治療肝病癥的方法
【專利摘要】式(I)化合物或其代謝物、或者式(I)化合物或其代謝物的酯、或者其各自的藥學(xué)上可接受的鹽用于抑制肝脂肪變性、小葉炎癥、肝鼓脹和肝結(jié)疤，其中，m、n、X1和X2如本文所定義。
【專利說明】
治療肝病癥的方法
[0001] 相關(guān)專利申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2014年1月10日提交的美國申請No. 14/152,924的權(quán)益，其繼而為2012 年12月5日提交的美國申請No. 13/706,161的部分繼續(xù)申請，其內(nèi)容通過引用方式整體并入 本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本申請設(shè)及通過施用苯氧基烷基簇酸、諸如MN-001和MN-002治療非酒精性脂肪性 肝病（NAFLD)和/或非酒精性脂肪性肝炎（NASH)、導(dǎo)致它們的一種或多種的疾患 (condition)或者由它們的一種或多種產(chǎn)生的疾患、和/或其各自的不利影響的方法。
【背景技術(shù)】
[0004] 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指與酒精消耗無關(guān)的脂肪累積在肝中。脂肪可由 于肥胖癥、糖尿病或其它疾患而累積。在少量的人中，NAFLD發(fā)展為肝臟炎癥、結(jié)瘤且最終肝 衰竭。所述疾病的運種嚴(yán)重形式有時被稱為非酒精性脂肪性肝炎(NASH)dNAFLD和NASH及導(dǎo) 致它們的一種或多種的疾患或由它們的一種或多種產(chǎn)生的疾患是一種影響每個年齡段人 的全球日益嚴(yán)重的問題。NAFLD和NA甜是當(dāng)前發(fā)展最快的肝移植的指示。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 在一方面，本發(fā)明提供一種治療患有非酒精性脂肪性肝病(NA化D)或非酒精性脂 肪性肝炎(NASH)的患者的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的式（I)化合物：
[0006]
[0007]或其代謝物、或者式（I)化合物或其代謝物的醋、或者其各自的藥學(xué)上可接受的 鹽，其中m是2至5的整數(shù)且η是3至8的整數(shù)，χ?和X2各自獨立地表示硫原子、氧原子、亞硫酷基 (-s(o)-)基團或橫酷基(-s(o)2-)基團，條件是χ?和X2不同時為氧原子。
[000引在另一方面，本發(fā)明提供一種減輕患有NAFLD或ΝΑ甜的患者的肝臟炎癥的方法，其 包括向有需要的患者施用有效量的式(I)化合物或其醋、或者其各自的藥學(xué)上可接受的鹽， 其中所述式(I)化合物如上所定義。
[0009]在另一方面，本發(fā)明提供一種抑制患有脂肪變性、小葉炎癥、肝鼓脹和肝結(jié)瘤中的 一種或多種的患者的脂肪變性、小葉炎癥、肝鼓脹和肝結(jié)瘤中的一種或多種的方法，其包括 向有需要的患者施用有效量的式(I)化合物或其醋、或者其各自的藥學(xué)上可接受的鹽，其中 所述式(I)化合物如上所定義。如本文所用，"脂肪變性"（也被稱為脂肪變、脂肪變性(fatty degeneration,adipose degeneration))是描述在細(xì)胞、優(yōu)選肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)異常滯留的過 程。在另一方面，本發(fā)明提供一種減少和/或抑制有需要的患者的肝中的徑脯氨酸形成的方 法，其包括向有需要的患者施用有效量的式(I)化合物或其醋、或者其各自的藥學(xué)上可接受 的鹽，其中式（I)化合物如上所定義。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述脂肪變性、小葉炎癥、 肝鼓脹、肝結(jié)瘤或肝-徑脯氨酸累積與過度飲酒不相關(guān);換句話說，它們本質(zhì)上基本上是非 酒精性的。
[0010] 在一個優(yōu)選的實施方案中，式(I)化合物是式(IA)化合物(或MN-001):
[0011]
[0012] 在另一個優(yōu)選的實施方案中，式(I)和式(IA)化合物的代謝物是式(IB)化合物(或 MN-002)：
[0013]
[0014] 在一個實施方案中，所述患者患有NA化D。在另一個實施方案中，所述患者患有 NA甜。
【附圖說明】
[0015] 圖1圖形化地示出在治療和未治療的小鼠中的脂肪變性評分。
[0016] 圖2圖形化地示出在治療和未治療的小鼠中的小葉炎癥評分。
[0017] 圖3圖形化地示出在治療和未治療的小鼠中的肝細(xì)胞鼓脹評分。
[0018] 圖4圖形化地示出在治療和未治療的小鼠中的纖維化面積的百分比。
[0019] 圖5圖形化地示出在治療和未治療的小鼠中的炎癥面積。
[0020] 圖6圖形化地示出在治療和未治療的小鼠中的肝徑脯氨酸含量。
【具體實施方式】
[0021] 定義
[0022] ^文和隨附權(quán)利要求中所用，除非上下文清楚地指出，否則單數(shù)形式"一 "（a、 an)和"所述"包括復(fù)數(shù)的指代物。
