本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測病理性近視的篩查試劑盒。

背景技術(shù)：

病理性近視又稱高度近視、變性近視或惡性近視，它是指屈光度在-6.00d以上，并且呈進行性加深、眼軸不斷增長、眼內(nèi)容和視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜組織進行性損害引起視功能障礙為特征的一種眼病。層粘連蛋白是一種大分子非膠原糖蛋白，廣泛存在于各組織的基底膜，主要由內(nèi)皮細胞、上皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞及貯脂細胞產(chǎn)生。層粘連蛋白是胚胎發(fā)生時期產(chǎn)生最早的蛋白分子之一，主要由上皮細胞，內(nèi)皮細胞等多種細胞合成和分泌，是一種重要的細胞外基質(zhì)，在基質(zhì)各成分之間及細胞之間起到連接作用，廣泛存在于全身各組織中，在眼鞏膜起到將鞏膜層內(nèi)及各層間膠原纖維和微纖維連結(jié)起來的作用，對維持鞏膜的組織結(jié)構(gòu)和功能起到重要作用。

研究者在動物和人的關(guān)于病理性近視和層粘連蛋白的相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，病理性近視的形成與層粘連蛋白在眼球鞏膜中的含量降低有關(guān)，lama1基因是病理性近視家系的致病基因之一。實驗性近視動物模型研究表明，高度近視動物眼鞏膜中層粘連蛋白減少，edwards等證實lama1基因缺失的小鼠，眼球鞏膜中層粘連蛋白減少，表現(xiàn)為眼軸的增長，視力喪失，以及視網(wǎng)膜、玻璃體血管持續(xù)性迂曲，從而證實層粘連蛋白在維持正常眼球生理功能中具有重要作用。由此可見，病理性近視的形成與層粘連蛋白的相關(guān)性表現(xiàn)在:lama1基因發(fā)生突變或表達異常導(dǎo)致層粘連蛋白的合成、分布、結(jié)構(gòu)和功能異常，導(dǎo)致眼球鞏膜生物力學(xué)的改變，最終導(dǎo)致眼軸變長及其相關(guān)的并發(fā)癥。

因此，可以開發(fā)一種依據(jù)層粘連蛋白含量而診斷病理性近視的試劑盒。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，本發(fā)明提供一種檢測病理性近視的篩查試劑盒，以解決上述的技術(shù)問題。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種檢測病理性近視的篩查試劑盒，包括抗體芯片，細胞粘附因子標(biāo)準(zhǔn)品，生物素標(biāo)記的細胞粘附因子檢測抗體混合物；和熒光素cy5標(biāo)記的鏈霉親和素；所述抗體芯片以含有失水山梨醇酯的親水試劑處理的硝酸纖維素膜作為固相載體，且細胞粘附因子的特異性抗體在4～20℃、30～35％的濕度條件下點樣到固相載體上。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖。

其中：硝酸纖維素膜-10，特異性抗體點樣孔-11。

具體實施方式

結(jié)合以下實施例對本發(fā)明作進一步描述。

一種檢測病理性近視的篩查試劑盒，如圖1所示，包括抗體芯片，細胞粘附因子標(biāo)準(zhǔn)品，生物素標(biāo)記的細胞粘附因子檢測抗體混合物；和熒光素cy5標(biāo)記的鏈霉親和素；所述抗體芯片以含有失水山梨醇酯的親水試劑處理的硝酸纖維素膜作為固相載體，且細胞粘附因子的特異性抗體在4～20℃、30～35％的濕度條件下點樣到固相載體上。

優(yōu)選地，所述細胞粘附因子檢測抗體混合物為層粘連蛋白受體(ln)的特異性抗體。

優(yōu)選地，所述親水試劑為質(zhì)量分數(shù)為0.03～0.8％的失水山梨醇酯、0.05～0.8％的甘油和0.01～0.1％的聚乙二醇2000的去離子水溶液。

優(yōu)選地，所述親水試劑處理硝酸纖維素膜的方法為：首先用去離子水清洗3次商品膜，每次3～5min；晾干后，將膜片浸泡在25℃的親水試劑10-30min，4℃真空干燥備用。

優(yōu)選地，所述親水試劑為質(zhì)量分數(shù)為0.05～0.5％的失水山梨醇酯、0.1～0.5％的甘油和0.01～0.5％的聚乙二醇2000的去離子水溶液。

