肝病標(biāo)記物、其測(cè)定方法、裝置和醫(yī)藥品的檢驗(yàn)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種肝病標(biāo)記物、其測(cè)定方法、裝置和醫(yī)藥品的檢驗(yàn)方法。本發(fā)明測(cè)定血液中的γ-Glu-X(X為氨基酸和胺)肽類的濃度或AST、ALT的值，由該測(cè)定值進(jìn)行例如多元邏輯回歸，從而鑒定健康人、藥物性肝損傷、無癥狀乙型肝炎攜帶者、無癥狀丙型肝炎攜帶者、慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、肝癌、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、單純性脂肪肝(SS)等肝病。
【專利說明】肝病標(biāo)記物、其測(cè)定方法、裝置和醫(yī)藥品的檢驗(yàn)方法
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?00980152582.2 (國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/JP2009/069950)的原申請(qǐng)的分案申請(qǐng)，該原申請(qǐng)的申請(qǐng)日為2009年11月26日，發(fā)明名稱為“肝病標(biāo)記物、其測(cè)定方法、裝置和醫(yī)藥品的檢驗(yàn)方法”。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及肝病標(biāo)記物、其測(cè)定方法、裝置和醫(yī)藥品的檢驗(yàn)方法，特別是，涉及將各種肝病患者與健康人識(shí)別開從而能夠進(jìn)行篩選的肝病標(biāo)記物、其測(cè)定方法、裝置和使用了該肝病標(biāo)記物的醫(yī)藥品的檢驗(yàn)方法。

【背景技術(shù)】
[0003]肝病包括藥物性肝炎、乙型、丙型肝炎、肝硬化、肝癌等多種多樣的肝病，另外還存在無癥狀的乙型、丙型病毒的攜帶者。特別是，七成的丙型肝炎病毒(HCV)感染者由于慢性的肝臟的炎癥(慢性肝炎)而逐漸喪失正常的肝細(xì)胞，肝臟纖維化，然后發(fā)展為肝硬化，進(jìn)而甚至發(fā)展為肝癌。據(jù)報(bào)道，在10-15%的丙型慢性肝炎患者、80%的肝硬化患者中會(huì)產(chǎn)生肝癌。雖然慢性肝炎的狀態(tài)下不會(huì)對(duì)生命造成危險(xiǎn)，但若產(chǎn)生肝癌，或者肝硬化發(fā)展而引起肝功能衰竭的話，則生命的危險(xiǎn)迫在眉睫。因此，需要在早期診斷丙型肝炎，驅(qū)除病毒。
[0004]丙型肝炎會(huì)無癥狀地從肝硬化發(fā)展為肝癌，肝臟的功能極度降低，產(chǎn)生倦怠感、黃疸、意識(shí)障礙等各種障礙，但目前在該階段還沒有有效的治療法。因此，需要在肝臟的功能惡化前，盡早檢測(cè)癥狀的發(fā)展，實(shí)施干擾素給藥等治療等。但是，現(xiàn)狀是尚未確立可正確且迅速地鑒定各種肝病的方法。
[0005]通常若被懷疑是肝病，會(huì)進(jìn)行問診、視診、觸診，同時(shí)測(cè)定血中的AST、ALT、Y-GTP、堿性磷酸酶(AL-P)、膽堿酯酶(ChE)、膽紅素等肝功能標(biāo)記物。這些生物化學(xué)檢查值存在異常時(shí)，進(jìn)行乙型或丙型肝炎病毒檢查、超聲波檢查、X射線、CT等圖像檢查。癌的判定中測(cè)定血中的AFP、PIVKA-11、CEA等蛋白質(zhì)的腫瘤標(biāo)記物。此外，需要正確判斷的情況下，進(jìn)行腹腔鏡檢查、肝活檢(需要住院一周左右)(非專利文獻(xiàn)I)。
