本發(fā)明涉及一種體外檢測(cè)脂肪性肝炎的新標(biāo)志物及檢測(cè)方法，屬于生物技術(shù)和體外診斷的細(xì)分領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

脂肪肝是指由于各種原因引起的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪異常堆積過(guò)多的病變。正常人肝組織中含有少量的脂肪，其重量約為肝重量的4％～5％，若脂肪量超過(guò)5％為輕度脂肪肝，超過(guò)10％為中度脂肪肝，超過(guò)25％為重度脂肪肝。脂肪肝是目前最常見(jiàn)的慢性肝臟疾病之一，在發(fā)達(dá)國(guó)家和部分發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率達(dá)到30％以上，已成為一個(gè)重要的公共健康問(wèn)題，嚴(yán)重威脅人民健康。脂肪肝包括單純性脂肪變、脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化等主要病理階段；脂肪肝中的單純性脂肪變是良性的，通過(guò)飲食、運(yùn)動(dòng)調(diào)控等可以逆轉(zhuǎn)，不需要經(jīng)過(guò)特異性治療；而脂肪性肝炎如不及時(shí)治療，將隨著疾病的進(jìn)展將進(jìn)一步向肝纖、肝硬化、肝癌發(fā)展，報(bào)道顯示脂肪性肝炎轉(zhuǎn)化為肝纖肝硬化，直至肝癌的發(fā)病率與病毒性肝炎的發(fā)病率相當(dāng)。脂肪性肝炎嚴(yán)重威脅人民的健康，目前，脂肪肝主要通過(guò)b超、ct、mri等影像學(xué)手段檢測(cè)，但是影像學(xué)檢測(cè)無(wú)法區(qū)分單純性脂肪變和脂肪性肝炎，脂肪性肝炎的確診仍依賴于肝穿刺檢測(cè)，肝穿刺檢測(cè)會(huì)給患者帶來(lái)較大的身體和心里負(fù)擔(dān)，不利于脂肪性肝炎的診斷確診和日常檢測(cè)。

高爾基體蛋白73(如無(wú)特殊說(shuō)明，以下均簡(jiǎn)稱gp73)是高爾基體糖蛋白，2000年首先由kladney等在研究成人巨細(xì)胞肝炎病原學(xué)時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種新的跨膜糖蛋白，又稱ii型高爾基體膜蛋白(golph2)和高爾基體膜蛋白i(golm1)，相對(duì)分子量為73000kda。gp73在正常的肝細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)或少量表達(dá)，近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，gp73在肝纖、肝硬化及肝癌等多種肝臟疾病中呈高表達(dá)狀態(tài)，并可分泌進(jìn)入血清，肝癌患者中的gp73升高最為明顯，是肝癌早期診斷的優(yōu)選標(biāo)志物之一，其敏感性和特異性均優(yōu)于afp。

中國(guó)專利公布cn101735319a(北京熱景生物技術(shù)股份有限公司,專利名稱“一種抗gp73蛋白的單克隆抗體、其制備方法和應(yīng)用”)，公開(kāi)了一種抗高爾基蛋白gp73的單克隆抗體，一種應(yīng)用gp73的酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)試劑盒和一種快速診斷試劑盒，并公開(kāi)了正常人與肝病患者的gp73含量的臨界值為40ng/ml，良性肝病患者與惡性肝病患者的gp73含量的臨界值為100ng/ml。

中國(guó)專利公布cn101407544a(專利名稱：“抗高爾基體蛋白單克隆抗體及應(yīng)用”)公開(kāi)了一種抗gp73單克隆抗體及應(yīng)用該單克隆體的肝癌檢測(cè)的酶免試劑和免疫沉淀、免疫印跡、免疫組化等方面的應(yīng)用。

中國(guó)專利公布cn104215761a(專利名稱：“檢測(cè)血清中抗gp73抗體的試劑盒”)公開(kāi)了一種檢測(cè)血清中抗gp73抗體檢測(cè)的酶聯(lián)免疫試劑盒，主要用于肝癌檢測(cè)。

近年來(lái)，gp73及其相關(guān)應(yīng)用研究主要集中在肝癌早期診斷領(lǐng)域，gp73相關(guān)專利申請(qǐng)也主要集中在應(yīng)用gp73及其抗體進(jìn)行肝癌檢測(cè)的體外診斷試劑盒領(lǐng)域，未見(jiàn)gp73用于脂肪肝人群中診斷鑒別單純性脂肪變和脂肪性肝炎的研究及應(yīng)用的報(bào)道及相關(guān)專利申請(qǐng)。我們經(jīng)過(guò)大量臨床樣本研究分析，充分證明gp73是在脂肪肝人群中診斷鑒別單純性脂肪變和脂肪性肝炎的優(yōu)秀血清學(xué)標(biāo)志物，對(duì)于脂肪性肝炎人群的診斷和鑒別都有著重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

目前臨床上應(yīng)用肝穿刺來(lái)診斷鑒別脂肪肝人群中的單純性脂肪變和脂肪性肝炎，給患者帶來(lái)巨大痛苦，為了解決現(xiàn)有影像學(xué)檢測(cè)技術(shù)和血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)無(wú)法在脂肪肝人群中診斷鑒別單純性脂肪變和脂肪性肝炎的不足，本發(fā)明提供了一種在脂肪肝人群中診斷鑒別單純性脂肪變和脂肪性肝炎的新血清學(xué)靶標(biāo)志物gp73，并進(jìn)一步提供了在脂肪肝人群中診斷鑒別單純性脂肪變和脂肪性肝炎的檢測(cè)gp73的檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)方法及其判定標(biāo)準(zhǔn)。