優(yōu)選地，所述細胞粘附分子在4～15℃，30～35％的濕度條件下點樣到固相載體上。

優(yōu)選地，所述點樣的細胞粘附分子濃度為5～30ng/ml；

優(yōu)選地，所述親水試劑為質(zhì)量分數(shù)為0.1％的失水山梨醇酯、0.2％的甘油和0.05％的聚乙二醇2000的去離子水溶液；所述細胞粘附分子在4℃，30％的濕度條件下點樣到固相載體上。

本發(fā)明通過含有失水山梨醇酯的親水試劑處理的硝酸纖維素膜背景低，檢測靈敏度高，并且所檢測的細胞粘附因子靈敏度可達單因子的elisa檢測靈敏度。本發(fā)明的抗體芯片試劑盒克服了現(xiàn)有技術(shù)操作繁瑣、檢測指標(biāo)單一、靈敏度低等缺陷，具有廉價、便利、靈敏、準(zhǔn)確、高通量、標(biāo)本用量少、能在普通實驗室推廣和規(guī)?；葍?yōu)點。

實驗例芯片操作流程

1.1、每個孔中加100μl的樣品稀釋液，室溫搖床上孵育30分鐘，封閉定量抗體芯片。

1.2、抽去每個孔中的緩沖液，添加100μl的標(biāo)準(zhǔn)液和樣品到孔中，在搖床上4℃過夜孵育。

注：不同樣品的孵育量不一樣：血漿、血清使用前用樣品稀釋液1：1稀釋；細胞上清液可用原液；細胞或組織裂解液經(jīng)蛋白濃度測定后加入5-50ug的量。

1.3、清洗：抽去每個孔中的標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，1×洗液i清洗5次，每次5min室溫搖床震蕩，每孔150μl的1×洗液i，每次清洗要抽干凈洗液，用去離子水稀釋20×洗液i。抽去每個孔中的1×洗液i，加入1×洗液ii清洗2次，每次5min室溫搖床震蕩，每孔150μl的1×洗液ii，每次清洗要抽干凈洗液，用去離子水稀釋20×洗液ii。

1.4檢測抗體混合物的孵育：離心檢測抗體混合物小管，然后加入1.4ml的樣品稀釋液，混合均勻后再次快速離心。添加80μl的檢測抗體到每個孔中，室溫搖床上孵育2小時。

1.5清洗：抽去每個孔中的檢測抗體，1×洗液i清洗5次，每次5min室溫搖床震蕩，每孔150μl的1×洗液i，每次清洗要抽干凈洗液，然后加入1×洗液ii清洗2次，每次5min室溫搖床震蕩，每孔150μl的1×洗液ii，每次清洗要抽干凈洗液。

1.6cy5-鏈霉親和素的孵育：離心cy5-鏈霉親和素小管，然后加入1.4ml的樣品稀釋液，混合均勻后再次快速離心。添加80μl的cy5-鏈霉親和素到每個孔中，用鋁箔紙包住玻片避光孵育，室溫搖床上孵育1個小時。

1.7清洗：抽去每個孔中的cy5-鏈霉親和素，1×洗液i清洗5次，每次5min室溫搖床震蕩，每孔150μl的1×洗液i，每次清洗要抽干凈洗液。

1.8熒光檢測

1)將玻片框架拆掉，小心不要用手接觸到玻片印制抗體的一面。

2)將玻片放置在玻片清洗管中，添加約30ml的1×洗液i，能整個覆蓋住玻片，在室溫搖床上震蕩15min，棄去1×洗液i，添加約30ml的1×洗液ii，在室溫搖床上震蕩5min。

3)去除玻片的殘留洗液。將玻片放置在玻片清洗管/干燥管中，不蓋蓋子，在1000rpm離心3min。

4)采用激光掃描儀例如axongenepix掃描信號，采用綠色通道(激發(fā)頻率＝650nm)。

1.9芯片的數(shù)據(jù)提取以及用分析軟件來進行數(shù)據(jù)分析

1)用genepix軟件來讀取生物芯片的熒光值。

2)讀數(shù)后選用的數(shù)值為扣除點周圍背景的中間值讀數(shù)(f532median-localbackground)。

最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細地說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。