[0006]這樣為了鑒定肝病，必須接受許多檢查，在得到判斷之前需要花費(fèi)數(shù)天。另外，腹腔鏡檢查和肝活檢還會(huì)將患者暴露于危險(xiǎn)之下，使其遭受肉體的痛苦。腹腔鏡檢查和肝活檢對(duì)患者的負(fù)擔(dān)較大，因此不能為了進(jìn)行病情的確認(rèn)等而頻繁進(jìn)行。此外，在現(xiàn)有方法中，許多檢查和判斷必須由專家來進(jìn)行，將負(fù)擔(dān)強(qiáng)加于短缺的醫(yī)療工作者。因此，強(qiáng)烈期望一種不對(duì)患者造成負(fù)擔(dān)、迅速、正確且簡(jiǎn)便的肝病的判斷方法。
[0007]已知的是，肝炎、肝硬化、肝癌等許多肝損傷都是因活性氧的生成(氧化應(yīng)激)和將其除去的生物體的防御系統(tǒng)的破綻而引起的(非專利文獻(xiàn)2)。針對(duì)活性氧等氧化應(yīng)激的生物體的防御中的主要一種是由谷胱甘肽系統(tǒng)產(chǎn)生的。作為組織中以最高濃度存在的抗氧化物質(zhì)，有還原型谷胱甘肽(GSH:以下稱為谷胱甘肽)，通過谷胱甘肽與活性氧、親電物質(zhì)結(jié)合，這些物質(zhì)被還原，氧化應(yīng)激得到抑制。
[0008]但是，若谷胱甘肽減少，則組織、細(xì)胞暴露于氧化應(yīng)激中，會(huì)引起各種病情(非專利文獻(xiàn)3)。據(jù)報(bào)道，實(shí)際上肝損傷中也會(huì)因乙型或丙型肝炎病毒的感染，氧化應(yīng)激亢進(jìn)，谷胱甘肽減少，或者在丙型肝炎、肝硬化、肝癌的患者或小鼠中谷胱甘肽減少(非專利文獻(xiàn)2、4)。
[0009]通過服用藥物而誘發(fā)的藥物性肝炎也會(huì)因氧化應(yīng)激而引起。解熱鎮(zhèn)痛藥撲熱息痛(APAP)在肝臟代謝，生成高毒性的親電物質(zhì)N-乙酰對(duì)苯醌亞胺(NAQPI)。該NAQPI通過與在肝臟中以高濃度存在的谷胱甘肽(GSH)結(jié)合，從而被解毒、排泄掉。但是，親電物質(zhì)大量存在的情況下，谷胱甘肽會(huì)枯竭，親電物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)蓄積(氧化應(yīng)激)，與生物體高分子反應(yīng)。其結(jié)果，已知細(xì)胞的功能紊亂，引起藥物性肝炎等病態(tài)。
[0010]迄今為止發(fā)明人發(fā)現(xiàn):若對(duì)小鼠大量投與APAP，則為了將由APAP的代謝生成的親電物質(zhì)NAQPI解毒，谷胱甘肽減少，視晶酸與之成反比地劇增(參見圖1的(B))，肝臟和血中的視晶酸的增加表明肝臟的谷胱甘肽由于親電物質(zhì)而枯竭(專利文獻(xiàn)1、非專利文獻(xiàn)5)。
[0011]其機(jī)制如下所述。如圖1所示，谷胱甘肽U-Glu-Cys-Gly)和視晶酸(y-Glu-2AB-Gly)是由相同的兩種酶即Y _谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶生物合成的三肽，差別在于底物(起始物質(zhì))為半胱氨酸(Cys)或2-氨基丁酸(2AB)。在圖1的(A)所示的通常的還原狀態(tài)下，肝臟內(nèi)大量存在谷胱甘肽，最初的酶Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶被反饋(FB)抑制。因此，視晶酸幾乎不被生物合成。但是，如圖1的(B)所示的氧化狀態(tài)那樣，若存在親電物質(zhì)或活性氧種，則由于解毒而消耗谷胱甘肽。通過谷胱甘肽的減少，反饋抑制被解除，Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活化，谷胱甘肽和視晶酸被生物合成。視晶酸在肝臟內(nèi)蓄積，還排泄到血中。這樣通過親電物質(zhì)等而形成氧化狀態(tài)時(shí)，肝臟或血液的視晶酸增加，因此視晶酸成為氧化應(yīng)激的生物標(biāo)記物。
