肝病的區(qū)分性診斷的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基本上非侵入性的肝病診斷，特別是能夠在早期階段干預(yù)該疾病進(jìn)展的基本上非侵入性的肝病診斷。本發(fā)明還涉及使用血漿生物標(biāo)記物來(lái)將非酒精性脂肪性肝炎(NASH)區(qū)分于非酒精性脂肪肝(NAFL)和非?非酒精性脂肪肝病(NAFLD)以及正常對(duì)照。具體而言，本發(fā)明涉及使用血漿中游離類二十烷酸和其他多不飽和脂肪酸(PUFA)代謝物水平來(lái)將NASH區(qū)分于NAFL和非?NAFLD的正常對(duì)照。
【專利說(shuō)明】
肝病的區(qū)分性診斷
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)數(shù)據(jù)
[0002] 本申請(qǐng)根據(jù)351].3.0§119(6)要求于2014年12月10日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)如.61/ 914，345的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，其全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文中。
[0003] 撥款信息
[0004] 本發(fā)明是在美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院頒給的政府支持K23DK090303和美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研 究院頒給的政府支持GM U54 069338下完成的。政府對(duì)本發(fā)明具有一定權(quán)利。
技術(shù)領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明主要涉及肝病的診斷，具體涉及區(qū)分非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝 炎和正常對(duì)照。
【背景技術(shù)】
[0006] 非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是美國(guó)慢性肝病最常見(jiàn)的病因。它廣義上可被細(xì)分為 非酒精性脂肪肝(NAFL)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，非酒精性脂肪肝(NAFL)被認(rèn)為發(fā)展 為肝硬化的風(fēng)險(xiǎn)最小，而非酒精性脂肪性肝炎(NASH)被認(rèn)為發(fā)展為肝硬化的風(fēng)險(xiǎn)較大。目 前用于區(qū)分患有NAFLD的患者患的是NAFL還是NASH的診斷黃金規(guī)則是肝活組織檢查。然而， 肝活組織檢查是侵入性的過(guò)程，其被取樣變化性、費(fèi)用所限，且可能因病狀和偶發(fā)的死亡而 變得復(fù)雜化。
[0007] 目前還沒(méi)有可以準(zhǔn)確且非侵入性的用于檢測(cè)NASH的生物標(biāo)記物?；旧戏乔秩胄?(例如除了取血之外）的NASH診斷是主要未得到滿足的醫(yī)療需求。
[0008] 以往的研究表明脂毒性在NASH的發(fā)病機(jī)制中起到了重要作用。最近的數(shù)據(jù)表明氧 化的低密度脂蛋白（oxLDL)及其他的脂質(zhì)部分在患NASH的患者中比在患NAFL的患者中高。
[0009] 氧化的多不飽和脂肪酸(PUFA)和它們的代謝物參與各種炎癥性疾病，已經(jīng)報(bào)道自 氧化的亞油酸和亞麻酸在NAFLD中出現(xiàn)。隨著目前基于液相色譜-質(zhì)譜的脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā) 展，已經(jīng)開發(fā)了一種穩(wěn)健的綜合性方法，其針對(duì)如下物質(zhì)進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)分析:數(shù)百上千的脂 肪酸、?；掖及泛脱仔灶惗樗?，包括它們?cè)醋杂诖罅凯h(huán)氧合酶、脂肪氧合酶、細(xì)胞色 素 P450和產(chǎn)生異前列素的非酶促氧化的數(shù)量眾多的代謝物、及其組合。類二十烷酸及源自 于花生四烯酸(AA)和其他PUFA的相關(guān)氧化代謝物得到了特別關(guān)注?，F(xiàn)在超過(guò)150種這樣的 代謝物可以被常規(guī)地量化。
[0010]被診斷為NASH的病人患者發(fā)展成肝硬化的風(fēng)險(xiǎn)增加。目前肝硬化無(wú)藥可救，患者 僅限于接受能夠延緩疾病進(jìn)展、降低最小化肝細(xì)胞損傷和減少并發(fā)癥的治療。NASH的早期 診斷可以阻止疾病進(jìn)展并防止進(jìn)展為肝硬化。然而，目前用于可靠地診斷NASH的唯一方法 是肝活組織檢查，其是侵入性非常大的過(guò)程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明涉及基本上非侵入性的肝病診斷。本發(fā)明還涉及使用血漿生物標(biāo)記物來(lái)將 非酒精性脂肪性肝炎（NASH)區(qū)分于非酒精性脂肪肝（NAFL)和非-非酒精性脂肪肝病 (NAFLD)以及正常對(duì)照。具體而言，本發(fā)明涉及使用血漿中游離類二十烷酸和其他多不飽和 脂肪酸(PUFA)代謝物水平來(lái)區(qū)分NASH與NAFL和非-NAFLD的正常對(duì)照。
[0012]正如在此討論的那樣，本發(fā)明對(duì)血衆(zhòng)類二十烷酸和其他氧化的PUFA的譜分析可以 區(qū)分患NASH的患者、患NAFL的患者和獨(dú)特表型的正常對(duì)照（例如，通過(guò)基于磁共振成像 (MRI)的測(cè)定，具有根據(jù)質(zhì)子密度脂肪含量(MRI-PDFF)的文獻(xiàn)記載的肝臟脂肪含量小于 5%)〇
[0013] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種預(yù)測(cè)或評(píng)估被診斷患有肝病的患者的肝病進(jìn) 展風(fēng)險(xiǎn)的方法。本方法通過(guò)測(cè)定從患者血漿樣品中獲得的脂質(zhì)提取物中的一種或多種游離 類二十烷酸和/或多不飽和脂肪酸(PUFA)代謝物的特性（identity)和數(shù)量來(lái)予以實(shí)施。一 種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物相比于適當(dāng)對(duì)照的升高或降低，如本文進(jìn)一步 描述，表示增加的所述肝病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)，可以據(jù)此相應(yīng)地調(diào)整療法。
[0014] 優(yōu)選地，測(cè)量患者血漿樣品（已從其中提取出含有靶分子的脂質(zhì)）中的一種或多種 游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物。測(cè)定類二十烷酸和/或PUFA代謝物的特性和數(shù)量并與其 在正常對(duì)照中的水平相比較。