本發(fā)明提供了一種用于在脂肪肝人群中診斷鑒別單純性脂肪變和脂肪性肝炎的新血清學(xué)靶標(biāo)志物gp73及其體外診斷的檢測(cè)樣本中g(shù)p73含量的方法。

本發(fā)明更進(jìn)一步提供了在脂肪肝人群中診斷鑒別單純性脂肪變和脂肪性肝炎的血清學(xué)體外診斷檢測(cè)試劑盒，及其應(yīng)用體外診斷檢測(cè)試劑盒檢測(cè)gp73的方法及其判定標(biāo)準(zhǔn)。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，gp73檢測(cè)方法原理為基于抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的免疫學(xué)檢測(cè)方法原理，優(yōu)選化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法、免疫層析法的任意一種。

在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述化學(xué)發(fā)光法為化學(xué)發(fā)光法、磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法、電化學(xué)發(fā)光法、酶促化學(xué)發(fā)光法、時(shí)間分辨化學(xué)發(fā)光法的至少一種。

在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述酶聯(lián)免疫法為酶聯(lián)免疫法、免疫滲濾法、蛋白芯片法的至少一種。

在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述免疫層析法為上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析法、乳膠免疫層析法、膠體金免疫層析法、發(fā)光免疫層析法、量子點(diǎn)免疫層析法的至少一種。

在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，gp73的檢測(cè)樣本為脂肪肝人群的血液樣本，所述血液樣本檢測(cè)結(jié)果用于在脂肪肝人群中診斷鑒別單純性脂肪變和脂肪性肝炎。

在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，gp73血清學(xué)體外診斷檢測(cè)試劑盒在脂肪肝人群中診斷鑒別單純性脂肪變和脂肪性肝炎的判定cutoff值為82.25ng/ml。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明在于提供一種在脂肪肝人群中診斷鑒別單純性脂肪變和脂肪性肝炎的新血清學(xué)靶標(biāo)志物gp73，并進(jìn)一步提供了在脂肪肝人群中診斷鑒別單純性脂肪變和脂肪性肝炎的檢測(cè)gp73的方法及其判定標(biāo)準(zhǔn)，解決了現(xiàn)有的影像學(xué)檢測(cè)技術(shù)和血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)無(wú)法在脂肪肝人群中診斷鑒別單純性脂肪變和脂肪性肝炎的問(wèn)題，為脂肪性肝炎的診斷和治療提供依據(jù)，檢測(cè)樣本為血液樣本，大幅度降低了肝穿刺檢測(cè)脂肪性肝炎為患者帶來(lái)的痛苦，對(duì)脂肪肝人群中鑒別單純性脂肪變和脂肪性肝炎具有重要的臨床診斷價(jià)值和臨床意義。

附圖說(shuō)明

圖1，200例gp73磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑、gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果絕對(duì)偏倚圖。

圖2，200例gp73磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑、gp73免疫層析法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果絕對(duì)偏倚圖。

圖3，200例gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑檢測(cè)、gp73免疫層析法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果絕對(duì)偏倚圖

圖4，200例gp73磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑、gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果相對(duì)偏倚圖。

圖5，200例gp73磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑、gp73免疫層析法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果相對(duì)偏倚圖。

圖6，200例gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑、gp73免疫層析法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果相對(duì)偏倚圖。

圖7，所述200例gp73磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑、gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果線性相關(guān)性。

圖8，所述200例gp73磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑、gp73免疫層析法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果線性相關(guān)性。

圖9，所述200例gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑、gp73免疫層析法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果線性相關(guān)性。

圖10，roc曲線分析圖。

圖11，gp73檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)分布圖。

圖12，臨床一致性分析圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和實(shí)施案例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所述的優(yōu)選實(shí)施案例僅用于解釋本發(fā)明，并不限定發(fā)明范圍。

應(yīng)理解本發(fā)明中所述的術(shù)語(yǔ)僅僅是為描述特別的實(shí)施方式，并非用于限制本發(fā)明。對(duì)于本發(fā)明中的數(shù)值范圍，應(yīng)理解為還具體公開(kāi)了該范圍的上限和下限之間的每個(gè)中間值。在任何陳述值或陳述范圍內(nèi)的中間值以及任何其他陳述值或在所述范圍內(nèi)的中間值之間的每個(gè)較小的范圍也包括在本發(fā)明內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可獨(dú)立地包括或排除在范圍內(nèi)。

除非另有說(shuō)明，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所述領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)人員通常理解的相同含義。雖然本發(fā)明僅描述了優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)方法、測(cè)定或測(cè)試方法，但是在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)、測(cè)定或測(cè)試中也可以使用與本文所述相似或等同的任何方法。本說(shuō)明書(shū)中提到的所有文獻(xiàn)通過(guò)引用并入，用以公開(kāi)和描述與所述文獻(xiàn)相關(guān)的方法或?qū)嶒?yàn)。在與任何并入的文獻(xiàn)沖突時(shí)，以本說(shuō)明書(shū)的內(nèi)容為準(zhǔn)。