[0023] 。施用"（administering)或"施用"（administration)藥物給患者（和該短語的語 法等同物)包括直接施用(包括自施用)和間接施用(包括開出藥物的行為)兩者。例如，如本 文所用，指導(dǎo)患者自施用藥物和/或向患者提供藥物處方的醫(yī)師是施用藥物給患者。
[0024] "虹'當(dāng)置于基團前時是指此基團中碳原子的數(shù)目為X。
[0025] "烷基"是指具有1-12個碳原子的一價非環(huán)狀控基基團。烷基的非限制性實例包括 甲基、乙基、丙基、異丙基、下基、異下基、叔下基、戊基、己基等。
[0026] "芳基"是指具有多達(dá)10個碳原子的一價芳族控基基團。芳基的非限制性實例包括 苯基和糞基。
[0027] "雜芳基"是指在芳環(huán)內(nèi)具有1至10個碳原子和1至4個選自由氧、氮、硫組成的組的 雜原子的芳族基團，其中所述雜芳基的氮和/或硫原子被任選地氧化(如N-氧化物、-S(0)- 或-s(o)2-)。此類雜芳基基團可具有單環(huán)（如化晚基或巧喃基）或多個稠環(huán)（如嗎I噪嗦基或 苯并嚷吩基），其中所述稠環(huán)可為或可不為芳族的和/或可含有或可不含有雜原子，條件是 連接點通過芳族雜芳基基團的原子。雜芳基的非限制性實例包括化晚基、化咯基、嗎I噪基、 苯硫基和巧喃基。
[0028] "環(huán)烷基"是指具有3-12個碳原子的一價非-芳族環(huán)狀控基基團。環(huán)烷基的非限制 性實例包括環(huán)丙基、環(huán)下基、環(huán)戊基、環(huán)己基等。
[0029] "雜環(huán)基"是指在環(huán)內(nèi)具有1至10個碳原子和1至4個選自由氧、氮、硫組成的組的雜 原子的一價非-芳族環(huán)狀基團，其中所述雜芳基的氮和/或硫原子被任選地氧化(如N-氧化 物、-s(o)-或-S(0)2-)。此類雜芳基基團可具有單環(huán)(如贓晚基或四氨巧喃基)或多個稠環(huán)， 其中所述稠環(huán)可為或可不為芳族的和/或可含有或可不含有雜原子，條件是連接點通過非- 芳族雜環(huán)基基團的原子。雜環(huán)基的非限制性實例包括化咯烷基、贓晚基、贓嗦基等。
[0030] 。氨基"是指-N出。
[0031] "烷基氨基"是指-NH化，其中Rb是任選地用1-3個芳基、雜芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)基基 團取代的C廣C6烷基。
[00創(chuàng)"二烷基氨基"是指-N(Rb)2,其中化如上所定義。
[0033] "包括/包含"應(yīng)意指所述方法和組合物包括列舉的要素，但不排除其它要素。"基 本上由……組成"當(dāng)用于定義所述方法和組合物時，應(yīng)意指為了說明目的排除對組合具有 任何重要意義的其它要素。因此，基本上由本文所定義的要素組成的組合物將不排除來自 分離和純化方法的微量污染物及藥學(xué)上可接受的載體、諸如憐酸鹽緩沖鹽水、防腐劑等。 "由……組成"應(yīng)意指排除多于微量的其它成分要素及用于施用本發(fā)明的組合物的重要方 法步驟或者產(chǎn)生組合物或獲得預(yù)期結(jié)果的方法步驟。由運些過渡術(shù)語和短語中的每一個定 義的實施方案在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0034] 本文所用的化合物的"有效量"是當(dāng)向NA化D或NASH患者施用時將具有預(yù)期療效 (如在患者的醫(yī)學(xué)病況的一種或多種表現(xiàn)的減輕、改善、緩解或消除）的量。完全療效不一定 通過施用一劑(或劑量)發(fā)生，并且僅可在施用連續(xù)劑量后發(fā)生。因此，有效量可W-次或多 次施用被施用。
[0035] "非酒精性脂肪性肝炎"或NASH是一種常見的肝病，其類似于酒精性肝病，但是在 幾乎不飲用或不飲用酒精的人中發(fā)生。NASH的主要特征是肝中的脂肪，連同炎癥和損傷。 NA細(xì)可導(dǎo)致肝硬化，其中肝臟永久性受損且結(jié)瘤且不再能夠正常工作。NA細(xì)影響了 2%至 5%的美國人口。當(dāng)前，對NASH不存在特異性的療法。另有10%至20%的美國人在其肝臟中 具有脂肪，但沒有明顯的炎癥和損傷，一種被稱為"非酒精性脂肪性肝病"（NA化D)的疾患。 盡管在肝中具有脂肪不常見，但其本身可能幾乎不引起傷害或永久性損傷。如果基于血液 測試結(jié)果或肝掃描疑似具有脂肪，則該問題被稱為NAFLD。如果肝活檢在運種情況下進行， 則其將顯示一些人具有NA甜而其它人具有NAFLD。
[0036] NASH通常首先疑似存在于在包含在常規(guī)血液測試板內(nèi)的肝測試(諸如丙氨酸氨基 轉(zhuǎn)移酶(ALT)或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST))中發(fā)現(xiàn)具有升高的人中。當(dāng)進一步評估顯示沒 有顯著的肝病原因（諸如藥物、病毒性肝炎或過度使用酒精)時且當(dāng)肝的X射線或成像研究 顯示脂肪時，疑似NA甜。NASH被診斷且通過肝活檢與NAFLD分開。對于肝活檢，將針插入經(jīng)過 皮膚w去除一小片肝。當(dāng)用顯微鏡檢查組織顯示脂肪連同炎癥和對肝細(xì)胞的損傷時，診斷 出NA甜。如果組織顯示出脂肪而無炎癥和損傷，則診斷出NA化D。從活檢得到的一則重要信 息是瘤痕組織是否已在肝中形成。