[0015] 在該實(shí)施方式的一個(gè)方面中，所述非酒精性肝?。∟AFLD)為非酒精性脂肪肝 (NAFL)。在另一方面，所述NAFLD為非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。在再一方面，所述肝病進(jìn)展 風(fēng)險(xiǎn)是進(jìn)展為肝硬化。
[0016] 再一方面，所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物選自于由PGE2、dhk P⑶2、四降 12-HETE(tetranor 12-HETE)、15-HETE、11，12-diHETrE、14，15-diHETrE、20-C00H AA、9_oxo0DE和12，13Ep0ME組成的組，或?yàn)槠淙我饨M合。在一個(gè)具體方面，所述一種或 多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物為11，12-diHETrE、dhk P⑶2和/或20-C00H AA，或?yàn)?其任意組合。在一個(gè)優(yōu)選方面，所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物為dhk PGD2和20-C00H AA。在另一個(gè)優(yōu)選方面，所述一種游離類二十烷酸為20-C00H AA。
[0017]在一個(gè)另外的方面，所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物用AUR0C測(cè) 量。在再一方面，所述AUR0C約至少0.8。在另一方面，所述AUR0C約至少0.9。在再另一方面， 所述AUR0C約至少0.99。
[0018]在一個(gè)另外的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種在被診斷患有肝病的患者中區(qū)分非酒 精性脂肪性肝炎(NASH)和非酒精性脂肪肝的方法。本方法通過(guò)測(cè)定從患者血漿樣品中獲得 的脂質(zhì)提取物中的一種或多種游離類二十烷酸和/或多不飽和脂肪酸(PUFA)代謝物的特性 和數(shù)量來(lái)予以實(shí)施。
[0019]此外，優(yōu)選測(cè)量患者血漿樣品（已從其中提取了包含靶分子的脂質(zhì)）中的一種或多 種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物，盡管可以對(duì)非脂質(zhì)提取的血漿樣品進(jìn)行測(cè)量。測(cè)定類 二十烷酸和/或PUFA代謝物的特性和數(shù)量并與其在正常對(duì)照中的水平相比較。相比于正常 對(duì)照以及(為區(qū)分)相比于從非酒精性脂肪肝和非-非酒精性脂肪肝病獲得的那些，一種或 多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的升高或降低表明患者患有 NASH。然后可以相應(yīng)地實(shí)施療法。
[0020] 一方面，所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物選自于由PGE2、dhk P⑶2、四降 12-HETE、15-HETE、11，12-diHETrE、14，15-diHETrE、20-C00H AA、9-oxoODE、12， 13EpOME組成的組，或?yàn)槠淙我饨M合。在一個(gè)具體方面，所述一種或多種游離類二十烷酸和/ 或PUFA代謝物為11，12-diHETrE、dhk PGD2和/或20-C00H AA，或?yàn)槠淙我饨M合。在一個(gè)優(yōu)選 方面，所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物為dhk PGD2和20-C00H AA。
[0021]在一個(gè)另外的方面，所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物用AUR0C測(cè) 量。在再一方面，所述AUR0C為約至少0.8。在另一方面，所述AUR0C為約至少0.9。在又另一方 面，所述AUR0C為至少0.99。
[0022]在再一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種將非酒精性脂肪性肝炎(NASH)區(qū)分于非酒 精性脂肪肝和非-非酒精性脂肪肝病的方法，所述方法包括測(cè)量從患者血漿樣品中提取的 脂質(zhì)中的一種或多種游離類二十烷酸和/或多不飽和脂肪酸(PUFA)代謝物的水平。與正常 對(duì)照和(為區(qū)分)在非酒精性脂肪肝和非-非酒精性脂肪肝病所獲得的那些相比較，一種或 多種游離類二十烷酸和/或HJFA代謝物水平的升高表明患者患有NASH。然后可以相應(yīng)地實(shí) 施療法。
[0023] 一方面，所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物選自于由PGE2、dhk P⑶2、四降 12-HETE、15-HETE、11，12-diHETrE、14，15-diHETrE、20-C00H AA、9-oxoODE和 12， 13Ep0ME組成的組，或?yàn)槠淙我饨M合。在一個(gè)具體方面，所述一種或多種游離類二十烷酸和/ 或PUFA代謝物為11，12-diHETrE、dhk PGD2和/或20-C00H AA。在一個(gè)優(yōu)選方面，所述一種或 多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物為dhk PGD2和20-C00H AA。
[0024]在一個(gè)另外的方面，所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物用AUR0C測(cè) 量。在再一方面，所述AUR0C為約至少0.8。在另一方面，所述AUR0C為約至少0.9。
[0025] 有利地，通過(guò)對(duì)肝病的進(jìn)展進(jìn)行非侵入性的準(zhǔn)確測(cè)試，本發(fā)明的方法能夠讓醫(yī)生 有可能在與以前可能的階段相比在該病的更早階段實(shí)施干預(yù)。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1給出了源自于花生四烯酸的代謝物。對(duì)每種代謝物以三個(gè)臨床臂示出了血漿 游離花生四烯酸(AA)及其源自于環(huán)氧合酶(C0X)、5-脂肪氧合酶(5-L0X)、12-和15-脂肪氧 合酶（12/15-L0X)和細(xì)胞色素 P450(CYP)活性的代謝物的定量。結(jié)果顯示為盒須圖（Box-and-Whisker plot)，其中盒的下邊界表示第25百分位，盒中的線表示中值，盒的上邊界表 示第75百分位。所述須表示數(shù)據(jù)范圍的下限和上限。
[0027] 圖2給出了備選底物來(lái)源的代謝物。對(duì)于每種代謝物以三個(gè)臨床臂示出了血漿游 離亞油酸(LA)、α-亞麻酸(ALA)、二十碳三烯酸(ETA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯 酸(DHA)及其源自于5-L0X、12/15-L0X和CYP活性的代謝物的定量。結(jié)果顯示為盒須圖，其中 盒的下邊界表示第25百分位，盒中的線表示中值，盒的上邊界表示第75百分位。所述須表示 數(shù)據(jù)范圍的下限和上限。