[0012]另外，還有文獻(xiàn)報(bào)道，在因肥胖而內(nèi)臟脂肪增加從而出現(xiàn)問題的非酒精性脂肪肝病(NAFLD)中，氧化應(yīng)激標(biāo)記物的血清硫氧還蛋白(TRX)對(duì)于由肝硬化向肝癌發(fā)展的非酒精性脂肪肝炎(NASH)和有一個(gè)良性過程的單純性脂肪肝(SS)的識(shí)別有用(非專利文獻(xiàn)6)。
[0013]另一方面，根據(jù)基于毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜儀(CE-MS)的試樣中的代謝物質(zhì)測(cè)定法的、細(xì)胞內(nèi)的代謝物質(zhì)的網(wǎng)羅性的測(cè)定方法(例如，參見非專利文獻(xiàn)5、7和8)，為了監(jiān)測(cè)人或動(dòng)物的身體狀態(tài)，定性地且/或定量地確定來自該人或動(dòng)物的身體的液體樣品的低分子化合物(代謝物質(zhì))模式和/或肽模式，這里，該液體樣品的代謝物質(zhì)和肽通過毛細(xì)管電泳而被分離，接著直接被離子化，然后用通過接口與計(jì)算機(jī)連接的質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。為了長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)該人或動(dòng)物的身體狀態(tài)，將表示該狀態(tài)的參照值和樣品值、以及由該值導(dǎo)出的偏差和一致性自動(dòng)存儲(chǔ)于數(shù)據(jù)庫(kù)中。在組合毛細(xì)管電泳和質(zhì)量分析而對(duì)陰離子性化合物進(jìn)行分離分析的情況下，已知一種陰離子性化合物的分離分析方法，其特征在于，使用毛細(xì)管的內(nèi)表面預(yù)先包覆為陽(yáng)離子性的包覆毛細(xì)管，將電滲流反轉(zhuǎn)(例如，參見專利文獻(xiàn)2)。
[0014]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0015]專利文獻(xiàn)
[0016]專利文獻(xiàn)1:日本特開2007-192746號(hào)公報(bào)
[0017]專利文獻(xiàn)2:日本專利第3341765號(hào)公報(bào)
[0018]非專利文獻(xiàn)
[0019]非專利文獻(xiàn)I:CalIewaert, N.et al.Nat.Med.10, 429-434，2004.
[0020]非專利文獻(xiàn)2:Loguerc1, Carmela et al.Free Radic.B1l.Med.34, 1-10, 2003.
[0021]非專利文獻(xiàn)3:Yadav, Dhiraj et al.Am.J.Gastroenterol.97, 2634-2639, 2002.
[0022]非專利文獻(xiàn)4:Moriya, K.et al.Cancer Res.61，4365-4370，2001.
[0023]非專利文獻(xiàn)5:Soga, T.et al.J.B1l.Chem.281，16768-16776，2006.
[0024]非專利文獻(xiàn)6:谷川久一編“氧化應(yīng)激和肝病<第5卷>”116(1;[031 Tribune公司，3-37 頁(yè)，2009.5.7.
[0025]非專利文獻(xiàn)7:Soga, T.et al.J.Proteome Res.2.488-494，2003.
[0026]非專利文獻(xiàn)8:Hirayama，A.et al.Cancer.Res.69: (II).(JuneI, 2009)4918-4925
[0027]非專利文獻(xiàn)9:Pignatelli, B.et al.Am.J.Gastroenterol.96, 1758-1766，2001.