本發(fā)明中，名詞術(shù)語(yǔ)既包括單數(shù)形式，也包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文另行明確指出。本發(fā)明中所述的“至少之一”或“至少一種”不僅僅指包含“一個(gè)”或“一種”的情況，更重要的還包含“多個(gè)”或“多種”的情況。

gp73靶標(biāo)志物及其gp73檢測(cè)方法、判定標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)應(yīng)用抗gp73蛋白抗體，制備成基于抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的免疫學(xué)檢測(cè)方法原理的檢測(cè)試劑，包括化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法、免疫層析法及其基于所述方法的改進(jìn)方法的任意一種方法的定量檢測(cè)試劑，應(yīng)用所述定量試劑檢測(cè)的樣本為脂肪肝人群的血液樣本，可以為血清、血漿、全血的任意一種，所述血液樣本檢測(cè)結(jié)果用于在脂肪肝人群中診斷鑒別單純性脂肪變和脂肪性肝炎。

本發(fā)明中測(cè)量gp73的方法包括使用試劑，所述試劑包括但不限于抗體。所述抗體具體涵蓋單克隆抗體(包括全長(zhǎng)單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體片段，例如抗體中呈現(xiàn)期望生物學(xué)活性的可變結(jié)構(gòu)域及其它部分。術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體(mab)”是指具有高度特異性且針對(duì)單一抗原決定簇(表位)的抗體。因此，術(shù)語(yǔ)“單克隆”指針對(duì)相同表位的抗體，且不應(yīng)理解為需要借助任何特定方法來(lái)產(chǎn)生該抗體。應(yīng)理解，單克隆抗體可借助業(yè)內(nèi)已知的任何技術(shù)或方法來(lái)制備；包括(例如)融合瘤方法(kohler等人，1975,nature256:495)，或業(yè)內(nèi)已知的重組dna方法(例如，參見(jiàn)美國(guó)專利第4,816,567號(hào))，或使用噬菌體抗體文庫(kù)并使用以下文獻(xiàn)中所述技術(shù)分離以重組方式產(chǎn)生的單克隆抗體的方法：clackson等人，1991,nature352:624-628；及marks等人，1991,j.mol.biol.222:581-597。

本發(fā)明中，“抗體片段”指與完整抗體不同的分子，其包含完整抗體的一部分且結(jié)合完整抗體結(jié)合的抗原?？贵w片段的例子包括但不限于fv、fab、fab’、fab’-sh、f(ab’)2；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scfv)；和由抗體片段形成的多特異性抗體。

本發(fā)明所述的試劑還包括其它試劑。所述其它試劑的實(shí)例包括abc稀釋液、tmb顯色液、tmb終止液、洗滌液等。在某些實(shí)施方案中，任何上述物質(zhì)之一可以與其他物質(zhì)分離的狀態(tài)單獨(dú)存在分別存放于不同的容器(例如，小瓶)中，只要在使用時(shí)它們能夠相互接觸即可。另外，優(yōu)選地，任何兩種以上的上述物質(zhì)可混合作為混合物存在。

在某些實(shí)施方案中，所述其它試劑可分別以干燥粉末的形式提供，或以溶液形式提供，例如水溶液的狀態(tài)存在。在以水溶液狀態(tài)存在的情況下，這些物質(zhì)的濃度或含量是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)不同需求而方便地確定的。例如，用于儲(chǔ)存的目的時(shí)，所述物質(zhì)的濃度可以較高的形式存在，當(dāng)處于工作狀態(tài)或使用時(shí)，可通過(guò)例如稀釋上述較高濃度的溶液來(lái)將濃度降低至工作濃度。

本發(fā)明中，測(cè)量gp73的試劑可被進(jìn)一步制備為用于在患有脂肪肝的受試者中鑒別單純性脂肪變和脂肪性肝炎的診斷劑。所述診斷劑的形式或?yàn)樵\斷組合物、診斷試劑盒，或者多種單獨(dú)存在的試劑組合使用的其他任何形式。

實(shí)施案例1：

抗gp73蛋白抗體制備：參考已有專利技術(shù)進(jìn)行制備、或篩選自商品化的抗gp73蛋白抗體、或通過(guò)已有公知技術(shù)制備的抗gp73蛋白抗體，制備或篩選的單克隆抗體可用于脂肪肝人群血液樣本中的gp73的精確定量檢測(cè)及結(jié)果判定。

為更優(yōu)的解釋本發(fā)明，本發(fā)明某些實(shí)施方案中所述的抗gp73蛋白抗體優(yōu)選使用北京熱景生物技術(shù)股份有限公司的專利技術(shù)“一種抗gp73蛋白的單克隆抗體、其制備方法和應(yīng)用，cn101735319b”中的抗gp73蛋白抗體制備方法制備的抗gp73蛋白抗體，所述制備抗gp73蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株(3e12株)于2008年11月11日以保藏號(hào)cgmccno.2742保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心(cgmcc)。