[0028] 圖3(表1)給出了研究人群中患者的基礎(chǔ)人口統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨床、生物化學(xué)和組織學(xué)的 特征。
[0029] 圖4(表2)給出了正常對(duì)照、非酒精性脂肪肝病和非酒精性脂肪性肝炎中的類二十 烷酸代謝物。
[0030] 圖5(表3)給出了區(qū)分開NAFL和NASH的血清生物標(biāo)記物的診斷準(zhǔn)確性。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 本發(fā)明涉及肝病診斷。本發(fā)明還涉及使用血漿生物標(biāo)記物來(lái)將非酒精性脂肪性肝 炎(NASH)區(qū)分于非酒精性脂肪肝(NAFL)和無(wú)非-非酒精性脂肪肝的疾病(NAFLD)的正常對(duì) 照。具體而言，本發(fā)明涉及使用血漿中游離類二十烷酸和其他多不飽和脂肪酸(PUFA)代謝 物水平來(lái)將NASH區(qū)分于NAFL和非-NAFLD的正常對(duì)照。
[0032] 在闡述本發(fā)明的組合物和方法之前，應(yīng)該理解本發(fā)明并不限于所闡述的具體的組 合物、方法和實(shí)驗(yàn)條件，因?yàn)檫@樣的組合物、方法和條件可以變化。還應(yīng)該理解此處使用的 術(shù)語(yǔ)僅用于闡述具體的實(shí)施方式而并不意圖進(jìn)行限定，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍僅受所附的權(quán)利 要求書的限制。
[0033] 如本說(shuō)明書和所附的權(quán)利要求書所使用的那樣，單數(shù)形式的"a"、"an"和"所述"包 括復(fù)數(shù)引用，除非上下文明確指出不是這樣。因此，例如，"所述方法"包括在此闡述的一個(gè) 或多個(gè)方法和/或步驟，這對(duì)閱讀了本說(shuō)明書等的本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
[0034] 除非另行定義，在此使用的所有科技用語(yǔ)均與本發(fā)明所屬的技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員 通常所理解的具有相同的含義。盡管在本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試中可以使用與此處所闡述的相 似或相同的任何方法和材料，但還是闡述了優(yōu)選的方法和材料。下面給出的定義用于理解 本發(fā)明而不應(yīng)被理解為代替本領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)這些術(shù)語(yǔ)的理解。
[0035]
[0036] 肝病是一種肝臟損傷或肝臟疾病。有一百多種肝病。最廣泛傳播的肝病如下:肝片 吸蟲病;肝炎;酒精性肝病;脂肪肝病;肝硬化;肝臟;膽汁性;硬化性膽管炎;小葉中心壞死； 布加氏綜合征;遺傳性肝病(涉及體內(nèi)鐵蓄積的血色病、和Wilson?。慌c甲狀腺素運(yùn)載蛋白 (transthyretin)相關(guān)的遺傳性淀粉樣變性;和Gilbert綜合征。
[0037] 正如在此使用的那樣，術(shù)語(yǔ)"肝病"指影響肝臟的任何疾病或紊亂。肝病的例子包 括但不限定于Alagille綜合征；與酒精相關(guān)的肝病;Alpha-Ι抗胰蛋白酶缺乏；自體免疫性 肝炎;肝臟良性腫瘤;膽管閉鎖;肝硬化;半乳糖血癥;Gilbert綜合征;血色??；甲肝；乙肝； 丙肝;肝細(xì)胞癌;肝性腦病;肝囊腫;肝癌;新生兒黃疸;非酒精性脂肪肝病(包括非酒精性脂 肪肝和非酒精性脂肪性肝炎）；原發(fā)性膽汁性肝硬變(PBC);原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC);瑞 氏綜合征；I型糖原貯積病和Wilson病。
[0038] 非酒精性脂肪肝病
[0039] 非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是脂肪肝的一個(gè)病因，其在脂肪蓄積在肝臟中（并非過(guò) 量飲酒所致)時(shí)出現(xiàn)。NAFLD與胰島素抵抗和代謝綜合征有關(guān)，并且可能響應(yīng)于最初開發(fā)用 于其他胰島素抗性狀態(tài)(如2型糖尿病)治療，如體重降低、二甲雙胍(metformin)和噻唑烷 二酮(thiazolidinedionehNAFLD可被細(xì)分為非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和非酒精性脂肪 肝(NAFL) JASH是更嚴(yán)重類型的NAFLD，被認(rèn)為是未知病因肝硬化的主要病因。
[0040] 患NAFLD的患者大多沒(méi)有或少有癥狀?；颊呖赡鼙г蛊凇⒉贿m和不明顯的右上角 腹部不適。有時(shí)也發(fā)生輕度黃疸，盡管這很少見(jiàn)。最通常地，NAFLD在血常規(guī)測(cè)試中通過(guò)異常 肝功能測(cè)試進(jìn)行診斷。NAFLD與胰島素抵抗和代謝綜合征（肥胖、混合型高脂血癥、糖尿病 (11型)和尚血壓)有關(guān)。
[0041] 通常的發(fā)現(xiàn)是肝酶升高和顯示脂肪變性的肝臟超聲。超聲也可用于排除膽結(jié)石問(wèn) 題(膽石?。?。肝活組織檢查(組織檢查)是被廣泛接受為可明確將NASH與其他形式的肝病區(qū) 分開的唯一測(cè)試，可用于評(píng)估炎癥及所產(chǎn)生纖維變性的嚴(yán)重性。
[0042] 非酒精性脂肪肝
[0043]非酒精性脂肪肝(NAFL)是一類NAFLD，是一種肝細(xì)胞中脂肪蓄積的病癥。NAFL進(jìn)展 為肝硬化的風(fēng)險(xiǎn)最小。單純的脂肪肝通常不損傷肝臟，而是一種可通過(guò)肝活組織檢查鑒定 出的病癥。單純的脂肪肝與任何其他的肝臟異常例如疤痕產(chǎn)生或炎癥無(wú)關(guān)。其在體重過(guò)大 或患有糖尿病的患者中是常見(jiàn)的發(fā)現(xiàn)。當(dāng)脂肪達(dá)到肝臟的至少5%時(shí)，患者就具有脂肪肝。 [0044] 非酒精性脂肪性肝炎
[0045]非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是一種通常"沉默"的常見(jiàn)肝病。NASH的主要特點(diǎn)是肝 臟中有脂肪，并伴有發(fā)炎和損傷。患有NASH的患者大多感覺(jué)良好，并沒(méi)有意識(shí)到他們的肝臟 有問(wèn)題。盡管如此，NASH可能是嚴(yán)重的，并可能導(dǎo)致肝硬化，肝硬化的肝臟被永久性損傷，產(chǎn) 生疤痕，不能再正常工作。
[0046] 通常首先懷疑在包括在血常規(guī)測(cè)試項(xiàng)目中的肝臟測(cè)試中發(fā)現(xiàn)有例如丙氨酸轉(zhuǎn)氨 酶(ALT)或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)升高的人患有NASH。當(dāng)進(jìn)一步的評(píng)估并沒(méi)有給出明顯理由 是肝病而當(dāng)肝臟的X-射線或成像研究表明有脂肪時(shí)，就懷疑患有NASH。提供對(duì)NASH的確切 診斷并將其與單純的脂肪肝區(qū)分開的唯一方式就是肝活組織檢查。當(dāng)從活組織檢查觀察到 有脂肪并伴隨有發(fā)炎和肝臟細(xì)胞損傷時(shí)，就診斷為NASH。如果組織有脂肪而沒(méi)有發(fā)炎和損 傷，就診斷為NAFL或NAFLD。目前，沒(méi)有血液測(cè)試或掃描能夠可靠地提供該信息。