【發(fā)明內(nèi)容】

[0028]發(fā)明要解決的問題
[0029]但是，一直以來，難以通過一次檢查識(shí)別并鑒定藥物性肝炎、乙型、丙型肝炎、肝硬化、肝癌、無癥狀的乙型或丙型病毒攜帶者等。
[0030]本發(fā)明是為了消除上述現(xiàn)有問題而進(jìn)行的，其課題在于，通過測(cè)定血液中的低分子生物標(biāo)記物，能夠迅速鑒定藥物性肝炎、乙型、丙型肝炎、肝硬化、肝癌、無癥狀的乙型或丙型病毒攜帶者、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、單純性脂肪肝
(SS)等肝病。
[0031]用于解決問題的方案
[0032]如上所述，肝炎、肝硬化、肝癌等許多肝損傷與氧化應(yīng)激具有很深的關(guān)系，因而可以預(yù)測(cè)視晶酸濃度因各種肝病而變動(dòng)。因此，從健康人(control:C)、藥物性肝損傷(druginduced liver injury:DI)患者、無癥狀乙型肝炎攜帶者(asymptomatic hepatitis Bcarrier:AHB)、無癥狀丙型肝炎攜帶者(asymptomatic hepatitis C carrier:AHC)、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B:CHB)、慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C:CHC)、肝癌(hepatocellular carcinoma:HCC)的患者采集血液,測(cè)定血清中的視晶酸。但是，與小鼠不同，從健康人或藥物性肝炎患者中幾乎未檢測(cè)到視晶酸。(小鼠的血清中的視晶酸的濃度為約2 μ M，人的血清中的濃度為約1/20左右，在健康人或藥物性肝炎患者中幾乎未檢測(cè)到。)
[0033]但是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了在各種肝炎患者的血清中顯著增加的物質(zhì)，鑒定這些物質(zhì)為Y-Glu-X肽類(注:Χ表示氨基酸和胺)。此外，通過使用血清中的肝功能標(biāo)記物即AST和ALT的值和Y-Glu-X肽類的濃度，根據(jù)多元邏輯回歸模式進(jìn)行多變量分析，從而成功地將各種肝炎患者與其他對(duì)象進(jìn)行區(qū)分。
[0034]根據(jù)本發(fā)現(xiàn)，通過測(cè)定血液中的Y -Glu-X肽類的濃度和AST、ALT的值，能夠迅速地鑒定健康人、藥物性肝損害、無癥狀乙型肝炎攜帶者、無癥狀丙型肝炎攜帶者、慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、肝癌等肝病。
[0035]此外，還能夠用于非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、單純性脂肪肝(SS)的識(shí)別。
[0036]本發(fā)明是基于上述見解而進(jìn)行的，涉及一種肝病標(biāo)記物，其特征在于，其為用于檢測(cè)哺乳動(dòng)物的組織中的親電物質(zhì)毒性和活性氧(氧化應(yīng)激)的標(biāo)記物，并且其為 γ-Glu-Gly、y-Glu-Ala、Y -Glu-SerΛ Y -Glu-VaK Y -Glu-ThrΛ Y-Glu-牛橫酸、
Y—Glu-1le-, Y —Glu-Leu-, Y —Glu-Asn-, Y —Glu-Asp-, Y —Glu-Gln-, Y —Glu-Lys-, Y —Glu-Glu-,
Y-Glu-Met> Y -Glu-His> y -Glu-Phe> y -Glu-Trp> Y-Glu-Arg、y -Glu-瓜氨酸、
Y-Glu-Tyr中的任一種。
[0037]另外，一種健康人識(shí)別用的肝病標(biāo)記物，其特征在于，其為上述肝病標(biāo)記物，并且其選自由 Y-Glu-Phe、Y -Glu-Ser> y -Glu-Thr> y -Glu-Gly> Y-Glu-Glu 組成的組。
[0038]另外，一種肝病標(biāo)記物，其特征在于，其為上述的肝病標(biāo)記物，并且其還為兩個(gè)以上的Y-Glu-X(X為氨基酸和胺)肽的組合。這里，可以使所述組合為從多元邏輯回歸分析中選擇的組合。
[0039]另外，一種藥物性肝炎識(shí)別用的肝病標(biāo)記物，其特征在于，其為上述肝病標(biāo)記物，并且其為至少含有 Y-Glu-Thr、Y-Glu-Leu, y-Glu-His, Y-Glu-Phe 的組合。