[0037] NASH可緩慢惡化，從而引起結(jié)瘤或纖維化出現(xiàn)和累積在肝中。因為纖維化惡化，形 成肝硬化;所述肝變得嚴(yán)重結(jié)瘤、硬化且不能正常起作用。一旦嚴(yán)重的結(jié)瘤或肝硬化存在， 幾乎沒有治療可終止進展。具有肝硬化的人經(jīng)歷體液滯流、肌肉萎縮、腸道出血和肝衰竭。 肝移植是肝衰竭晚期肝硬化的唯一治療，且移植在具有NASH的人中越來越多地進行。例如， NASH在美國是排在丙型肝炎和酒精性肝病后的肝硬化主要原因之一。
[0038] "藥學(xué)上可接受的"是指無毒且適于施用給患者、包括人患者。
[0039] "藥學(xué)上可接受的鹽"是指無毒且適于施用給患者的鹽。非限制性實例包括堿金屬 鹽、堿±金屬鹽和各種伯錠鹽、仲錠鹽和叔錠鹽。當(dāng)式(I)化合物的醋包括陽離子部分時，例 如當(dāng)所述醋包括氨基酸醋時，其鹽包括各種簇酸鹽、橫酸鹽和礦物酸鹽（miner acid salts)。鹽的某些非限制性實例包括鋼鹽、鐘鹽和巧鹽。
[0040] "保護基團"是指眾所周知的官能團，當(dāng)結(jié)合至官能團時其使得所得的受保護的官 能團對于待在化合物的其它部分上進行的反應(yīng)W及相應(yīng)的反應(yīng)條件是惰性的，且該官能團 可在去保護條件下反應(yīng)再生原始官能度。保護基團被選擇成與分子的剩余部分相容。"簇酸 保護基團"在苯氧基烷基簇酸的合成期間保護苯氧基烷基簇酸的簇酸官能度。簇酸保護基 團的非限制性實例包括芐基、對甲氧基芐基、對硝基芐基、締丙基、二苯甲基和立苯甲基。簇 酸保護基團的另外實例見于標(biāo)準(zhǔn)參考著作中，諸如Greene和Wilts protective Groups in Organic Synthesis，第2版，1991 John Wiley&Sons和McOmie Protective Groups in (Organic Chemist巧，1975,Plenum Press。用于保護和去保護本文公開的簇酸的方法可見 于本領(lǐng)域中，且特別見于Greene和Wilts，同上及其引用的文獻(xiàn)。
[0041] "治療"醫(yī)學(xué)疾患或患者是指采取步驟W獲得有益的或所需的結(jié)果，包括臨床結(jié) 果。為了本發(fā)明的各方面和實施方案的目的，有益或所需的臨床結(jié)果包括但不限于減少、減 輕或改善NA化D和/或NASH的一種或多種表現(xiàn)或不利影響，改善一種或多種臨床結(jié)果，減小 疾病程度，延緩或減緩疾病進展，改善、緩解或穩(wěn)定疾病狀態(tài)，及本文所述的其它有益結(jié)果。 [00創(chuàng)優(yōu)選的實施方案
[0043] 在一方面，本發(fā)明提供一種治療患有非酒精性脂肪性肝病(NA化D)或非酒精性脂 肪性肝炎(NASH)的患者的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的式（I)化合物：
[0044]
[0045] 或其代謝物、或者式（I)化合物或其代謝物的醋、或者其各自的藥學(xué)上可接受的 鹽，其中m是2至5的整數(shù)且η是3至8的整數(shù)，χ?和X2各自獨立地表示硫原子、氧原子、亞硫酷基 基團或橫酷基基團，條件是χ?和X2不同時為氧原子。
[0046] 在另一方面，本發(fā)明提供一種減輕患有ΝΑ化D或ΝΑ甜的患者的肝臟炎癥的方法，其 包括向有需要的患者施用有效量的式(I)化合物或其代謝物、或者式(I)化合物或其代謝物 的醋、或者其各自的藥學(xué)上可接受的鹽，其中式(I)化合物如上所定義。
[0047] 如本文所用，"其代謝物"是指顯示與式（I)化合物基本上類似的治療活性的代謝 物。此類代謝物的非限制性實例包括化合物，其中式(I)化合物的附接至含有-0-(CH2)nC0抽 部分的苯基的-C0C出基團被代謝為1-徑乙基(-CH(OH)Me)基團。
[0048] 含有此類1-徑乙基基團的代謝物在1-徑乙基基團的1-位上含有不對稱中屯、。相應(yīng) 的對映異構(gòu)體及其混合物(包括外消旋混合物)包括在如本文使用的式(I)化合物的代謝物 的范圍內(nèi)。
[0049] 如本文所用，"其醋"是指酪徑基基團的醋和/或式（I)化合物中顯示的簇酸的醋， 及式（I)化合物的代謝物的1-徑乙基(脂肪族徑基基團)基團的醋。酪徑基基團和/或脂肪族 徑基基團的醋可包括但不限于作為相應(yīng)的酸的簇酸Ra-CO抽，其中Ra是C1-C6烷基、芳基、雜芳 基、C3-C12環(huán)烷基或C2-C8雜環(huán)基，其中烷基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)基任選地被1-4個 C1-C3烷基、芳基、0)2H、氨基、烷基氨基或二烷基氨基基團取代。也考慮了其它酸，諸如單憐 酸、二憐酸或Ξ憐酸。簇酸醋可包括但不限于作為相應(yīng)的醇的式Ra-OH化合物，其中Ra如上所 定義。在一個實施方案中，僅式（I)中的簇酸被醋化。在另一個實施方案中，僅式（I)中的酪 徑基基團被醋化。在另一個實施方案中，Ra是C1-C4烷基。如對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見 的是，此類醋用作前藥，其在體內(nèi)被水解W釋放式(I)化合物或其鹽。