[0047] 類二十烷酸
[0048]類二十烷酸是由20碳脂肪酸氧化產(chǎn)生的信號(hào)分子，所述20碳脂肪酸例如花生四烯 酸或其他的多不飽和脂肪酸(PUFA)。它們對(duì)許多機(jī)體系統(tǒng)施加復(fù)雜的控制，主要在身體活 動(dòng)的過(guò)程中或之后的生長(zhǎng)方面、攝入毒性物質(zhì)和病原體后的炎癥或免疫方面，并且在中樞 神經(jīng)系統(tǒng)中作為信使。類二十烷酸包括前列腺素、環(huán)前列腺素、凝血囉烷、白三烯和其它的 由氧通過(guò)酶促或非酶促加成到PUFA上而形成的代謝物。
[0049] 類二十燒酸源自于omega-3( ω-3)或omega-6 ( ω-6)脂肪酸。一般而言，ω-6類二 十烷酸是促炎性的，而ω -3促炎性較弱，甚或可能是抗炎性的。這些脂肪在人的飲食中的含 量和平衡將影響人體的類二十烷酸控制的功能，對(duì)心血管疾病、甘油三脂、血壓和關(guān)節(jié)炎產(chǎn) 生影響?？寡仔运幬锢绨⑺酒チ趾推渌鸑SAID通過(guò)下調(diào)類二十烷酸的合成來(lái)發(fā)揮作用。
[0050] 類二十烷酸有很多個(gè)亞家族，包括前列腺素如環(huán)前列腺素、凝血囉烷、脂氧素和白 三烯。每一種還有2或3個(gè)另外的系列，其源自于ω-3或CO-6EFA。這些系列的不同活性基本 解釋了 ω -3和ω -6脂肪酸的健康效應(yīng)。
[0051] 多不飽和脂肪酸
[0052] 多不飽和脂肪酸(PUFA)是其骨架中含有多于一個(gè)雙鍵的脂肪酸。這個(gè)類別包括許 多重要的化合物，例如必需脂肪酸。多不飽和脂肪酸可根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)劃分為不同組:亞甲 基間隔的多烯、綴合的脂肪酸和其他PUFAWUFA包括除含20個(gè)碳(二十碳）的脂肪酸以外的 其他脂肪酸，例如，含18個(gè)碳的亞油酸和亞麻酸、含22個(gè)碳的二十二碳五烯酸(DPA)和二十 二碳六烯酸（DHA)，還包括花生四烯酸和其他20碳脂肪酸的代謝物，例如二十碳三烯酸 (ΕΤΑ)和二十碳五烯酸(ΕΡΑ)，這些代謝物源自于環(huán)氧合酶、脂肪氧合酶、細(xì)胞色素 Ρ450和非 酶促氧化。作用于花生四烯酸和其他PUFA以產(chǎn)生PUFA的酶的例子包括已知的⑶X、5-L0X、 12/15-L0X和CYP。PUFA還可進(jìn)行非酶促氧化。
[0053] 游離類二十烷酸和PUFA代謝物的例子包括但不限于PGE2(前列腺素 E2)、dhk P⑶2 (13，14-二氫-15-酮前列腺素 D2)、四降12-HETE(2,3,4,5-四降12(R)-HETE)、15-HETE(15-羥基Y-5Z，8Z，11Z，13E-二十碳四烯酸）、11，12-diHETrE(11，12-二羥基-二十碳三烯酸）、 14，15-乜?jī)?cè)1'也（14，15-二羥基-5,8，11-二十碳三烯酸）、20-〇)0!144(20-羧基-花生四烯 酸）、9-oxoODE (9-氧代-十八碳二烯酸）、12，13Ep0ME (12 (13)-異白細(xì)胞毒素）、TxB2 (凝血β 烷Β2)、12-HHTrE (12-羥基-十七碳三烯酸）、11-ΗΕΤΕ (11-羥基-5Ζ，8Ζ，12Ε，14Ζ-二十碳四烯 酸）、5-HETE (5-羥基-6E-8Z，11Z，14Z-二十碳四烯酸）、5，6-diHETrE (5，6-二羥基-8Z，11Z， 14Z-二十碳三烯酸）、14，15-diHETrE(14，15-二羥基-5，8，11 -二十碳三烯酸）、13-H0DE(13-羥基-十八碳二烯酸）、9-H0DE(9-羥基-十八碳二烯酸）、9，lOEpOMe、9，lOdiHOME(來(lái)自于可 溶性的環(huán)氧化物水解酶對(duì)（± ) 12，13-EpOME的開環(huán)的二醇）、12，13diH0ME、9-H0TrE、15-HETrE(15S-羥基-8Z，11Z，13E-二十碳三烯酸）、12-HEPE( 12-羥基-5，8，10，14，17-二十碳五 烯酸）、14HDoHE(14-羥基-二十二碳六烯酸）、16HDoHE( 16-羥基-二十二碳六烯酸）和19， 20DiHDPA( 19，20-二羥基-4Z，7Z，10Z，13Z，16Z二十二碳五烯酸）、血漿游離的亞油酸（LA)、 α-亞麻酸(ALA)、二十碳三烯酸(ETA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)及它們 源自于5-L0X、12/15-L0X和CYP的代謝物。
[0054]本發(fā)明還提供一種預(yù)測(cè)或評(píng)估被診斷患有肝病的患者的肝病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的方法，所 述方法包括測(cè)量該患者血漿中一種或多種游離類二十烷酸和/或多不飽和脂肪酸(PUFA)代 謝物的水平，其中，游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物升高或者由于轉(zhuǎn)化(可以包括氧化)成 不同的類二十烷酸或PUFA而導(dǎo)致其中一種或多種特定物質(zhì)降低表示所述肝病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)提 高。一個(gè)方面，所述非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是非酒精性脂肪肝(NAFL)。在另一個(gè)方面，所 述NAFLD是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
[0055]在一個(gè)特別有用的方面，本文證明分析血漿類二十烷酸可以區(qū)分NAFL和NASH。正 如下面的實(shí)施例中所闡述的那樣，若干類二十烷酸部分被鑒定出在正常與NAFL與NASH之間 明顯不同，與NAFL、正常對(duì)照相比，11，12-diHETrE、dkP⑶2和20-C00N AA在NASH患者中以劑 量依賴的方式大幅升高。該數(shù)據(jù)證明了 11，12_diHETrE、dkPGD2和20-C00N AA是用于非侵入 性診斷NASH的主要類二十烷酸候選生物標(biāo)記物。
[0056]這些結(jié)果與以前報(bào)道的結(jié)果的不同之處在于其僅測(cè)量以游離形式存在且未經(jīng)Κ0Η 處理的代謝物。盡管游離類二十烷酸的水平比酯化為脂質(zhì)的類二十烷酸低得多，但本方法 捕捉到多得多的代謝物，并允許了廣得多的分析策略。其還避免了某些類二十烷酸和PUFA 由于堿處理或酸處理而遭到破壞，而堿處理或酸處理是分析酯化為脂質(zhì)的類二十烷酸中的 必需步驟。在NAFLD中，正常的脂代謝被打亂，導(dǎo)致升高水平的游離脂肪酸和甘油三酯合成。 已經(jīng)表明游離脂肪酸引起肝毒性，并且可以經(jīng)由許多機(jī)制刺激NAFL進(jìn)展為NASH。它們可以 具有直接的細(xì)胞毒性，刺激肝細(xì)胞中產(chǎn)生炎性途徑。這些脂肪酸也充當(dāng)炎性類二十烷酸的 前體。與該結(jié)果相一致，NAFL和NASH中許多游離PUFA的血漿水平一直比健康對(duì)照高（圖1和 2)〇