制備單克隆抗體：成年balb/c小鼠腹腔接種降植烷或液體石蠟，每只小鼠0.3-0.5ml，7-10天后，腹腔接種用pbs或無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的3e12株雜交瘤細(xì)胞株，每只小鼠5×10⁵/0.2ml，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，如腹部明顯膨大，以手觸摸時(shí)，皮膚有緊張感，采集腹水，每只小鼠約采3ml腹水，將腹水2000r/min離心5分鐘，除去細(xì)胞成分和其他的沉淀物，收集上清，經(jīng)重組proteing預(yù)裝層析柱純化后即獲得抗gp73單克隆抗體。

實(shí)施案例2：

化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑制備：所述化學(xué)發(fā)光法為化學(xué)發(fā)光法、磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法、電化學(xué)發(fā)光法、酶促化學(xué)發(fā)光法、時(shí)間分辨化學(xué)發(fā)光法及其改進(jìn)方法的至少一種，不同化學(xué)發(fā)光法之間僅標(biāo)記顆粒和分離方法之間存在差異，反應(yīng)原理相同，經(jīng)抗gp73蛋白抗體濃度優(yōu)化處理后，均能達(dá)到精確定量檢測(cè)鑒別脂肪肝人群中的單純性脂肪變和脂肪性肝炎，達(dá)到輔助診斷和治療脂肪性肝炎的目的。gp73化學(xué)發(fā)光法的制備均來(lái)自成熟的化學(xué)發(fā)光法制備技術(shù)，并對(duì)該技術(shù)進(jìn)行相關(guān)優(yōu)化，使之達(dá)到優(yōu)異的檢測(cè)結(jié)果。

為更優(yōu)的解釋本發(fā)明，本發(fā)明某些實(shí)施方案中所述的化學(xué)發(fā)光法優(yōu)選磁微粒化學(xué)發(fā)光法制備化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑，磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑制備參照北京熱景生物技術(shù)股份有限公司相關(guān)專利技術(shù)公開(kāi)方法進(jìn)行，所述抗體為實(shí)施案例1中所述的抗gp73蛋白抗體。

1、gp73磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑的gp73分離試劑制備：

所述gp73分離試劑制備概括為將磁性粒子與抗gp73蛋白抗體反應(yīng)形成連接物，按一定濃度加入緩沖液中配制而成。主要步驟如下：

將磁珠混勻后加磁場(chǎng)去掉上清，用包被緩沖液清洗磁珠一次，然后加入活化劑(碳二亞胺)，常溫震蕩反應(yīng)30min，然后去上清，加入包被緩沖液及適量抗gp73蛋白抗體，常溫震蕩3h，反應(yīng)結(jié)束后加入封閉液并震蕩，最后加清洗液，清洗完成后加入保存液過(guò)夜保存即可。

所述包被緩沖液為0.1mol/l的ph5.0的mes緩沖液。

所述活化劑碳二亞胺的終濃度為0.01-0.1g/ml。

所述抗gp73蛋白抗體的適宜濃度為10-100ug/mg磁珠。

包被結(jié)束后，加磁場(chǎng)棄上清，加入約10倍體積的封閉液，常溫振蕩至少1小時(shí)。

所述封閉液主要組成成分為：50mm的tris緩沖液，1-5％bsa溶液，0.1％防腐劑，ph7.4。

封閉結(jié)束后，加磁場(chǎng)棄上清，加入約10倍體積的清洗液清洗。

所述清洗液的主要組成成分為0.02mpbs、100nm氯化鈉溶液，0.5-1％的吐溫-20溶液。

清洗結(jié)束后，加磁場(chǎng)棄上清，準(zhǔn)確加入10倍體積的磁性顆粒保存液保存抗dcp單克隆抗體的磁性顆粒，即為gp73分離試劑。

所述保存液的主要組成成分為0.02-0.1mpbs溶液，1％-5％的bsa溶液，0.1％的防腐劑，0.5-3％的甘氨酸溶液，ph7.4。

2、gp73磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑的檢測(cè)試劑制備

所述檢測(cè)試劑制備：概括為堿性磷酸酶標(biāo)記的抗gp73蛋白抗體按照一定濃度加入到緩沖液中配制而成。

為更優(yōu)的解釋本發(fā)明，并于包被抗體對(duì)應(yīng)，堿性磷酸酶標(biāo)記抗體優(yōu)選抗gp73蛋白抗體；該制備方法僅為更好的解釋本發(fā)明，不作為標(biāo)記抗體的制備及使用的限制條件。

取與抗gp73蛋白抗體質(zhì)量比為1/4～1/1的堿性磷酸酶，加入與堿性磷酸酶溶液等體積的naio4(12.8mg/ml，4℃現(xiàn)配)，4℃避光反應(yīng)30分鐘，然后加入與堿性磷酸酶溶液等體積的乙二醇溶液4℃避光反應(yīng)45分鐘；加入抗gp73蛋白抗體，再加入混合液1/40～1/10體積的cbs標(biāo)記緩沖液(0.05mol/l，ph9.6)置4℃避光透析過(guò)夜，最后加入硫酸銨溶液，反應(yīng)2小時(shí)，離心，棄去上清，沉淀用0.01mol/l的pbs溶解后置4℃避光透析過(guò)夜，透析完后加等體積甘油混勻，-20℃保存。