[0050] 在一個優(yōu)選的實施方案中，式(I)化合物是式(IA)化合物：
[0化1 ]
[0052]在另一個優(yōu)選的實施方案中，式(I)和式(IA)化合物的代謝物是式(IB)化合物： [0化3]
[0054] 在一個實施方案中，患者患有NAFLD。在另一個實施方案中，患者患有NA甜。在另一 個實施方案中，所述化合物經(jīng)口施用。在另一個實施方案中，所述化合物作為片劑或膠囊施 用。在另一個實施方案中，式（IA)化合物W基本上不含其它多晶型的多晶型A存在。在另一 個實施方案中，所述化合物作為液體劑型施用。在另一個實施方案中，所述化合物W分成一 份、兩份或Ξ份的lOOmg/天至4000mg/天的量施用。
[0055] 不受理論限制，本文所用的化合物部分由于其抗炎活性而可有效治療NAFLD和/或 NA甜。據(jù)信各種受體位點可被本文所用的化合物阻斷。幾乎沒有（如果有的話）已知的炎性 疾病的抑制劑在單個分子中體現(xiàn)出所有W下活性位點:抑制1)白Ξ締合成、2)白Ξ締 D-4受 體、3)白Ξ締 E-4受體、4)cAMP PDE III、5)cAMP PDE IV、6)合成血栓素 A-2、7)嗜酸性細(xì)胞 遷移和8)20淋己細(xì)胞遷移。在所謂的"炎性級聯(lián)反應(yīng)"中相互作用的各種各樣的細(xì)胞中，W 上機制W不同程度且W不同特異性地參與并協(xié)作W產(chǎn)生裂變樣結(jié)果。通過阻斷各種各樣的 作用位點，考慮本文所用的化合物可有效治療NAFLD和/或NASH。
[0056] 本文所用的化合物的功效可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法，如在如下文描 述的STAM小鼠模型中的方法或通過調(diào)整"Protection from liver fibrosis by a peroxisome proliferator-activated receptor5agonist"Keiko Iwaisako等，PNAS2012， 109(21化1369-E1376所述的程序測試。
[0057] 魚垂
[005引 ??)化合物的合成和某些生物活性描述于美國專利No.4,985,585中，其通過引 用整體并入本文。例如，式(IA)化合物通過使式(II)的苯酪與式(III)化合物反應(yīng)W提供式 (1C)化合物來制備：
[0062] 酸性保護基團或R基團的非限制性實例包括C1-C6烷基、芐基、二苯甲基和Ξ苯甲 基，其中芐基、二苯甲基或Ξ苯甲基基團任選地被1-6個C廣C6烷基、面素基團和/或打-C6燒 氧基基團取代。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是可使用不同于式（III)中的漠基團的離 去基團。此類其它離去基團的非限制性實例包括氯或甲苯橫酸根。
[0063] 式(1C)的受保護的簇酸的去保護提供了式(IA)化合物。如基于該公開內(nèi)容明顯的 是，式（1C)化合物在一些實施方案中可用于根據(jù)本發(fā)明。去保護方法的非限制性實例包括 在出和催化劑(諸如Pd/C或Pt/C)下堿性水解和氨解。
[0064] 所述反應(yīng)在惰性有機溶劑中進行，例如且不限于丙酬、甲基乙基酬、二乙基酬或二 甲基甲酯胺。親核置換反應(yīng)可在低于室溫的溫度（高達(dá)溶劑回流溫度）下在無機基質(zhì)（諸如 碳酸鐘或碳酸鋼）的存在下和任選地在艦化鐘的存在下進行。反應(yīng)進行一段足W提供如通 過眾所周知的方法(諸如薄層色譜法和iH-NMR)確定的大量產(chǎn)物的時間。本文所用的其它化 合物通過本文所述的W下程序和適當(dāng)?shù)厝〈?、?或通過W下技術(shù)人員眾所周知的方 法后制備。還參見美國專利齡.5,290,812(通過引用^其整體并入本文）。
[0065] 將式（IA)化合物在控制的條件下再結(jié)晶W提供基本上純的斜方晶系多晶型物，被 稱為A型晶體(如90%或更多、優(yōu)選至少95%的A型）。多晶型A和用于產(chǎn)生其的方法描述于美 國專利No. 7，060，854和No. 7，064，146中；其通過引用整體并入本文。式（I)化合物的所有多 晶型是活性的，但多晶型A是優(yōu)選的。在某些條件下，該多晶型物的溶解度和生物利用率優(yōu) 于其它多晶型物，并因此A型可提供改善的固體制劑。
[0066] A型晶體可通過例如在25°C至40°C下將式（ΙΑ)化合物溶解于5重量份至10重量份 的乙醇中W得到黃色至橘色溶液而獲得。向乙醇溶液裝入1份至10份水，并在20°C至25°C下 攬動約15分鐘至60分鐘，然后在5°C至10°C下再攬動1小時至4小時、優(yōu)選2.0小時至3.0小時 的時間段，從而產(chǎn)生灰白色混懸液。向該混懸液添加5份至15份水，并將混合物在5°C至10°C 下再攬動1小時至4小時、優(yōu)選1.5小時至2.0小時。將固態(tài)的白色至灰白色的產(chǎn)物通過真空 過濾分離，將濾餅用水洗涂并在25°C至40°C下真空干燥12小時至24小時。