[0040]另外，一種肝癌識(shí)別用的肝病標(biāo)記物，其特征在于，其為上述肝病標(biāo)記物，并且其為至少含有 Y -Glu-Val > Y -Glu-Thr> y -Glu-Leu> y -Glu-Phe> Y-Glu-Tyr 的組合。
[0041]另外，一種無癥狀乙型肝炎攜帶者識(shí)別用的肝病標(biāo)記物，其特征在于，其為上述肝病標(biāo)記物，并且其為至少含有Y-Glu-Val、Y-Glu-Gln, y-Glu-His, Y-Glu-Phe的組合。
[0042]另外，一種慢性乙型肝炎識(shí)別用的肝病標(biāo)記物，其特征在于，其為上述肝病標(biāo)記物，并且其至少含有Y-Glu-Lys。
[0043]另外，一種無癥狀丙型肝炎攜帶者識(shí)別用的肝病標(biāo)記物，其特征在于，其為上述肝病標(biāo)記物，并且其為至少含有AST、Y-Glu-Gly, Y-Glu-Phe的組合。
[0044]另外，一種慢性丙型肝炎識(shí)別用的肝病標(biāo)記物，其特征在于，其為上述肝病標(biāo)記物，并且其為至少含有Y-Glu-Ser、y-Glu-Phe, Y-Glu-Tyr的組合。
[0045]另外，一種肝病標(biāo)記物，其特征在于，其為Y-Glu-X肽，X為氨基酸和胺，并且其用于非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)或單純性脂肪肝(SS)的識(shí)別。
[0046]另外，本發(fā)明涉及一種肝病標(biāo)記物的測(cè)定方法，其特征在于，測(cè)定樣品中的Y-Glu-Gly、Y -Glu~Ala> y -Glu-Ser> y -Glu-Val > y -Glu-Thr> y -Glu-牛橫酸、
Y—Glu-1le-, Y —Glu-Leu-, Y —Glu-Asn-, Y —Glu-Asp-, Y —Glu-Gln-, Y —Glu-Lys-, Y —Glu-Glu-,
Y-Glu-Met> Y -Glu-His> y -Glu-Phe> y -Glu-Trp> γ-Glu-Arg、y -Glu-瓜氨酸、
Y-Glu-Tyr中的任一者作為肝病標(biāo)記物。
[0047]另外，涉及一種肝病標(biāo)記物的測(cè)定裝置，其特征在于，其具備以下單元:由樣品制作適于分析的試樣的單元；分析單元，用于測(cè)定試樣中的Y-Glu-Gly、Y -Glu-Ala>
Y-Glu-Ser> y -Glu-Val> y -Glu-Thr> y -Glu-牛橫酸、γ-Glu-1le、y -Glu-Leu>
Y-Glu-Asn> Y -Glu-Asp> Y_Glu_Gln> y-Glu-Lys> y _Glu_Glu> y-Glu-Met> y-Glu-His>y -Glu-Phe> y -Glu-Trp> y -Glu-Arg> Y-Glu-瓜氨酸、Y-Glu-Tyr 中的任一者作為肝病標(biāo)記物。
[0048]另外，涉及一種醫(yī)藥品的檢驗(yàn)方法，其特征在于，其包括以下工序:在醫(yī)藥品的給藥前和給藥后采集的人的血液中測(cè)定上述任一項(xiàng)所述的肝病生物標(biāo)記物的濃度的工序；在所述醫(yī)藥品的給藥前的血液和給藥后的血液之間比較所述測(cè)定的結(jié)果的工序。
[0049]另外，涉及一種醫(yī)藥品的檢驗(yàn)方法，其特征在于，其包括以下工序:對(duì)于在人中從由投與醫(yī)藥品的一個(gè)以上的個(gè)體組成的第I組中采集的血液和從由未給藥所述醫(yī)藥品的一個(gè)以上的個(gè)體組成的第2組中采集的血液，測(cè)定上述任一項(xiàng)所述的肝病標(biāo)記物的濃度的工序；在第I組和第2組之間比較所測(cè)定的所述肝病標(biāo)記物的濃度的工序。
[0050]另外，涉及一種肝病標(biāo)記物的測(cè)定方法，其特征在于，測(cè)定從除人以外的哺乳動(dòng)物采集的臟器中的 Y-Glu-Gly、γ-Glu-Ala、y -Glu-Ser> Y-Glu-Val、y -Glu-Thr>
Y-Glu-牛橫酸、Y-Glu-1le、Y-Glu-Leu、y -Glu-Asn> y -Glu-Asp> γ-Glu-Gln、γ-Glu-Lys、γ-Glu-Glu、Y -Glu-MetΛ γ-Glu-His、Y -Glu-PheΛ γ-Glu-Trp、γ-Glu-Arg、Y-Glu-瓜氨酸、Y-Glu-Tyr中的任一者。
