋亡，從而抑制細(xì)胞增殖；也可以抑制iκb的泛素化降解從而減少nf-κb的移位和活化，進(jìn)而抑制免疫應(yīng)答疾病。

在neddylation過(guò)程中e2結(jié)合酶發(fā)揮重要作用，首先e2與e1結(jié)合，nedd8傳遞到e2上與e2形成硫酯鍵。對(duì)于ringe3，e2與e3相互作用將nedd8直接傳遞到crls上。其中，nedd8從ubc12傳遞到cullins的過(guò)程涉及兩個(gè)e3：①rbx1，一種ringe3，其ring結(jié)構(gòu)域與ubc12和cullin1相互作用將ubc12的催化活性位點(diǎn)cys111和cul1上nedd8結(jié)合位點(diǎn)lys720拉近，使nedd8從ubc12直接傳遞到cul1上；②dcn1(defectiveincullinneddylation1，也叫做sccro、dcun1di)，一種co-e3，是neddylationscaffold-typee3連接酶的組分之一，可以直接與nedd8、rbx1和cullin1結(jié)合(heiretal.,2013；huangetal.,2011；kimetal.,2008；kurzetal.,2008)。在細(xì)胞核內(nèi)，dcn1加強(qiáng)cullin1對(duì)ubc12的招募,促進(jìn)neddylation，也可催化nedd8連接到cullin2的k689。dcn1晶體結(jié)構(gòu)主要包括uba結(jié)構(gòu)域和pony(potentiatingneddylation)結(jié)構(gòu)域兩部分。dcn1pony(dcn1^p)結(jié)構(gòu)域中兩個(gè)ef-hand-like折疊連接處形成一個(gè)保守的疏水口袋，與n末端乙酰化的ubc12相互作用加強(qiáng)neddylation過(guò)程(mondaetal.,2013；scottetal.,2011；scottetal.,2010)。dcn1已被報(bào)道是一種致癌基因，dcn1的mrna和蛋白水平在多種腫瘤，如肺癌、頭頸癌等及癌癥病人組織中均高表達(dá)，dcn1過(guò)表達(dá)也可促進(jìn)癌細(xì)胞的增值和轉(zhuǎn)移，dcn1knockdown可以引起癌細(xì)胞的周期阻滯和凋亡(sarkariaetal.,2006)。綜上所述，通過(guò)建立ubc12/dcn1抑制劑篩選平臺(tái)，篩選出能抑制neddylation通路的化合物對(duì)癌癥及免疫性疾病的治療有重要意義，因此，ubc12/dcn1可以作為一個(gè)治療靶點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于利用htrf技術(shù)建立ubc12/dcn1抑制劑篩選平臺(tái)，篩選出能抑制neddylation通路的先導(dǎo)化合物。

htrf(均相時(shí)間分辨熒光，homogeneoustime-resolvedfluorescence)結(jié)合了熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret,fluorescenceresonanceenergytransfer)和時(shí)間分辨熒光(trf，time-resolvedfluorescence)兩種技術(shù)，將fret的均相實(shí)驗(yàn)方式和trf的低背景特點(diǎn)融合在一起。因此，htrf技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、通量大、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠的特點(diǎn)。htrf是以銪穴狀化合物(eu³⁺cryptate)或lumi4^tm鋱穴狀化合物(tb²⁺cryptate)為能量供體(donor)，能耐受一些特殊的實(shí)驗(yàn)條件，如二價(jià)陽(yáng)離子(mg²⁺和mn²⁺等)、螯合物(edta)、極性較強(qiáng)的溶劑或者較高的溫度，可耐受較寬的ph范圍；以xl665或d2為能量受體(acceptor)，xl665和d2激發(fā)波長(zhǎng)為620nm，發(fā)射波長(zhǎng)為665nm，位于近紅外光區(qū)，進(jìn)一步降低了樣品本身對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。xl665是改良過(guò)的別藻藍(lán)蛋白(apc),將apc的亞基偶聯(lián)，使其不能解離，增加其穩(wěn)定性；d2光譜學(xué)特征與xl665相同，但其分子量較小，可減少空間位阻對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。