[0067] 對于W對映異構(gòu)體形式存在的本文所用的化合物、諸如式（I)化合物的某些代謝 物(例如式IB化合物），所述兩種對映異構(gòu)體可經(jīng)光學(xué)解析。此類解析例如且不限于通過與 相應(yīng)的簇酸化合物形成堿(諸如(s)-(-)-i-(i-糞基）乙胺）的非對映異構(gòu)體鹽或者通過使 用手性柱色譜法分離對映異構(gòu)體進行。此類化合物的中間體(所述中間體也W對映異構(gòu)體 形式存在)可類似地解析。
[006引施用和配制
[0069] 本文所用的化合物可經(jīng)口或通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)和皮下注射或透皮方法施用。有效 的劑量水平可廣泛變化，如約lOOmg/天至4000mg/天。在一個實施方案中，每日劑量范圍是 W-份、兩份或Ξ份給予的250mg至2000mg。在一個實施方案中，每日劑量范圍是W-份、兩 份或Ξ份給予的lOOmg至500mg，如1 OOmg、200mg、300mg、400mg或500mg。在一個實施方案中， 每日劑量范圍是W-份、兩份或Ξ份給予的250mg至2000mg，如250mg、500mg、750mg、 1000mg、1250mg、1500mg、1750mg或2000mg。在一個實施方案中，每日劑量范圍是W-份、兩 份或Ξ份給予的lOOOmg至4000mg，諸如1000mg、2000mg、3000mg或4000mg。在另一個實施方 案中，所述劑量是lOOOmg，每天兩次。在另外的實施方案中，適合的劑量包括lOOOmg qd、 lOOOmg bid和750mg tid。
[0070] 實際量將取決于正治療的患者的情形。如本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到的，改變活性物 質(zhì)作用的許多因素將由治療醫(yī)師考慮，諸如患者的年齡、體重、性別、飲食和情況、施用時 間、施用速率和途徑。對于給定的一組條件的最佳劑量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常見劑量 測定測試確定。
[0071] 本文所用的化合物可配制為任何藥學(xué)上可接受的形式，包括液體、粉劑、霜劑、乳 劑、丸劑、含片、栓劑、混懸劑、溶液等。含有本文所用的化合物的治療性組合物通常將與一 種或多種藥學(xué)上可接受的成分一起根據(jù)已知的且確定的實踐配制。通常，片劑單獨地使用 諸如改性淀粉的載體或與10重量％的簇甲基纖維素(Avicel)組合的改性淀粉形成。在片劑 形成過程中，將制劑在1000磅至3000磅壓力下壓制。所述片劑優(yōu)選展現(xiàn)出約1.化p/cm2至 8. Okp/cm2、優(yōu)選5. Okp/cm2至7.化p/cm2的平均硬度。崩解時間從約30秒到約15分鐘或20分 鐘變化。
[0072] 用于經(jīng)口使用的制劑可提供為硬明膠膠囊，其中將本文所用的治療活性化合物與 惰性稀釋劑(諸如碳酸巧、憐酸巧或高嶺±)混合，或者提供為軟明膠膠囊，其中所述化合物 與油性介質(zhì)、如液體石蠟或橄攬油混合。適合的載體包括碳酸儀、硬脂酸儀、滑石、糖、乳糖、 果膠、糊精、淀粉、明膠、黃著膠、甲基纖維素、簇甲基纖維素鋼、低烙點蠟、可可脂等。
[0073] 本文所用的化合物可配制為與藥學(xué)上可接受的賦形劑滲混的水性混懸液，所述賦 形劑諸如助懸劑，如簇甲基纖維素鋼、甲基纖維素、徑丙基甲基纖維素、藻酸鋼、聚乙締化咯 燒酬、黃著膠和阿拉伯樹膠;分散劑或濕潤劑，諸如天然存在的憐脂(如卵憐脂）、或堿性氧 化物與脂肪酸的縮合產(chǎn)物(如聚氧乙締硬脂酸醋)或氧化乙締與長鏈脂族醇的縮合產(chǎn)物(如 十屯亞乙基氧基嫁蠟醇）或氧化乙締與衍生自脂肪酸和己糖醇的偏醋的縮合產(chǎn)物（如聚氧 乙締山梨糖醇單油酸醋)或氧化乙締與衍生自脂肪酸和己糖醇酢的偏醋的縮合產(chǎn)物(如聚 氧乙締脫水山梨糖醇單油酸醋）。此類水性混懸液還可含有一種或多種防腐劑，如苯甲酸乙 醋或苯甲酸正丙基對徑基醋、一種或多種著色劑、一種或多種調(diào)味劑及一種或多種甜味劑 (諸如甘油、山梨糖醇、薦糖、糖精或環(huán)壞酸鋼或環(huán)壞酸巧）。
[0074] 適合的制劑還包括持續(xù)釋放的劑型，諸如美國專利No. 4，788，055; No. 4，816，264; 齡.4,828,836;齡.4,834,965;齡.4,8：34,985;齡.4,996,047;齡.5,071，646;和齡.5，133， 974中描述的那些，其內(nèi)容通過引用整體并入本文。
[0075] 其它適用于經(jīng)口施用的形式包括液體形式制劑(包括乳劑、糖漿劑、馳劑、水溶液） 或意在使用之前不久轉(zhuǎn)化為液體形式制劑的固體形式制劑。乳劑可制備為溶液(例如水性 丙二醇溶液），或可含有乳化劑(例如諸如卵憐脂、失水山梨糖醇單油酸醋或阿拉伯樹膠）。 水溶液可通過將活性組分溶解于水中并添加適合的著色劑、調(diào)味劑、穩(wěn)定劑和增稠劑來制 備。除了活性組分之外，固體形式制劑可含有著色劑、調(diào)味劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、人工甜味劑 和天然甜味劑、分散劑、增稠劑、增溶劑等。