[0057]然而，在NAFL和NASH之間沒(méi)有區(qū)別，表明血漿游離脂肪酸是區(qū)分各階段NAFLD差的 標(biāo)記物。與此相對(duì)，它們轉(zhuǎn)化成類二十烷酸可能構(gòu)成疾病進(jìn)展中的關(guān)鍵性機(jī)制，分析類二十 烷酸水平而不是脂肪酸水平可能是區(qū)分NAFL和NASH的有用的臨床工具。
[0058] 所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物可以選自于由PGE2、dhk PGD2、 四降12-HETE、15-HETE、ll，12-diHETrE、14，15-diHETrE、20-C00HAA、9-oxo0DE和12， 13Ep0ME組成的組，或?yàn)槠淙我饨M合。在一個(gè)具體方面，所述一種或多種游離類二十烷酸和/ 或PUFA代謝物為11，12-diHETrE、dhk PGD2和/或20-C00H AA，或?yàn)槠淙我饨M合。在一個(gè)優(yōu)選 方面，所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物為dhk PGD2和20-C00H AA。在另一 個(gè)方面，所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物為20-C00H AA。
[0059] 本方法通過(guò)測(cè)量患者血漿樣品中一種或多種游離類二十烷酸和/或多不飽和脂肪 酸(PUFA)代謝物的水平予以實(shí)施。正如在此處所使用的那樣，術(shù)語(yǔ)"樣品"是指來(lái)自于患者 的任何生物樣品。例子包括但不限定于唾液、毛發(fā)、皮膚、組織、痰液、血液、血漿、血清、玻璃 體、腦脊液、尿、精液和細(xì)胞。
[0060] 正如進(jìn)一步在實(shí)施例中詳細(xì)闡述的那樣，脂質(zhì)提取于血漿樣品。首先測(cè)定提取的 脂質(zhì)中的類二十烷酸和/或PUFA代謝物的特性和數(shù)量，然后與適當(dāng)?shù)膶?duì)照相比較。所述測(cè)定 可以通過(guò)任何適當(dāng)?shù)闹|(zhì)分析技術(shù)來(lái)進(jìn)行，優(yōu)選高通量的脂質(zhì)分析技術(shù)，例如光譜分析(例 如Cheng，et al·，Lipid ,46 G): 95-103(2011)中記載的 sulfo-phospho-vani 11 in(SPV)色 譜分析方法）。適于測(cè)量和定量脂質(zhì)含量的其他分析方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括但 不限于ELISA、NMR、UV-Vis或氣相-液相色譜、HPLC、UPLC和/或MS或RIA方法、基于酶的發(fā)色 方法。提取脂質(zhì)也可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的各種方法進(jìn)行，包括Bligh and Dyer, Can J Biochem Physiol. ,37,911(1959)中記載的用于液體樣品的常規(guī)方法。
[0061] 對(duì)于肝病進(jìn)展的一般性測(cè)定，獲得的值可與正常對(duì)照相比較。用于在被診斷患有 非酒精性肝?。∟AFLD)的患者中區(qū)分非酒精性脂肪性肝炎（NASH)與非酒精性脂肪肝 (NAFL)，例如，用于測(cè)定NASH或肝硬化，和/或用于區(qū)分NASH和NAFL。對(duì)照可以包括正常對(duì) 照。相對(duì)于對(duì)照，游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物升高表示肝病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)提高和/或?qū)?NASH的期望區(qū)分，據(jù)此可以相應(yīng)地實(shí)施療法。在某些情況下，如果正常的代謝物被氧化或轉(zhuǎn) 化為另一種代謝物，則一種或多種類二十烷酸和/或PUFA可能降低。
[0062] 游離類二十烷酸和PUFA代謝物的水平表示為AUR0C(Area under Receiver Operating Characteristic Curve，受試者工作特征曲線下面積）。通過(guò)用穩(wěn)定的同位素稀 釋法測(cè)量游離類二十烷酸和PUFA代謝物的水平來(lái)測(cè)定AUR0C。簡(jiǎn)而言之，將相同量的氘化內(nèi) 標(biāo)加到每個(gè)樣品中和用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的所有基準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)中。通過(guò)確定內(nèi)源性代謝物與匹配 的氘化內(nèi)標(biāo)之間的比率來(lái)計(jì)算類二十烷酸和PUFA代謝物的水平。通過(guò)線性回歸，將比率轉(zhuǎn) 換為絕對(duì)量。使用包括卡方檢驗(yàn)、t-檢驗(yàn)和AUR0C在內(nèi)的統(tǒng)計(jì)分析來(lái)評(píng)估各類二十烷酸代謝 物的診斷測(cè)試性能和區(qū)分NAFL與NASH的能力。
[0063] 肝病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)提高用AUR0C值測(cè)定，所述AUR0C值約至少0.8，約至少0.9，約至少 0.95，約至少0.96，約至少0.97，約至少0.98，約至少0.99或1.0。
[0064] 本發(fā)明的各方面將在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步闡釋。但本發(fā)明的范圍不受這些實(shí)施 例的限定，而是由所附的權(quán)利要求書定義。
[0065] 實(shí)施例1 [0066]隊(duì)列人口統(tǒng)計(jì)學(xué)
[0067] 本研究中包括19名患NAFLD的患者（10個(gè)NAFL病例和9個(gè)NASH病例）和10名非-NAFLD的正常對(duì)照。詳細(xì)的基礎(chǔ)特征記載在表1中，包括人口統(tǒng)計(jì)學(xué)、身高體重指數(shù)、生化測(cè) 試、脂質(zhì)譜分析、針對(duì)對(duì)照的MR I -PDFF和針對(duì)患NAFLD的患者的肝活組織檢查數(shù)據(jù)。非_ NAFLD對(duì)照更為年輕，BMI較低，血清ALT、AST、GGT、葡萄糖和胰島素水平均較低，如所期望的 那樣。除了血漿甘油三酯在患NASH的患者中稍高以外，例行的肝臟相關(guān)的代謝測(cè)試不能顯 著區(qū)分NAFL和NASH(表1)。與患NAFL的患者相比，患NASH的患者具有更嚴(yán)重的肝臟組織學(xué)， 且具有更大程度的脂肪變性、氣球樣變性、小葉炎癥和纖維變性。
[0068] 實(shí)施例2
[0069] PUFA和代謝物脂質(zhì)組學(xué)譜分析