htrf技術(shù)的原理：兩種能相互作用的生物分子使熒光基團(tuán)donor和acceptor靠近，穴狀化合物donor捕獲激發(fā)光獲得的能量部分釋放，發(fā)射波長(zhǎng)為620nm，另一部分能量共振轉(zhuǎn)移到acceptorxl665或d2，使其發(fā)射能量，發(fā)射波長(zhǎng)為665nm。發(fā)射波長(zhǎng)665nm的信號(hào)值與620nm時(shí)信號(hào)值的比值能反映出兩種生物分子相互作用的強(qiáng)度。

為達(dá)到本發(fā)明目的，本發(fā)明先成功構(gòu)建并原核表達(dá)純化得到純度較高的gst-dcn1重組蛋白，合成ubc12n末端乙?；揎椀?-12個(gè)氨基酸序列作為底物。首先用分子間相互作用確定ubc12和dcn1是有活性的并且能相互作用；然后再利用htrf技術(shù)建立ubc12/dcn1活性測(cè)定平臺(tái)，并優(yōu)化其反應(yīng)條件。具體步驟如下：

一、gst-dcn1重組蛋白的表達(dá)純化

1、gst-dcn1表達(dá)載體的構(gòu)建：選擇合適的表達(dá)載體及目的基因活性片段。選擇的表達(dá)載體要能表達(dá)出可溶性的目的蛋白，要有明確的抗性及標(biāo)簽，方便目的蛋白的表達(dá)和純化。選擇的目的基因序列要包括其活性中心，確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)的可行性；

為此，本發(fā)明篩選出的表達(dá)載體為pgex-4t-1；目的基因序列活性片段為gst-dcn1，將其克隆到表達(dá)載體上。

2、gst-dcn1重組蛋白的表達(dá)：將構(gòu)建成功的目的載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入合適的表達(dá)菌株，將菌液均勻涂布到混有抗生素的固體培養(yǎng)基上，挑單克隆篩選出含有目的質(zhì)粒的菌株進(jìn)行培養(yǎng)。表達(dá)蛋白時(shí)先將目的菌株接種到液體培養(yǎng)基中37℃進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，待菌處于生長(zhǎng)期(od0.6-0.9)時(shí)加入iptg(異丙基-β-d-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)；

所述表達(dá)菌株選bl21(de3)，所述抗生素選氨芐青霉素，終濃度100μg/ml；

3、gst-dcn1重組蛋白的純化：離心收集上述菌液中的菌體，然后超聲破碎釋放目的蛋白，高速離心棄去菌體碎片，得到目的蛋白溶液。根據(jù)構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)選擇的載體特征選擇合適的純化柱、純化條件、緩沖液等純化收集蛋白樣品；

4、表達(dá)純化結(jié)果：取上述蛋白純化時(shí)收集的蛋白樣品，加入蛋白loadingbuffer變性，然后sds-page膠電泳，用考馬斯亮藍(lán)染液染膠，看到在目的蛋白大小處有蛋白條帶。可進(jìn)一步用相應(yīng)抗體或質(zhì)譜等技術(shù)檢測(cè)確認(rèn)。

二、htrf技術(shù)篩選ubc12/dcn1小分子抑制劑平臺(tái)的建立

根據(jù)htrf技術(shù)產(chǎn)品的特征選擇合適的檢測(cè)試劑，緩沖溶液中，檢測(cè)ubc12和dcn1的相互作用；

本發(fā)明優(yōu)選：anti-gst-cryptate(eu³⁺cryptateconjugatedmousemonoclonalantibodyanti-glutathiones-transferase)作為能量供體，streptavidin-d2(d2-conjugatedstreptavidin)作為能量受體，緩沖溶液中，固定dcn1濃度，將biotin-ubc12配制成一系列濃度梯度，室溫反應(yīng)，確定biotin-ubc12最適濃度為2.84μm；同理，固定biotin-ubc12濃度，將dcn1配制成一系列濃度梯度，確定dcn1最適濃度為20nm。在此條件下，gst-dcn1、biotin-ubc12有較好的相互作用。通過(guò)發(fā)射波長(zhǎng)665nm時(shí)的信號(hào)值與620nm時(shí)信號(hào)值的比值判斷兩種生物分子相互作用的強(qiáng)度，從而篩選ubc12/dcn1小分子抑制劑。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