[0076] 本文所用的化合物可配制用于腸胃外施用（如通過注射，例如推注注射或連續(xù)輸 注），并且可W單位劑量形式存在于添加了防腐劑的安飯、預(yù)裝注射器、小體積輸注或多劑 量容器中。所述組合物可采取運樣的形式，如于油性或水性媒介物中的混懸劑、溶液或乳 劑，例如為于水性聚乙二醇中的溶液。油性或非水性載體、稀釋劑、溶劑或媒介物的實例包 括丙二醇、聚乙二醇、植物油（如橄攬油）和可注射的有機醋（如油酸乙醋），且可含有配制 劑，諸如防腐劑、潤濕劑、乳化劑或助懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。替選地，活性成分可呈粉末 形式，通過無菌固體的無菌分離或通過從在使用前用適合的媒介物(如無菌無熱原水)復(fù)溶 的溶液冷凍干燥獲得。
[0077] 本文所用的化合物可配制用于作為軟膏劑、霜劑或洗劑或者作為經(jīng)皮貼劑局部施 用至表皮。軟膏劑和霜劑可例如用水性或油性基質(zhì)在添加適合的增稠劑和/或膠凝劑的情 況下配制。洗劑可用水性基質(zhì)或油性基質(zhì)配制，且通常還將含有一種或多種乳化劑、穩(wěn)定 劑、分散劑、助懸劑、增稠劑或著色劑。適用于在口腔中局部施用的制劑包括包含調(diào)味基質(zhì) (通常是薦糖和阿拉伯樹膠或黃著膠）中的活性劑的錠劑;包含惰性基質(zhì)(諸如明膠和甘油 或者薦糖和阿拉伯樹膠）中的活性成分的軟錠劑;及包含適合的液體載體中的活性成分的 嗽口水。
[0078] 本文所用的化合物可配制作為栓劑施用。在此類制劑中，低烙點蠟(諸如脂肪酸甘 油醋或可可脂的混合物)首先烙化，并且活性組分例如通過攬拌勻質(zhì)地分散。然后將烙融勻 質(zhì)混合物傾倒至常規(guī)尺寸的模具中、使其冷卻且固化。
[0079] 本文所用的化合物可配制用于經(jīng)陰道施用。除了活性成分之外含有此類載體的陰 道栓、棉塞、霜劑、凝膠劑、糊劑、泡沫劑或噴霧劑是本領(lǐng)域已知適當(dāng)?shù)摹?br>[0080] 本文所用的化合物可配制用于經(jīng)鼻施用。將溶液或混懸液通過常見方法例如用滴 管、移液管或噴霧直接施加至鼻腔。所述制劑可W單一或多劑量形式提供。所述患者可經(jīng)由 滴管或移液管施用適當(dāng)?shù)念A(yù)定體積的溶液或混懸液。噴霧可例如通過計量霧化噴霧累的方 式施用。
[0081] 本文所用的化合物可配制用于氣溶膠施用，特別是至呼吸道且包括鼻內(nèi)施用。所 述化合物將通常具有例如大約5微米或更小的小粒徑。此類粒徑可通過本領(lǐng)域已知的方法 例如通過微粉化獲得。活性成分W具有適合的推進劑、諸如氯氣控(CFC)(例如二氯二氣甲 燒、Ξ氯氣甲燒或二氯四氣甲燒）、二氧化碳或其它適合的氣體的加壓包提供。所述氣溶膠 通常還可含有諸如卵憐脂的表面活性劑。藥物劑量可通過量閥控制。替選地，所述活性成分 可W干粉形式，例如于適合的粉末基質(zhì)(諸如乳糖、淀粉、淀粉衍生物(諸如徑丙基甲基纖維 素和聚乙締基化咯燒））中所述化合物的粉末混合物提供。粉末載體將在鼻腔中形成凝膠。 所述粉末組合物可W單位劑量形式存在于例如明膠或泡罩包裝的膠囊或藥筒中，所述粉末 可從所述明膠或泡罩包裝的膠囊或藥筒通過吸入器的方式施用。
[0082] 當(dāng)需要時，制劑可用適用于活性成分持續(xù)釋放或控制釋放施用的腸溶包衣制備。 可用于本發(fā)明目的的常見類型的控制釋放制劑包含惰性忍部(諸如糖球）、用內(nèi)部含有藥物 的第二層包衣的第一層及控制藥物從內(nèi)層釋放的外膜或第Ξ層。
[0083] 所述忍部優(yōu)選具有水溶性或水溶脹性材料，并且可為通常用作忍部的此類材料或 制備為珠?；蛐∏虻娜魏纹渌帉W(xué)上可接受的水溶性或水溶脹性材料。所述忍部可為材料 (諸如薦糖/淀粉)的球(Suger S地eres NF)、薦糖晶體或通常由賦形劑(諸如微晶纖維素和 乳糖)組成的擠出和干燥的球。
[0084] 第一層中基本上水不溶性材料通常是％I不溶性"或％I部分不溶性"成膜聚合物 (分散或溶解于溶劑中）。作為例子可提及乙基纖維素、醋酸纖維素、醋酸下酸纖維素、聚甲 基丙締酸醋，諸如丙締酸乙醋/甲基丙締酸甲醋共聚物化iKlragit肥-30-D)和錠基甲基丙 締酸醋共聚物A型和B型化iKlragit RL30D和RS30D)、及彈性聚娃酬類。通常，增塑劑與所述 聚合物一起使用。示例性增塑劑包括:二下基癸二酸醋、丙二醇、Ξ乙基巧樣酸醋、Ξ下基巧 樣酸醋、藍(lán)麻油、乙酷化單甘油醋、Ξ乙基巧樣酸乙酷醋、Ξ下基巧樣酸乙酷醋、鄰苯二甲酸 二乙醋、鄰苯二甲酸二下醋、Ξ醋精、分饋的挪子油（中鏈甘油Ξ醋）。
[0085] 含有活性成分的第二層可由有聚合物或沒有聚合物作為粘合劑的活性成分（藥 物)組成。所述粘合劑當(dāng)使用時通常是親水的但可是水溶性或水不溶性的。待用于含有活性 藥物的第二層中的示例性聚合物是親水聚合物，諸如聚乙締化咯燒酬、聚燒撐二醇，諸如聚 乙二醇、明膠、聚乙締醇、淀粉及其衍生物、纖維素衍生物(諸如徑丙基甲基纖維素化PMC)、 徑丙基纖維素、簇甲基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、徑乙基纖維素、簇乙基纖維素、簇 甲基徑乙基纖維素）、丙締酸聚合物、聚甲基丙締酸醋或任何其它藥學(xué)上可接受的聚合物。 第二層中藥物與親水聚合物的比率通常在1:100至100:1 (w/w)的范圍內(nèi)。