按比例(推薦濃度≥1:1000)將堿性磷酸酶標(biāo)記的抗gp73蛋白抗體加入保存液中，混勻即得gp73標(biāo)記抗體，即為檢測(cè)試劑制備。

3、gp73磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑的清洗液制備：

所述清洗液主要組成為：0.1mtris緩沖液，0.1-1％吐溫溶液、0.1％防腐劑。

4、gp73磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑的定標(biāo)液制備：

所述gp73定標(biāo)液制備概括為將檢驗(yàn)合格的gp73抗原加入定標(biāo)生產(chǎn)稀釋液中配制凍干而成。

所述定標(biāo)生產(chǎn)稀釋液包括1-5％bsa溶液、1-5％的海藻糖溶液、10-50％新生牛血清溶液。將高值gp73抗原凍干液進(jìn)行梯度稀釋稀，釋至適宜濃度，檢測(cè)完后放入凍干機(jī)凍干，預(yù)凍時(shí)間為2h，抽真空時(shí)間為16-24h。

5、gp73磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑制備：

將gp73分離試劑、gp73檢測(cè)試劑、gp73清洗液、gp73底物液按照工藝規(guī)程或說(shuō)明書(shū)要求分裝至相應(yīng)大小的試劑瓶?jī)?nèi)，或條裝試劑的試劑條的相應(yīng)孔位，然后密封。分裝后的試劑與定標(biāo)液、耗材反應(yīng)槽、一次性取樣頭等組成gp73磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑，所述試劑適配北京熱景生物技術(shù)股份有限公司mq60系列自動(dòng)免疫分析儀使用。

實(shí)施案例3：

gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑(96人份)制備：所述酶聯(lián)免疫法為酶聯(lián)免疫法為酶聯(lián)免疫吸附法、斑點(diǎn)免疫滲濾法、磁顆粒酶聯(lián)免疫法分析、酶聯(lián)免疫熒光測(cè)量法和蛋白芯片法的至少一種或酶聯(lián)免疫相應(yīng)改進(jìn)方法的至少一種，不同酶聯(lián)免疫法之間僅承載載體之間存在差異，反應(yīng)原理相同，經(jīng)抗gp73蛋白抗體濃度優(yōu)化處理后，均能達(dá)到精確定量檢測(cè)鑒別脂肪肝人群中的單純性脂肪變和脂肪性肝炎，達(dá)到輔助診斷和治療脂肪性肝炎的目的。gp73酶聯(lián)免疫法的制備均來(lái)自成熟的酶聯(lián)免疫法制備技術(shù)，并對(duì)該技術(shù)進(jìn)行相關(guān)優(yōu)化，使之達(dá)到優(yōu)異的檢測(cè)結(jié)果。

為更優(yōu)的解釋本發(fā)明，本發(fā)明某些實(shí)施方案中所述的酶聯(lián)免疫法優(yōu)選酶聯(lián)免疫吸附法制備的檢測(cè)試劑，酶聯(lián)免疫法制備的檢測(cè)試劑的制備參照北京熱景生物技術(shù)股份有限公司相關(guān)專利技術(shù)公開(kāi)方法進(jìn)行，所述抗體為實(shí)施案例1中所述的抗gp73蛋白抗體。

gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑(96人份)組成包括：gp73標(biāo)準(zhǔn)品5瓶；抗gp73蛋白抗體包被板(96孔)1塊；辣根過(guò)氧化物酶(hrp)標(biāo)記的抗gp73蛋白抗體1瓶，10ml/瓶；顯色液a、顯色液b各1瓶，各5ml/瓶；終止液1瓶，5ml/瓶；洗液(20×濃縮)1瓶，50ml/瓶。

1.gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑的標(biāo)準(zhǔn)品制備：

將高值gp73抗原按0，20ng/ml，40ng/ml，100ng/ml，250ng/ml的不同濃度稀釋于2％的bsa溶液中，加入防腐劑procline300至最終濃度0.1％，過(guò)濾除菌，并在無(wú)菌的條件下分裝入1.5ml小管中，每管0.5ml。貯存于4℃。

2.抗gp73蛋白抗體包被板(96孔)制備：

酶標(biāo)板采用12×8或8×12可拆條酶標(biāo)板，將抗gp73蛋白抗體用0.05mol/l，ph9.5的碳酸鹽緩沖液稀釋為10-50μg/ml后加入酶標(biāo)板各孔，每孔100μl，吸附過(guò)夜，用清洗緩沖液(pbst溶液，包含20mmol/lpbs，0.5％tween-20，ph7.4)洗板，再用每孔120μl封閉液緩沖液(2％bsa，稀釋于pbst溶液中)封閉過(guò)夜，棄去封閉液，晾干，即獲得抗gp73蛋白抗體包被板(96孔)，鋁箔袋真空封閉包裝備用。

3.辣根過(guò)氧化物酶(hrp)標(biāo)記的抗gp73蛋白抗體制備(全過(guò)程避光處理)。

稱取hrp5mg，加ddh2o250μl溶解；稱取naio45mg，加ddh2o250μl溶解，配制成20mg/ml的濃度；往hrp溶液中逐滴加入naio4溶液，邊加邊攪拌，將混合好的溶液置于4℃，靜置30分鐘。取5ml乙二醇溶于25μlddh2o中，逐滴加入上述混合溶液中，邊加邊攪拌，hrp終濃度為10mg/ml，室溫靜置30分鐘。