1、操作簡(jiǎn)單：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不需洗板，孵育后直接檢測(cè)；

2、反應(yīng)體系穩(wěn)定：穴狀化合物非常穩(wěn)定，可耐受較寬的ph范圍(5.5-8.5)及二價(jià)金屬離子、螯合物等；

3、數(shù)據(jù)真實(shí)可靠：背景低，受到樣品的干擾非常少，假陽(yáng)性假陰性均低，可去除天然產(chǎn)物自發(fā)熒光的干擾，靈敏度高；

4、易于實(shí)現(xiàn)微型化，通量高。

附圖說(shuō)明

圖1為pgex-4t1-dcn1純化結(jié)果。

圖2為利用htrf技術(shù)檢測(cè)ubc12和dcn1相互作用的原理圖。

圖3為利用htrf技術(shù)原理優(yōu)化ubc12和dcn1濃度，圖中a為ubc12濃度，b為dcn1濃度，最終確定ubc12終濃度為2.84μm、dcn1濃度為20nm。

具體實(shí)施方式

為對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更好地說(shuō)明，舉實(shí)施例如下：除不另加說(shuō)明以外，以下所述百分含量均為質(zhì)量百分含量。

實(shí)施例1

一、gst-dcn1重組蛋白的表達(dá)純化

試劑和方法：

氨芐青霉素的制備：稱(chēng)量1g氨芐青霉素用超純水溶解并定容至10ml，在超凈臺(tái)里用滅菌的0.22um的濾頭過(guò)濾，-20℃保存；

100mmiptg(異丙基-β-d-硫代半乳糖苷)的配制：稱(chēng)量2.383giptg用超純水溶解并定容至100ml，在超凈臺(tái)里用滅菌的0.22um的濾頭過(guò)濾，-20℃保存；

感受態(tài)細(xì)胞的制備：將表達(dá)菌株bl21(de3)按1‰接入滅菌的液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取1ml菌液至1.5ml滅菌的ep管里，3000rpm離心5min收集菌體，每管中加入100ul0.1m滅菌預(yù)冷的cacl2溶液，吹打均勻，然后每管中再加入25ul50％滅菌的甘油，混勻，-80℃保存，備用。

液體培養(yǎng)基的制備：分別稱(chēng)量6g蛋白胨、6g氯化鈉、3g酵母提取物至1l錐形瓶里，加入超純水600ml，121℃高壓滅菌20min；

固體培養(yǎng)基的制備：分別稱(chēng)量2g蛋白胨、2g氯化鈉、1g酵母提取物、3g瓊脂粉至500ml錐形瓶里，加入超純水200ml，121℃高壓滅菌20min。滅菌結(jié)束后將固體培養(yǎng)基室溫放置至涼而未凝時(shí)加入200μl氨芐青霉素(0.5mg/ml)，搖勻，倒入無(wú)菌的培養(yǎng)皿里，凝固后4℃保存，備用；

bindingbuffer的組分：140mm氯化鈉、2.7mm氯化鉀、10mm磷酸氫二鈉、1.8mm磷酸二氫鉀，ph7.3；

elutionbuffer的組分：50mmtris-hcl(ph8.0)，10mm還原性谷胱甘肽。

1、pgex-4t1-dcn1表達(dá)載體的構(gòu)建：將dcn1堿基序列的全長(zhǎng)克隆到表達(dá)載體pgex-4t-1上，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證連接正確；