[0086] 適用于第Ξ層或膜中用于控制藥物釋放的聚合物可選自任選地與增塑劑(諸如上 文提及的那些)組合的水不溶性聚合物或具有抑-依賴性溶解度的聚合物，諸如，例如乙基 纖維素、徑丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸醋、醋酸纖維素鄰苯二甲酸醋、醋酸纖維素偏苯Ξ酸 醋、聚甲基丙締酸醋或其混合物。
[0087] 任選地，控制釋放層包含除了 W上的聚合物之外的具有不同溶解度特性的另一種 或多種物質(zhì)，W調(diào)節(jié)控制釋放層的滲透性并從而調(diào)節(jié)其釋放速率。可連同例如乙基纖維素 用作改性劑的示例性聚合物包括:HPMC、徑乙基纖維素、徑丙基纖維素、甲基纖維素、簇甲基 纖維素、聚乙二醇、聚乙締化咯燒酬(PVP)、聚乙締醇、具有抑-依賴性溶解度的聚合物(諸如 醋酸纖維素鄰苯二甲酸醋或錠基甲基丙締酸醋共聚物和甲基丙締酸共聚物)或其混合物。 如果需要，則諸如薦糖、乳糖和醫(yī)藥級表面活性劑的添加劑也可包含在控制釋放層中。
[0088] 本文還提供了制劑的單位劑型。在此類形式中，所述制劑被細(xì)分為含有適當(dāng)量的 活性組分(例如且不限于式(I)化合物或其醋、或者其各自的鹽)的單位劑量。所述單位劑型 可為包裝制劑，所述包裝含有分散量的制劑，諸如于小瓶或安飯中的包裝的片劑、膠囊和粉 劑。此外，單位劑型可為膠囊、片劑、扁囊劑或錠劑本身，或者其可為呈包裝形式的適當(dāng)數(shù)量 的任何膠囊、片劑、扁囊劑或錠劑。
[0089] 其它適合的藥物載體及其制劑描述于Remington:The Science and Practice of Pharma巧 1995，E.W.Ma;rtin編輯，Mack 化Wishing Company,第19版，Easton,化中。
[0090] 實施例
[0091] 實施例1:非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的治療
[0092] 250名患有非酒精性脂肪性肝炎的成人被隨機分配W接受MN-001或MN-002(其各 自的每日劑量為500mg)或者安慰劑持續(xù)長達(dá)6個月。主要結(jié)果是按照利用脂肪變性、小葉炎 癥、肝細(xì)胞鼓脹和/或纖維化的標(biāo)準(zhǔn)化評分的組合(composite)評估的非酒精性脂肪性肝炎 的組織學(xué)特性改善。根據(jù)本領(lǐng)技術(shù)人員眾所周知的方法分析該結(jié)果。
[00W] 實施例2:非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的治療
[0094]對通過超聲化S)診斷且通過肝活檢(40名患者)確認(rèn)的50名NAFLD患者進行隨機雙 盲安慰劑-控制的研究。將所述患者隨機化W接受麗-001或MN-002(其各自的每日劑量為 500mg持續(xù)長達(dá)6個月）或者安慰劑。所有患者參與相同的行為體重減輕程序。所有患者每月 經(jīng)歷通過腹US進行的評估。還監(jiān)測了肝酶水平、脂質(zhì)特性、膜島素水平和人體測量參數(shù)，并 且所有患者經(jīng)歷營養(yǎng)隨訪評估?；颊哌€在研究結(jié)束時經(jīng)歷第二肝活檢檢查。血清丙氨酸轉(zhuǎn) 氨酶水平和脂肪變性通過US測量為非限制性終點。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法分 析該結(jié)果。
[00巧]實施例3:MN-001在非酒精性脂肪性肝炎的STAM模型中的治療有益效果
[0096] STAM?是通過在巧7BL/6小鼠中的化學(xué)和膳食干預(yù)組合創(chuàng)建的非酒精性脂肪性肝 炎(NA甜）、其癥狀及相關(guān)的肝病癥模型。替米沙坦(telmisadan)已顯示在STM小鼠中具有 抗NASH、抗纖維化和抗炎性作用，并因此在本研究中用作陽性對照。根據(jù)本研究且如下文所 述，用替米沙坦進行的治療與媒介物組相比同報道數(shù)據(jù)一致顯著減少肝重量、NAS、纖維化 面積和炎癥面積，從而提供了如本文采用的STAM小鼠模型用于說明本發(fā)明所用的化合物有 用性的有用性的證據(jù)。
[0097] 使用MN-001進行的治療與媒介物相比W劑量依賴性方式顯著減少了纖維化面積， 運表明了 MN-001在本研究中的抗纖維化作用。高劑量MN-001傾向于減少肝徑脯氨酸含量， 運支持了其抗纖維化性質(zhì)。用高劑量MN-001進行的治療顯著降低NA化S活性評分(NAS) dNAS 的改善可歸因于如小葉炎癥和肝細(xì)胞鼓脹的減輕。值得注意的是，高劑量的MN-001顯著降 低了鼓脹評分。因為肝細(xì)胞鼓脹來源于氧化應(yīng)激-誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷且與NASH疾病進展相 關(guān)（Fujii Η等J.Atheroscler.Thromb.2009;16:893，Rangwala F等J.化thol.2011;224: 401)，所W在不受理論限制的情況下預(yù)想到MN-001可通過抑制肝細(xì)胞損傷和鼓脹來改善 NA甜病狀。
[0098] 使用低劑量的MN-001進行的治療與媒介物相比顯著減小了炎癥面積，運表明了 MN-001的抗炎性作用。