[0051]另外，本發(fā)明的肝病的診斷方法的特征在于，其包括以下工序:從作為診斷對(duì)象的一個(gè)以上的人個(gè)體采血的工序；通過上述任一項(xiàng)所述的測(cè)定方法測(cè)定采集的血液中的本發(fā)明的標(biāo)記物的濃度的工序；將該標(biāo)記物的濃度與一個(gè)以上的正常個(gè)體的血液中的標(biāo)記物濃度進(jìn)行比較的工序。
[0052]另外，本發(fā)明的醫(yī)藥品的親電性的毒性副作用(投與醫(yī)藥品的情況下產(chǎn)生的氧化應(yīng)激)的診斷方法的特征在于，其包括以下工序:由醫(yī)藥品給藥前和醫(yī)藥品給藥后的人的個(gè)體采血的工序；通過上述任一項(xiàng)所述的測(cè)定方法測(cè)定采集的血液中的本發(fā)明的標(biāo)記物的濃度的工序；將該標(biāo)記物的濃度與一個(gè)以上的正常個(gè)體的血液中的標(biāo)記物濃度進(jìn)行比較的工序。這里，醫(yī)藥品可以為任意種類。
[0053]這里，測(cè)定標(biāo)記物的濃度的工序包括:分別測(cè)定從個(gè)體采集的血液的工序；測(cè)定從兩個(gè)以上的個(gè)體采集的血液的血池(pool)的工序。另外，比較所測(cè)定的標(biāo)記物的濃度的工序包括:逐一比較各測(cè)定中得到的濃度的工序；比較各測(cè)定中得到的濃度的累加值或者平均值的工序。
[0054]為了檢測(cè)組織中的氧化應(yīng)激，可以使用標(biāo)記物的哺乳動(dòng)物只要是根據(jù)組織中的氧化應(yīng)激能夠在血中測(cè)定本發(fā)明的標(biāo)記物的哺乳類，則沒有限制，優(yōu)選為人。
[0055]對(duì)于采集用于該診斷方法的血液的哺乳動(dòng)物沒有特別限定，優(yōu)選為其血液中存在至少一種上述標(biāo)記物的哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選為小鼠、大鼠等嚙齒類或人、猴、狗。
[0056]發(fā)明的效果
[0057]根據(jù)本發(fā)明，通過測(cè)定血液中的Y-Glu-X肽類的濃度和AST、ALT的值等，能夠迅速地鑒定健康人、藥物性肝損害、無癥狀乙型肝炎攜帶者、無癥狀丙型肝炎攜帶者、慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、肝癌、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、單純性脂肪肝(SS)等肝病。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0058]圖1為示意性地示出通過親電物質(zhì)和活性氧(氧化應(yīng)激)生物合成視晶酸的機(jī)制的圖。
[0059]圖2為示出對(duì)健康人和肝癌患者的血清中的Y-Glu-X(X為氨基酸和胺)肽類的LC-MS測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較的圖。
[0060]圖3為示出對(duì)健康人和各肝炎患者的血清中的AST、ALT、Y _Glu_X肽類的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較的圖。
[0061]圖4為示出利用AST、ALT、Y _Glu_X肽類的正常情況、各肝病的篩選檢查的精度的圖。
[0062]圖5為示出對(duì)肝癌患者和胃癌患者的血清中的Y-Glu-X肽類的濃度進(jìn)行比較的圖。
[0063]圖6為示出對(duì)投與BS0、DEM小鼠的肝臟中的Y _Glu_X、Y-Glu-X-Gly的定量結(jié)果進(jìn)行比較的圖。
[0064]圖7為示意性地示出在各種肝病患者中生物合成Y -Glu-X肽類的機(jī)制的圖。

【具體實(shí)施方式】
[0065]以下，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0066]如上所述，已知肝炎、肝硬化、肝癌等許多肝損傷與氧化應(yīng)激具有很深的關(guān)系。因此，測(cè)定10名健康人(C)、31名藥物性肝損害(DI)患者、8名無癥狀乙型肝炎攜帶者(AHB)、8名無癥狀丙型肝炎攜帶者(AHC)UO名慢性乙型肝炎(CHB)患者、21名慢性丙型肝炎(CHC)患者、14名肝癌(HCC)患者的血清，利用毛細(xì)管電泳-飛行時(shí)間質(zhì)譜(CE-TOFMS)法測(cè)定視晶酸濃度。但是，發(fā)現(xiàn)其他物質(zhì)在各肝炎患者中優(yōu)勢(shì)增加，鑒定它們均為Y-Glu-X肽類(注:X表示氨基酸和胺)。