調(diào)整抗gp73蛋白抗體濃度為5mg/ml左右，將抗gp73蛋白抗體與hrp按1:4混合，于50mmol/lph9.5碳酸鹽緩沖液中透析6小時(shí)以上，頭兩個(gè)小時(shí)換液一次。

用新鮮配置的1mgnabh4溶液終止反應(yīng)，搖勻，4℃靜置2小時(shí)，每半小時(shí)搖一次。

用ph7.2的10mmpbs(預(yù)配置0.01mol/l的na2hpo4和nah2po4儲(chǔ)備液，根據(jù)需要的ph值混勻二者成pbs緩沖液)透析過(guò)夜，換液一次。

完成hrp標(biāo)記的抗gp73蛋白抗體溶液用飽和硫酸銨溶液透析過(guò)夜，然后用超濾管12000rpm離心，得到濃縮純化的hrp標(biāo)記的抗gp73蛋白抗體。

hrp標(biāo)記的抗gp73蛋白抗體用含10％胎牛血清的緩沖液(20mmol/lpbs)稀釋至合適的工作濃度，推薦稀釋濃度≥1:500，按10ml/瓶分裝，貯存于4℃。

4.顯色液a配制：用磷酸-檸檬酸緩沖液(50mmol/l，ph5.0)配制3％過(guò)氧化氫溶液，按5ml/瓶分裝。

5.顯色液b配制：tmb(0.1mg/ml)甲醇溶液，按5ml/瓶分裝。

6.終止液配制：2mol/lh2so4，按5ml/瓶分裝。

7.洗液(20倍濃縮液)：pbs(ph7.4)配制的1％吐溫20溶液，按50ml/瓶分裝。

將gp73標(biāo)準(zhǔn)品，抗gp73蛋白抗體包被板，hrp標(biāo)記的抗gp73蛋白抗體，顯色液a，顯色液b，終止液1瓶，洗液(20×濃縮)按照要求組裝成gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑(96人份)。

實(shí)施案例4：

gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑(96人份)的使用方法，所述使用方法主要步驟如下：

1、清洗緩沖液配制：將濃縮緩沖液加純化水20倍稀釋備用。

2、準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品包括5個(gè)不同濃度，分別為0、20ng/ml、40ng/ml、100ng/ml、250ng/ml。

3、抗原-抗體反應(yīng)：在抗體包被板的微孔中分別加入100μl樣本稀釋液，然后加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)血清樣品各10μl，37℃孵育30分鐘，然后用清洗緩沖液洗板4次。

4、酶聯(lián)反應(yīng)：每孔加入100μlhrp標(biāo)記的抗gp73蛋白抗體溶液，37℃孵育30分鐘，然后用清洗緩沖液洗板4次。

5、顯色反應(yīng)：每孔依次加入顯色液a、顯色液b各50μl，37℃孵育10分鐘，每孔再加入50μl終止液結(jié)束反應(yīng)。

6、比色：以空白對(duì)照孔的吸光值調(diào)零，用酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定od平均值；記錄各孔吸光值；計(jì)算雙孔標(biāo)準(zhǔn)品od值的平均值。

7、結(jié)果計(jì)算：

1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定的平均od值為縱坐標(biāo)，繪制本次測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線；計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸系數(shù)r²，當(dāng)r²≥0.98時(shí)，本次實(shí)驗(yàn)有效。

2)計(jì)算待測(cè)樣品濃度：根據(jù)待測(cè)樣本的od值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出gp73濃度。

實(shí)施案例5：

免疫層析法為上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析法、乳膠免疫層析法、膠體金免疫層析法、發(fā)光免疫層析法、量子點(diǎn)免疫層析法的至少一種。

gp73免疫層析法檢測(cè)試劑制備：所述免疫層析法為上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析法、乳膠免疫層析法、膠體金免疫層析法、發(fā)光免疫層析法、量子點(diǎn)免疫層析法或免疫層析法相應(yīng)改進(jìn)方法的至少一種，不同免疫層析法之間僅標(biāo)記顆粒之間存在差異，反應(yīng)原理相同，經(jīng)抗gp73蛋白抗體濃度優(yōu)化處理后，均能達(dá)到精確定量檢測(cè)鑒別脂肪肝人群中的單純性脂肪變和脂肪性肝炎，達(dá)到輔助診斷和治療脂肪性肝炎的目的。gp73免疫層析法的制備均來(lái)自成熟的免疫層析法制備技術(shù)，并對(duì)該技術(shù)進(jìn)行相關(guān)優(yōu)化，使之達(dá)到優(yōu)異的檢測(cè)結(jié)果。

為更優(yōu)的解釋本發(fā)明，本發(fā)明某些實(shí)施方案中所述的免疫層析法優(yōu)選上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析法制備的檢測(cè)試劑，上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析法制備的檢測(cè)試劑的制備參照北京熱景生物技術(shù)股份有限公司相關(guān)專利技術(shù)公開(kāi)方法進(jìn)行，所述抗體為實(shí)施案例1中所述的抗gp73蛋白抗體。

gp73免疫層析法檢測(cè)試劑制備：

1、包被：

將抗gp73蛋白抗體稀釋到2mg/ml，作為t線包被液，將羊抗鼠igg稀釋到2mg/ml，作為c線包被液，通過(guò)噴膜機(jī)，將t線包被液和c線包被液包被到硝酸纖維素膜上，晾干，即獲得單克隆抗體包被膜條。