[0070]目前，還沒(méi)有以充分的特異性將NASH與其他脂肪肝狀態(tài)區(qū)分開的非侵入性生物標(biāo) 記物。肝活組織檢查仍是用于可靠鑒別NAFL和NASH的基準(zhǔn)，但該過(guò)程是侵入性的，并帶有一 定的風(fēng)險(xiǎn)。因此，臨床界非常需要開發(fā)出非侵入性的能夠準(zhǔn)確表征和分級(jí)NAFLD的方案，因 為這為治療可選項(xiàng)和預(yù)后提供有價(jià)值的信息。炎癥和氧化應(yīng)激促進(jìn)疾病從具有相對(duì)良性結(jié) 局的脂肪變性進(jìn)展為有肝硬化和肝細(xì)胞癌風(fēng)險(xiǎn)的NASH。在此，液相色譜和質(zhì)譜用于分析和 定量循環(huán)中的生物活性脂質(zhì)和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，所述生物活性脂質(zhì)和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物是 NASH患者肝臟發(fā)炎的特征。
[0071]在清楚表征的疑似患有NAFL或NASH并根據(jù)其肝活組織檢查評(píng)分進(jìn)行分級(jí)的患者 隊(duì)列中建立了完整的類二十烷酸譜，并估計(jì)了源自于花生四烯酸(20:4ω6)和相關(guān)的多不 飽和脂肪酸(PUFA)的游離類二十烷酸的血漿水平(表1)，所述多不飽和脂肪酸(PUFA)包括 亞油酸（18:2 ω6)、α-亞麻酸（18:3 ω 3)、二高-γ-亞麻酸(20:3 ω 6)、二十碳五烯酸(20:5 ω 3)和二十二碳六烯酸(22:6 ω 3)。最初的類二十烷酸譜由我們的分析平臺(tái)可以可靠測(cè)量的 158個(gè)單獨(dú)的代謝物組成。其中，26個(gè)類二十烷酸以可測(cè)水平存在于對(duì)照、NAFL或NASH血漿 樣品中（表2)。這些介質(zhì)(mediator)通過(guò)復(fù)雜的生物合成機(jī)制和多個(gè)修飾和降解途徑產(chǎn)生 (27)。如圖1和2所示，源自于所有3個(gè)主要酶促途徑的類二十烷酸以不同水平存在于對(duì)照、 NAFL和NASH樣品中，所述3個(gè)主要酶促途徑是環(huán)氧合酶途徑(C0X-1和C0X-2)、脂肪氧合酶途 徑（5-L0X、12-L0X和15-L0X)和細(xì)胞色素 P450 (CYP)途徑。源自于C0X的凝血囉烷B2 (TXB2)和 12-羥基-庚三烯酸（12HHTrE)--人血小板中的凝血曝烷合成酶產(chǎn)生的主要AA代謝物之 一--在對(duì)照樣品中檢測(cè)到低水平，但在NAFL和NASH樣品中均明顯更高；然而，在NAFL和 NASH之間沒(méi)有看到顯著性差異。與此相對(duì)，前列腺素 E2(PGE2)僅在NASH樣品中升高，而在對(duì) 照和NAFL之間沒(méi)有看到差異（圖1)。在任何樣品中都沒(méi)有測(cè)到前列腺素 D2(PGD2)，但降解產(chǎn) 物13，14-二氫-15-酮?602((11^?602)在嫩3!1中明顯高于在祖?1^值〈0.0011)或?qū)φ眨ǎ恐怠?0.0002)中（圖1)。
[0072] 源自于L0X的代謝物在NAFLD中也升高。值得注意的是，盡管5-L0X、12/15L0X途徑 的源自于AA的產(chǎn)物似乎在NAFL中最高（圖1)，但源自于包括亞油酸、α-亞麻酸、二高-γ -亞 麻酸、ΕΡΑ和DHA在內(nèi)的相關(guān)PUFAS的代謝物通常在NASH中較高（圖2)。相似地，相對(duì)于健康對(duì) 照，CPY途徑的源自于AA的代謝物在NASH中顯著升高，但在NAFL中卻沒(méi)發(fā)生變化（圖1和2)。 特別是，相對(duì)于NAFL或?qū)φ眨?1，12-二羥基-二十碳三烯酸（11，12-diHETrE)和14，15-二羥 基-二十碳三烯酸（14,15-diHETrE)在NASH中顯著升高。這些代謝物是由水溶性的環(huán)氧化物 水解酶（sEH)作用于環(huán)氧二十碳三烯酸產(chǎn)生的，所述環(huán)氧二十碳三烯酸是CYP環(huán)氧化酶 (epoxygenase)途徑作用于初始底物AA產(chǎn)生的主要產(chǎn)物。許多生物作用均歸因于環(huán)氧二十 碳三烯酸，包括心肌保護(hù)性血管舒張、白細(xì)胞抗迀移性和抗炎作用。通過(guò)sEH將環(huán)氧化物轉(zhuǎn) 化為其對(duì)應(yīng)的二醇降低了其功能水平，因此降低了相關(guān)的健康作用。相似地，據(jù)報(bào)道，20-羥 基二十碳四烯酸（20-HETE)具有重要的血管活性，所述20-羥基二十碳四烯酸是通過(guò)CYP羥 化酶途徑合成的AA代謝物。在血漿中沒(méi)有測(cè)到20-HETE，但在NASH樣品中發(fā)現(xiàn)了 20-羧基花 生四烯酸（20-C00N AA)持續(xù)升高，但當(dāng)比較NAFL和NASH時(shí)，它在這一具體樣品系列中并沒(méi) 有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(表2) 20-HETE轉(zhuǎn)化為20-C00N AA是由CYP酶催化的，這導(dǎo)致其生物活 性降低。
[0073] 實(shí)施例3
[0074]鑒定作為檢測(cè)NASH的診斷工具的一組類二十烷酸
[0075]基于表2,發(fā)現(xiàn)9種生物標(biāo)記物在評(píng)價(jià)NAFLD中是有意義的。用AUR0C評(píng)價(jià)其各自的 診斷測(cè)試性能，并記載在表3中。作為用于將NAFL與NASH區(qū)分開的單一生物標(biāo)記物的最好候 選者是11，12s diHETrE，其AUR0C是1。此外，發(fā)現(xiàn)包括dkPGD2和20-C00N AA在內(nèi)的一個(gè)系列 的AUR0C為1。
[0076] 實(shí)施例4 [0077] 方法
[0078] 研究設(shè)計(jì)和參與者本研究是源自于前瞻性巢式病例對(duì)照(nested case-control) 研究的橫向分析法，該研究中包括3組患有經(jīng)活組織檢查確診為NAFLD (包括NASH和NAFL)的 獨(dú)特表型的患者和正常的非-NAFLD對(duì)照。所有的參與者來(lái)自于UCSD NAFLD研究診所并在 2011年1月至2012年11月之間看過(guò)?。?8-20)。所有的參與者均提供了書面知情同意書并經(jīng) 歷了詳細(xì)的標(biāo)準(zhǔn)化臨床研究采訪，包括藥物史、飲酒和飲酒量化史(使用Audi t-skinner問(wèn) 卷調(diào)查）、體檢、身體測(cè)量、人體測(cè)量、空腹生化測(cè)試，并作了其他肝病病因的詳細(xì)排除(請(qǐng)參 見(jiàn)下面的選入和排除標(biāo)準(zhǔn)）。在臨床研究采訪的早晨收集空腹血漿樣品并貯存在_80°C的冷 凍機(jī)中，該冷凍機(jī)裝在UCSD NAFLD轉(zhuǎn)化研究單元內(nèi)。
[0079] 隊(duì)列描述本研究中包括的所有NAFLD病例均患有經(jīng)肝活組織檢查確診的NAFLD?；?組織檢查由并不知曉臨床數(shù)據(jù)、脂質(zhì)組學(xué)和成像數(shù)據(jù)的有經(jīng)驗(yàn)的肝病醫(yī)生來(lái)評(píng)分。NASH CRN組織學(xué)評(píng)分系統(tǒng)用于對(duì)活組織檢查進(jìn)行評(píng)分。記錄所有患者的NAFLD活性評(píng)分(NAS)以 及纖維變性評(píng)分。NAS評(píng)分在0-8的范圍，是脂肪變性(0-3)、小葉炎癥(0-3)和肝細(xì)胞氣球樣 變性(0-2)的程度的總和。肝臟纖維變性在0到4的范圍，其中0是沒(méi)有纖維變性，4是肝硬化。