[0067]1.從血清提取代謝物質(zhì)
[0068]將從健康人和各種肝炎患者采集的血清(100 μ I)加入到添加有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的甲醇900 μ I中，使酶失活,停止代謝的亢進(jìn)。加入400 μ I的超純水、1000 μ I的氯仿后,在4°C以4600g尚心5分鐘。靜置后，使分尚的水-甲醇相750 μ I通過分級(jí)分子量為5kDa的尚心超濾器，除去蛋白質(zhì)。冷凍干燥濾液后，加入50 μ I的Mill1-Q水，將其供于CE-TOFMS和LC-MS測(cè)定。
[0069]2.利用毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜儀(CE-TOFMS)測(cè)定血清中的代謝物
[0070]使用CE-T0FMS，同時(shí)測(cè)定健康人和肝炎患者的血清中的低分子代謝產(chǎn)物。
[0071]CE-TOFMS 分析條件
[0072]a.毛細(xì)管電泳(CE)的分析條件
[0073]毛細(xì)管使用熔融石英毛細(xì)管(內(nèi)徑50 μ m、外徑350 μ m、全長(zhǎng)100cm)。緩沖液使用IM甲酸(pH約1.8)。以施加電壓為+30kV、毛細(xì)管溫度為20°C的條件進(jìn)行測(cè)定。使用加壓法，以50mbar、3秒(約3nl)注入試樣。
[0074]b.飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(TOFMS)的分析條件
[0075]使用正離子模式，設(shè)定為離子化電壓4kV、碎裂器電壓75V、錐孔電壓(skimmervoltage)電壓50V、0ct RF電壓125V。干燥氣體使用氮?dú)?，設(shè)定為溫度300°C、壓力lOpsig。鞘液使用50%甲醇溶液，為了用于質(zhì)量校正而混入0.5μΜ利血平(m/z609.2807),以10μ Ι/min輸送液體。對(duì)使用利血平(m/z609.2807)和甲醇的加合離子(m/z83.0703)的質(zhì)量數(shù)得到的全部數(shù)據(jù)進(jìn)行自動(dòng)校正。
[0076]3.利用液相色譜儀-質(zhì)譜儀(LC-MSMS)測(cè)定血清中的Y -Glu-X肽類
[0077]為了高靈敏度地進(jìn)行測(cè)定，使用LC-MSMS測(cè)定血清中的Y -Glu-X肽類。
[0078]a.液相色譜儀(LC)的分析條件
[0079]分離柱使用野村化學(xué)(Nomura Chemical C0.Ltd.)公司制造的DevelosilRPAQUE0US-AR-3(內(nèi)徑2_X長(zhǎng)度100mm、3 μ m)，柱溫箱設(shè)定為30 °C。注入1μ I試樣。流動(dòng)相A使用0.5%甲酸、流動(dòng)相B使用乙腈，利用B液為O % (Omin)-1 % (5min)-10%(15min) -99% (17min) -99% (19min)的流速(λ 2ml/min 的梯度洗脫法將 Y-Glu-X 肽類分離。
[0080]b.三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(QqQMS)的分析條件
[0081]使用Applied B1system公司制造的API3000三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，以正離子模式的MRM模式進(jìn)行測(cè)定。各質(zhì)譜儀的參數(shù)如下所示。
[0082]離子源噴射電壓:5.5kV
[0083]噴霧器氣體壓力:12psi
[0084]氣簾氣體壓力:8psi
[0085]碰撞氣體:8單位
[0086]氮?dú)鉁囟?550°C
[0087]將為了測(cè)定各Y -Glu-X肽類而最優(yōu)化的MRM參數(shù)示于表I。
[0088][表 I]
[0089]

【權(quán)利要求】