2、pgex-4t1-dcn1重組蛋白的表達(dá)：將構(gòu)建成功的重組載體pgex-4t1-dcn1轉(zhuǎn)化進(jìn)入表達(dá)菌株bl21(de3)，將菌液均勻涂布到混有氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上，37℃孵育過(guò)夜，挑單克隆至液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

按1‰的比例將上述bl21(de3)-pgex-4t1-dcn1接種到液體培養(yǎng)基中37℃擴(kuò)大培養(yǎng)，待菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(od0.6-0.9)時(shí)加入0.5mmiptg(異丙基-β-d-硫代半乳糖苷)20℃過(guò)夜誘導(dǎo)dcn1表達(dá)；

3、pgex-4t1-dcn1重組蛋白的純化：a.收集菌體：8000rpm5min離心收集上述菌液中的菌體，用bindingbuffer重懸菌體，8000rpm5min離心棄上清；b.超聲破碎:再加入bindingbuffer重懸菌體，超聲破碎(冰浴；超聲3s，間隔15s)，高速離心棄去菌體碎片，得到含有目的蛋白的上清液，0.22um濾膜抽濾；c.平衡柱子:連接蛋白純化裝置，先用超純水排凈系統(tǒng)中的氣泡，然后連接上蛋白純化柱，先用超純水沖洗柱子至紫外檢測(cè)值基本平穩(wěn)，再換成bindingbuffer平衡柱子至紫外檢測(cè)值平穩(wěn)，將吸光度歸零；d.上樣:將蛋白樣品流經(jīng)蛋白純化柱，目的蛋白及少量的雜蛋白與柱子結(jié)合，其他雜蛋白直接流穿；e.洗雜蛋白:用bindingbuffer沖洗柱子至紫外檢測(cè)值平穩(wěn)，將柱子上結(jié)合的雜蛋白洗脫；f.洗脫目的蛋白:用elutionbuffer洗脫柱子上結(jié)合的目的蛋白；g.依次用bindingbuffer、超純水沖洗柱子分別至紫外檢測(cè)值平穩(wěn)；h.用20％乙醇保存柱子。

表達(dá)純化結(jié)果：從蛋白純化過(guò)程中收集的蛋白樣品中分別取出50ul，加入10μl蛋白6×loadingbuffer100℃變性10min，然后sds-page膠電泳，用考馬斯亮藍(lán)染液染膠，觀(guān)察到在55kda處有蛋白條帶，是目的蛋白pgex-4t1-dcn1。

二、htrf技術(shù)篩選ubc12/dcn1小分子抑制劑平臺(tái)的建立

試劑和方法：

htrf緩沖液的配制：50mmhepes、50mm氯化鈉、400mm氟化鉀、0.1％

bsa(牛血清白蛋白)、0.1％tween20，ph6.0.

1、根據(jù)cisbio公司htrf技術(shù)產(chǎn)品特征選擇anti-gst-cryptate(eu³⁺cryptateconjugatedmousemonoclonalantibodyanti-glutathiones-transferase)作為能量供體，streptavidin-d2(d2-conjugatedstreptavidin)作為能量受體，分別與gst-dcn1、biotin-ubc12結(jié)合檢測(cè)dcn1和ubc12的相互作用。

2、緩沖溶液中，固定dcn1濃度，將biotin-ubc12配制成一系列濃度梯度，室溫反應(yīng)3h，確定biotin-ubc12最適濃度為2.84μm；同理，固定biotin-ubc12濃度，確定dcn1最適濃度為20nm。

3、確定最終反應(yīng)體系為20μl，用384孔板檢測(cè)。反應(yīng)體系為：

因此，通過(guò)發(fā)射波長(zhǎng)665nm時(shí)的信號(hào)值與620nm時(shí)信號(hào)值的比值判斷兩種生物分子相互作用的強(qiáng)度，從而篩選ubc12/dcn1小分子抑制劑。