2、上轉(zhuǎn)化發(fā)光顆粒(ucp)標(biāo)記抗體：

稱取10mgucp顆粒置于錐形瓶中，加入10mlph＝7.2的0.20mpb溶液，制備成ucp顆粒懸濁液，然后加入0.5-2mg抗gp73蛋白抗體，再加入無(wú)水戊二醛至終濃度1％，37℃攪拌過(guò)夜；12000rpm，4℃，離心15min，棄上清；ucp沉淀物中加入10mlph＝7.2的0.20mpb溶液，吹打混勻；12000rpm，4℃，離心15min，棄上清，收集ucp沉淀物待用。

3、gp73免疫層析法檢測(cè)試劑的凍干結(jié)合墊制備：

用50mlph＝7.2的0.20mpb溶液將ucp沉淀物重懸，制備成ucp標(biāo)記物懸濁液，12000rpm，4℃，離心30min，棄上清；加入45ml的凍干液(ph＝7.20.20mpb，含2％bsa，3％蔗糖)；將ucp標(biāo)記物懸濁液按2-5cm²/ml加于玻璃纖維上，真空凍干11h；將凍干的結(jié)合墊裁剪成1cm寬的長(zhǎng)條，即為gp73免疫層析法檢測(cè)試劑的凍干結(jié)合墊。

4、組裝試紙條：

依次將硝酸纖維素膜、吸水紙、結(jié)合墊、樣品墊貼到底板上，切成4.0mm寬的紙條，然后裝到塑料卡底殼中，蓋上塑料卡上殼，壓緊，加入干燥劑，密封包裝。

5、樣本稀釋液配制：

樣本稀釋液成分為ph＝7.2的0.20mpb溶液，加入1％tween20。

6、組裝的gp73免疫層析法檢測(cè)試劑條和樣本稀釋液共同組成gp73免疫層析法檢測(cè)試劑，適配北京熱景生物技術(shù)股份有限公司的upt-3a系列上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫分析儀使用。

實(shí)施案例6：

gp73定量檢測(cè)樣本的準(zhǔn)備，所述檢測(cè)樣本均來(lái)自臨床樣本，具有明確臨床診斷背景，臨床診斷均為脂肪肝背景。

所述臨床確診為脂肪肝背景的樣本總計(jì)200例，包括確診為脂肪性肝炎背景的肝病進(jìn)程樣本(包括脂肪性肝炎引起的肝纖維化樣本和肝硬化樣本，不包含肝癌患者樣本，以下簡(jiǎn)稱脂肪型肝炎樣本)的血清/血漿樣本63例，單純脂肪變的脂肪肝樣本137例。

全血樣本不易長(zhǎng)期保存，不適宜建立長(zhǎng)期隊(duì)列樣本進(jìn)行檢測(cè)分析，在本發(fā)明所述實(shí)施案例中未做分析，但依據(jù)本發(fā)明改進(jìn)的適宜于全血檢測(cè)gp73用于在脂肪肝人群中診斷鑒別單純性脂肪變和脂肪性肝炎的檢測(cè)gp73的方法及其判定標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)仍視為在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

實(shí)施案例7：

分別用gp73磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑、gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑、gp73免疫層析法檢測(cè)試劑等三種方法的定量檢測(cè)試劑檢測(cè)200例臨床確診為脂肪肝背景的樣本，分別對(duì)檢測(cè)結(jié)果分別進(jìn)行匯總分析。

不同方法學(xué)檢測(cè)結(jié)果分析：

統(tǒng)計(jì)分析gp73磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑、gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑、gp73免疫層析法檢測(cè)試劑三種試劑檢測(cè)結(jié)果的絕對(duì)偏倚、相對(duì)偏倚和線性相關(guān)性，判斷不同方法學(xué)之間的偏差情況。

a、絕對(duì)偏倚分析，根據(jù)“方法對(duì)比及偏差評(píng)估方法ncclsep9-a”相關(guān)規(guī)定的方法和標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算所有樣本絕對(duì)偏差：

所述200例gp73磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑、gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果最大絕對(duì)偏差為20.08,小于200例gp73磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑、gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果的平均絕對(duì)偏差的4倍，即20.22。詳見(jiàn)圖1，200例gp73磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑、gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果絕對(duì)偏倚圖。

所述200例gp73磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑、gp73免疫層析法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果最大偏差為20.92,小于200例gp73磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑、gp73免疫層析法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果的平均絕對(duì)偏差的4倍，即20.10。詳見(jiàn)圖2，200例gp73磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑、gp73免疫層析法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果絕對(duì)偏倚圖。

所述200例gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑檢測(cè)、gp73免疫層析法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果最大絕對(duì)偏差為17.43,小于gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑檢測(cè)、gp73免疫層析法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果的平均絕對(duì)偏差的4倍，即19.03。詳見(jiàn)圖3，200例gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑檢測(cè)、gp73免疫層析法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果絕對(duì)偏倚圖。