1.Y-Glu-X在制備用于檢測(cè)肝炎攜帶者的藥物中的用途，其特征在于，所述檢測(cè)包括以下步驟: 對(duì)從受試者采集的血液中的規(guī)定的Y-Glu-X的含量進(jìn)行測(cè)定的步驟； 將所述規(guī)定的Y-Glu-X的含量與健康人的標(biāo)準(zhǔn)水平進(jìn)行比較的步驟；和 所述規(guī)定的Y-Glu-X的含量為所述標(biāo)準(zhǔn)水平以上時(shí)，確定為規(guī)定的肝炎攜帶者的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述規(guī)定的肝炎攜帶者為肝炎。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述肝炎為乙型肝炎。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述肝炎為丙型肝炎。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述規(guī)定的肝炎攜帶者為無癥狀肝炎攜帶者。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述無癥狀肝炎攜帶者為無癥狀乙型肝炎攜帶者。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述無癥狀肝炎攜帶者為無癥狀丙型肝炎攜帶者。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述規(guī)定的Y-Glu-X為Y-Glu-Gly、Y-Glu-Ser> y -Glu-Val > y -Glu-Thr> y -Glu-牛橫酸、Y-Glu-Leu、γ-Glu-Gln、Y-Glu-Lys> Y -Glu-Glu> y -Glu-His> y -Glu-Phe> Y-Glu-Tyr 中的至少任一種。
9.一種肝炎攜帶者的檢測(cè)裝置，其特征在于，其包括下述單元: 對(duì)從受試者采集的血液中的規(guī)定的Y-Glu-X的含量進(jìn)行測(cè)定的單元； 將所述規(guī)定的Y-Glu-X的含量與健康人的標(biāo)準(zhǔn)水平進(jìn)行比較的單元；和 所述規(guī)定的Y-Glu-X的含量為所述標(biāo)準(zhǔn)水平以上時(shí)，確定為肝炎攜帶者的單元。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的肝炎攜帶者的檢測(cè)裝置，其特征在于，所述規(guī)定的肝炎攜帶者為肝炎。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的肝炎攜帶者的檢測(cè)裝置，其特征在于，所述肝炎為乙型肝炎。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的肝炎攜帶者的檢測(cè)裝置，其特征在于，所述肝炎為丙型肝炎。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的肝炎攜帶者的檢測(cè)裝置，其特征在于，所述規(guī)定的肝炎攜帶者為無癥狀肝炎攜帶者。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的肝炎攜帶者的檢測(cè)裝置，其特征在于，所述無癥狀肝炎攜帶者為無癥狀乙型肝炎攜帶者。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的肝炎攜帶者的檢測(cè)裝置，其特征在于，所述規(guī)定的無癥狀肝炎攜帶者為無癥狀丙型肝炎攜帶者。
16.根據(jù)權(quán)利要求9所述的肝炎攜帶者的檢測(cè)裝置，其特征在于，所述規(guī)定的Y-Glu-X為 Y-Glu-Gly、Y -Glu-Ser> y -Glu-Val > y -Glu-Thr> Y-Glu-牛石黃酸、Y-Glu-Leu、Y-Glu-Gln> Y -Glu-Lys> γ-Glu-Glu、y -Glu-His> y -Glu-Phe> Y-Glu-Tyr 中的至少任一種。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104198718SQ201410334142
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2009年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2008年12月24日
【發(fā)明者】曾我朋義, 杉本昌弘, 末松誠(chéng), 本間雅, 山本武人, 鈴木洋史 申請(qǐng)人:學(xué)校法人慶應(yīng)義塾