[0080] NASH定義下述患者被劃分為患有NASH:患有經(jīng)活組織檢查確診的NAFLD，具有顯著 的3區(qū)（zone-3)大泡狀脂肪變性和小葉炎癥以及存在典型的氣球樣變性。
[0081 ] NAFLD的選入和排除標(biāo)準(zhǔn)選入標(biāo)準(zhǔn)包括:在知情同意過(guò)程中年齡至少18歲、有能力 并愿意提供書面的知情同意書、最小的或沒(méi)有與NAFLD相一致的飲酒史(見(jiàn)排除標(biāo)準(zhǔn))和在 肝活組織檢查90天內(nèi)收集血漿。排除標(biāo)準(zhǔn)包括臨床或組織學(xué)的酒精性肝病證據(jù):訪談之前 的2年內(nèi)的常規(guī)和過(guò)量飲酒被定義為男性每周飲酒超過(guò)14個(gè)飲酒單位或女性每周飲酒超過(guò) 7個(gè)飲酒單位。大約10g酒精相當(dāng)于一個(gè)"飲酒"單位。一個(gè)單位相當(dāng)于1盎司蒸餾酒、一罐12 盎司的啤酒或一瓶4盎司的葡萄酒，肝臟脂肪變性的次要病因包括以前的手術(shù)、減肥手術(shù)、 全腸道外營(yíng)養(yǎng)、短腸綜合征、產(chǎn)生脂肪的藥物治療、特征在于血清中存在HBsAg的慢性乙肝 證據(jù)、特征在于血清中存在抗HCV或HCV RNA的慢性丙肝證據(jù)、其他肝病病因證據(jù)，例如 alpha-1-抗胰蛋白酶缺乏、Wilson病、糖原貯積病、β脂蛋白異常癥、已知的表型血色病、自 體免疫肝病、或藥物引起的肝臟損傷、或研究者認(rèn)為可能干擾研究的伴隨的嚴(yán)重的潛在的 全身疾病。
[0082] 正常對(duì)照的定義本研究的新穎之處在于包含了獨(dú)特且清楚表征的非-NAFLD正常 對(duì)照組。通過(guò)采用MRI-PDFF的準(zhǔn)確肝臟脂肪定量所得到的小于5%的脂肪含量，將參與者劃 分為正常的非-NAFLD(18,20)。肝活組織檢查對(duì)正常個(gè)體而言是不道德的。其他的非侵入性 測(cè)量例如超聲和計(jì)算機(jī)斷層成像不準(zhǔn)確，且缺少靈敏度，尤其在肝脂肪含量在1-10%之間 時(shí)。因此，MRI-PDFF應(yīng)用在本研究中，用于不存在肝臟脂肪變性的準(zhǔn)確診斷(Noureddin et al.H印atologyUOlShSSiigSOhMRI-PDFF準(zhǔn)確性高、靈敏、重現(xiàn)性好且精確。
[0083] 正常（非-NAFLD)對(duì)照隊(duì)列的選入和排除標(biāo)準(zhǔn)健康（非-NAFLD)對(duì)照組的選入標(biāo)準(zhǔn) 包括：（1)年齡大于18歲；（2)肝MRI-PDFF〈5% ;和(3)無(wú)已知的肝病史。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：（1)年 齡小于18歲；（2)明顯的全身疾??；（3)不能進(jìn)行MRI;和(4)可能患有肝病的證據(jù)，包括任何 以前的肝活組織檢查、陽(yáng)性乙肝表面抗原、丙肝病毒RNA、或自體免疫血清、alpha-1抗胰蛋 白酶缺乏、血色病遺傳檢測(cè)、或低的血漿銅藍(lán)蛋白。
[0084]脂質(zhì)提取在分別針對(duì)病例和對(duì)照的肝活組織檢查和MRI-TOFF 90天內(nèi)獲得用于脂 質(zhì)組學(xué)譜分析的血漿樣品。所有的血漿樣品均儲(chǔ)存在-80°C，一旦解凍，立即用于如前所述 的游離脂肪酸和類二十烷酸分離。簡(jiǎn)而言之，在50μ1血漿中摻入26種氘化內(nèi)標(biāo)(分別購(gòu)于 Cayman化學(xué)公司，Ann Arbor，ΜΙ)的混合物，并用10 %甲醇使體積達(dá)到lml。接著，通過(guò)在 Strata-X柱(Phenomenex，Torrance，CA)上的固相提取來(lái)純化樣品，使用由以下步驟組成的 活化過(guò)程：用3ml 100%甲醇再用3ml水連續(xù)洗滌。接著，類二十烷酸用lml 100%甲醇洗脫， 將洗脫物真空干燥并溶解在由60/40/0.02水/乙腈/乙酸= 60/40/0.02(v/v/v)組成的50μ1 緩沖液Α中，立即用于分析，分析過(guò)程如下:對(duì)于游離脂肪酸分析，在50μ1血漿中摻入氘化脂 肪酸標(biāo)準(zhǔn)品，并通過(guò)采用甲醇和異辛烷的選擇性提取來(lái)分離游離脂肪酸。如（Dumlao et al. (2011) ,1811:724)所述那樣，對(duì)提取的脂肪酸進(jìn)行衍生化并用氣相色譜和質(zhì)譜進(jìn)行分 析。
[0085] 反相液相色譜和質(zhì)譜通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)來(lái)分析和定量血漿中 的類二十烷酸。簡(jiǎn)而言之，用反相色譜分離類二十烷酸，反相色譜使用1.7uM 2.1x100mm BEH Shield色譜柱(Waters，Milford,ΜΑ)和Acquity UPLC系統(tǒng)(Waters，Milford,ΜΑ)。色譜 柱用緩沖液A平衡，5μ1樣品用自動(dòng)取樣器注入。用以100%緩沖液A起始的步進(jìn)梯度洗脫樣 品1分鐘，接著用50%緩沖液B(由50%乙腈、50異丙醇和0.02%乙酸組成)洗脫3分鐘，接下 來(lái)用100%緩沖液B洗脫1分鐘。液相色譜與lonDrive Turbo V離子源相連，用三級(jí)四極AB SCIEX 6500QTrap質(zhì)譜儀(AB SCIEX，F(xiàn)ramingham，MA)進(jìn)行質(zhì)譜分析。使用陰離子模式和使 用最豐富和最特定的前體離子/產(chǎn)物離子轉(zhuǎn)換的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)的電噴射離子化測(cè)量類 二十烷酸，以建立能夠檢測(cè)158個(gè)分析物和26個(gè)內(nèi)標(biāo)的獲得方法。離子噴霧電壓在溫度550 °C下設(shè)為-4500V。以氮?dú)庾鳛榕鲎矚怏w實(shí)現(xiàn)了類二十烷酸前體離子的碰撞活化，且對(duì)各個(gè) 代謝物優(yōu)化了去簇電壓、入口電壓和碰撞能。通過(guò)將類二十烷酸的MRM信號(hào)和色譜保留時(shí)間 與純的標(biāo)準(zhǔn)品匹配來(lái)鑒定所述類二十烷酸。
[0086] 脂質(zhì)定量類二十烷酸和游離脂肪酸通過(guò)穩(wěn)定的同位素稀釋法進(jìn)行定量。簡(jiǎn)而言 之，將相同量的氘化內(nèi)標(biāo)加到每個(gè)樣品中和用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的所有基準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)中。為了計(jì) 算樣品中類二十烷酸和游離脂肪酸的量，計(jì)算內(nèi)源性代謝物與匹配的氘化內(nèi)標(biāo)之間的峰面 積的比率。通過(guò)對(duì)相同條件下獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性回歸分析，將比率轉(zhuǎn)換為絕對(duì)量。