依據(jù)上述分析結(jié)果，gp73磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑、gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑、gp73免疫層析法檢測(cè)試劑三種試劑的檢測(cè)結(jié)果的絕對(duì)偏差均在ncclsep9-a規(guī)定范圍內(nèi)，三種方法學(xué)之間無(wú)明顯偏差。

b、相對(duì)偏倚分析，根據(jù)“方法對(duì)比及偏差評(píng)估方法ncclsep9-a”相關(guān)規(guī)定的方法和標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算所有樣本相對(duì)偏差：

所述200例gp73磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑、gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果最大相對(duì)偏差為30.89％,小于200例gp73磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑、gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果的平均相對(duì)偏差的4倍，即32.36％。詳見(jiàn)圖4，200例gp73磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑、gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果相對(duì)偏倚圖。

所述200例gp73磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑、gp73免疫層析法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果最大相對(duì)偏差為33.91％,小于200例gp73磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑、gp73免疫層析法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果的平均相對(duì)偏差的4倍，即33.98％。詳見(jiàn)圖5，200例gp73磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑、gp73免疫層析法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果相對(duì)偏倚圖。

所述200例gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑、gp73免疫層析法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果最大相對(duì)偏差為30.48％,均小于gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑、gp73免疫層析法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果的平均相對(duì)偏差的4倍，即30.55％。詳見(jiàn)圖6，200例gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑、gp73免疫層析法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果相對(duì)偏倚圖。

依據(jù)上述分析結(jié)果，gp73磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑、gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑、gp73免疫層析法檢測(cè)試劑三種試劑的檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)偏差均在ncclsep9-a規(guī)定范圍內(nèi)，三種方法學(xué)之間無(wú)明顯偏差。

c、線性相關(guān)性分析：

將所述200例gp73磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑、gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果采用graphpadprism4.0軟件進(jìn)行相關(guān)系數(shù)的計(jì)算：r²＝0.9927。詳見(jiàn)圖7，所述200例gp73磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑、gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果線性相關(guān)性。

將所述200例gp73磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑、gp73免疫層析法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果采用graphpadprism4.0軟件進(jìn)行相關(guān)系數(shù)的計(jì)算：r²＝0.9916。詳見(jiàn)圖8，所述200例gp73磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑、gp73免疫層析法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果線性相關(guān)性。

將所述200例gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑、gp73免疫層析法檢測(cè)檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果采用graphpadprism4.0軟件進(jìn)行相關(guān)系數(shù)的計(jì)算：r²＝0.9904。詳見(jiàn)圖9，所述200例gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑、gp73免疫層析法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果線性相關(guān)性。

根據(jù)絕對(duì)偏倚分析、相對(duì)偏倚分析和線性相關(guān)性分析結(jié)果，gp73用于脂肪肝樣本檢測(cè)分析時(shí)，gp73磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑、gp73酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑、gp73免疫層析法檢測(cè)試劑三種方法學(xué)對(duì)于脂肪肝樣本的檢測(cè)結(jié)果具有良好的一致性。

檢測(cè)結(jié)果cut-off值設(shè)定及臨床一致性分析：

a、cut-off值設(shè)定：

以gp73磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果分析，根據(jù)200例臨床背景為依據(jù),根據(jù)roc曲線分析，gp73在用于脂肪肝人群中鑒別診斷單純性脂肪變和脂肪性肝炎的cut-off值為82.25ng/ml.詳見(jiàn)圖10，roc曲線分析圖；圖11，gp73檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)分布圖。

b、臨床一致性分析：

與已知臨床背景結(jié)果(單純性脂肪變137例，脂肪性肝炎63例)對(duì)比分析，以gp73含量為82.25ng/ml作為在脂肪肝人群中鑒別診斷單純性脂肪變和脂肪性肝炎的cut-off值，檢測(cè)結(jié)果單純性脂肪變符合率均為86.86％,脂肪性肝炎符合率均為85.71％，總符合率為86.50％，詳見(jiàn)圖12，臨床一致性分析圖。臨床背景與檢測(cè)結(jié)果不符合的偏差樣本主要集中在靶值82.25ng/ml的±20％之間。

根據(jù)本發(fā)明實(shí)施案例分析，血清學(xué)靶標(biāo)志物gp73及其應(yīng)用可以作為在脂肪肝人群中鑒別診斷單純性脂肪變和脂肪性肝炎的優(yōu)秀血清學(xué)靶標(biāo)志物，以gp73含量為82.25ng/ml作為在脂肪肝人群中鑒別診斷單純性脂肪變和脂肪性肝炎的cut-off值，特異性為86.86％，敏感性為85.71％，不同檢測(cè)方法之間的檢測(cè)結(jié)果一致性好。

血清學(xué)靶標(biāo)志物gp73及其應(yīng)用對(duì)于臨床鑒別診斷脂肪肝人群中的單純性脂肪變和脂肪性肝炎，輔助單純性脂肪變和脂肪性肝炎的治療具有極高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

上述實(shí)施案例描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施案例，如前所述，應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的解釋，而非局限于本發(fā)明實(shí)施案例披露的形式，不應(yīng)看做是對(duì)其他實(shí)施例的排除，而可以用于各種其他形式的組合、修改，并能夠在本發(fā)明的構(gòu)思范圍內(nèi)改動(dòng)。本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化在本發(fā)明構(gòu)思及范圍內(nèi)的，都應(yīng)在本發(fā)明所附權(quán)利要求保護(hù)范圍內(nèi)。