[0087]統(tǒng)計(jì)分析卡方(x2)檢驗(yàn)用于類別變量之間的比較，t_檢驗(yàn)用于連續(xù)變量之間的比 較。我們檢測(cè)了正常對(duì)照、經(jīng)活組織檢查確診為輕度NAFL的患者和經(jīng)活組織檢查確診為 NASH的患者之間的血漿類二十烷酸譜的差別。最后，我們檢測(cè)了產(chǎn)生顯著性差異的9個(gè)生物 標(biāo)記物作為將NAFL與NASH區(qū)分開的生物標(biāo)記物的診斷準(zhǔn)確性。認(rèn)為雙尾檢驗(yàn)的p值0.05有 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用343統(tǒng)計(jì)軟件包版本9.4(〇3^，％，343 1]1(3.)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種預(yù)測(cè)或評(píng)估被診斷患有肝病的患者的肝病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的基本上非侵入性的方法， 包括測(cè)量所述患者血漿樣品中一種或多種游離類二十烷酸和/或多不飽和脂肪酸(PUFA)代 謝物的水平，其中游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物相比于正常對(duì)照的升高或降低表示增 加的所述肝病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，包括：（a)從所述血漿樣品中提取脂質(zhì)；（b)鑒定提取的 脂質(zhì)中的所述類二十烷酸和/或PUFA代謝物；（c)對(duì)提取的脂質(zhì)中的類二十烷酸和/或PUFA 代謝物的水平進(jìn)行定量;和(d)將所測(cè)定的水平與正常對(duì)照中的水平相比較，其中游離類二 十烷酸和/或PUFA代謝物相比于所述對(duì)照的升高或降低表示增加的所述肝病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肝病為非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述NAFLD為非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中獲得的結(jié)果被傳送給醫(yī)生。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中該醫(yī)生確認(rèn)所述結(jié)果指示肝病進(jìn)展，并相應(yīng)地對(duì)所 述患者實(shí)施療法。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物 選自于由PGE2、dhk P⑶2、四降 12-HETE、15-HETE、11，12-diHETrE、14，15-diHETrE、20-C00H AA、9-oxoODE、12，13EpOME組成的組，或?yàn)槠淙我饨M合。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物 為11，12-乜?jī)?cè)1'也、(11^?602和/或20-〇)0!144，或?yàn)槠淙我饨M合。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物 為dhk PGD2和20-C00H AA。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝 物為20-C00H AA。11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝 物用AUROC測(cè)量。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述AUROC為約至少0.8。13. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述AUROC為約至少0.9。14. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述AUROC為約至少0.99。15. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肝病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)是進(jìn)展為肝硬化。16. -種在被診斷患有肝病的患者中將非酒精性脂肪性肝炎(NASH)區(qū)分于非酒精性脂 肪肝和非-非酒精性脂肪肝病的基本上非侵入性的方法，包括測(cè)量所述患者血漿中一種或 多種游離類二十烷酸和/或多不飽和脂肪酸(PUFA)代謝物的水平，其中所述一種或多種游 離類二十烷酸和/或PUFA代謝物水平的升高或降低表示所述患者患有NASH。17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，包括：（a)從血漿樣品中提取脂質(zhì)；（b)鑒定提取的脂 質(zhì)中的所述類二十烷酸和/或PUFA代謝物；（c)對(duì)提取的脂質(zhì)中的類二十烷酸和/或PUFA代 謝物的水平進(jìn)行定量;和(d)將所測(cè)定的水平與被診斷患有肝病的患者的非酒精性脂肪肝 和非-非酒精性脂肪肝病中獲得的水平相比較并任選地進(jìn)一步與正常對(duì)照相比較，其中，某 些游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物相比于對(duì)照的升高或降低表示所述患者患有NASH。18. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝 物選自于由 PGE2、dhk PGD2、四降 12-HETE、15-HETE、11，12-diHETrE、14，15-diHETrE、20- COOH AA、9-oxoODE、12，13EpOME組成的組，或?yàn)槠淙我饨M合。19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝 物為11，12-乜?jī)?cè)1'也、(11^?602和/或20-〇)0!144，或?yàn)槠淙我饨M合。20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝 物為dhk PGD2和20-C00H AA。21. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝 物為20-C00H AA。22. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝 物用AUR0C測(cè)量。23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述AUR0C為約至少0.8。24. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述AUR0C為約至少0.9。25. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述AUR0C為約至少0.99。
【文檔編號(hào)】G01N33/92GK105980861SQ201480067418
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2014年12月9日
【發(fā)明人】R·洛姆巴, O·昆亨伯杰, A·阿曼多, E·A·丹尼斯
【申請(qǐng)人】加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)