[0099] 總而言之，在本研究中W各種劑量施用的MN-001顯示了抗ΝΑ細(xì)、抗纖維化和抗炎 性作用中的一種或多種。運些結(jié)果和其它結(jié)果在下文討論。
[0100] 材料和方法
[0101] 受試物
[0102] ΜΝ-001由MediciNove Inc.提供。為了制備給藥溶液，將ΜΝ-001稱重并溶解于 0.2%甲基纖維素（媒介物）中。替米沙坦（Micardis? )購自Boehringer Ingelheim GmbH (德國）并且溶解于純水中。
[0103] NA甜的誘導(dǎo)
[0104] 在出生后2天且用高脂肪膳食化FD，57kcal%脂肪，cat#:H抑32，CLEA化pan,日 本)飼喂4周齡后通過單次皮下注射2(K)yg鏈脈霉素(STZ，Sigma-Al化ich，美國）溶液在50只 雄性小鼠中誘導(dǎo)NASH。用正常膳食飼喂且不經(jīng)STZ治療的十只雄性同窩仔畜用于正常組。
[01化]藥物施用途徑
[0106] 媒介物、ΜΝ-001和替米沙坦W lOmL/kg的量通過經(jīng)口途徑施用。
[0107] 治療劑量
[010 引 MN-001W lOmg/kg、30mg/kg 和 lOOmg/kg 的劑量每日施用一次。替米沙坦 W lOmg/kg 的劑量每日施用一次。
[0109] 動物
[0110] C57E5L/6小鼠（懷孕 15天的雌性）從Char 1 es River Laboratories Japan (Kanagawa，日本）獲得。將用于研究中的所有動物根據(jù)日本藥理學(xué)會動物使用指南 (Japanese Pharmacological Society Guidelines for Animal Use)飼養(yǎng)并護理。
[0111] 環(huán)境
[0112] 在控制的溫度(23°C ±2°C )、濕度(45% ± 10% )、光照（12小時人造光和黑暗循環(huán)； 8:00至20:00光照)和換氣條件下在SPF設(shè)施中維持動物。在實驗室內(nèi)維持高壓(20化± 4Pa) W預(yù)防設(shè)施污染。
[011引動物管理
[0114] 將動物飼養(yǎng)在聚碳酸醋籠KN-600(化tsume Seisakusho,日本）中，其中每籠最多4 只小鼠。滅菌PULMAai(Material Research Center,日本）用作墊草并每周替換一次。 [011引飲食
[0116] 滅菌的固體WD自由提供，置于籠頂部上的金屬蓋內(nèi)。從水瓶任意地提供純水，該 水瓶配備有有橡皮塞和吸管。將水瓶每周替換一次、清洗并在高壓蓋內(nèi)滅菌和再使用。
[0117] 動物和籠識別
[0118] 小鼠由雕刻在耳飾上的數(shù)字來識別。將每個籠用專用識別碼標(biāo)記。
[0119] 全血和血漿生物化學(xué)的測量
[0120] 非空腹血糖使用LIFE C皿CK化IDIA，日本)對全血測量。對于血漿生物化學(xué)，將血 液收集于具有抗凝劑(Nov〇-Hepa;rin，Mochida陸armaceutical，日本）的聚丙締管中，并在 4°C下WlOOOXg離屯、15分鐘。將上清液收集并膽藏在-80°C下直至使用。血漿ALT和AST水平 通過FUJI DRI-C肥Μ 7000(Rijifilm，日本)測量。
[0121] 肝生物化學(xué)的測量
[0122] 肝徑脯氨酸含量
[0123] 為了定量肝徑脯氨酸含量，將冷凍肝樣品（32mg-40mg)通過堿-酸水解方法如下處 理。將肝樣品用100%丙酬脫脂、在空氣中干燥、在65°c下溶解于2N化0H中并在12rc下高 壓滅菌20分鐘。將裂解的樣品（400化)在121°C下用4(Κ)化的6N HC1酸水解20分鐘，并用含有 lOmg/mL活性炭的400化的4Ν化0Η中和。將AC緩沖液（2.2Μ乙酸/0.48Μ巧樣酸，400化)添加 至樣品，然后離屯、W收集上清液。用從16yg/mL開始的反式-4-徑基-^脯氨酸（Sigma- A1化ich)的連續(xù)稀釋液建立徑脯氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將制備的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品（各為4(Κ)μυ與 400化氯胺Τ溶液(Wako Pure化emical Industries)混合并在室溫下解育25分鐘。然后將 所述樣品與歐立希氏溶液巧虹lich' S solution) (40化L)混合并在65°C下加熱20分鐘W出 現(xiàn)顏色。在冰上冷卻樣品并離屯、W去除沉淀后，在560nm下測量每個上清液的光學(xué)密度。根 據(jù)徑脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計算徑脯氨酸濃度。肝樣品的蛋白質(zhì)濃度使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒 (Thermo Fisher Scientific,美國）測定并用于標(biāo)準(zhǔn)化經(jīng)計算的徑脯氨酸值。肝徑脯氨酸 水平被表達(dá)為yg/mg蛋白質(zhì)。
[0124] 組織病理學(xué)分析
[01巧]對于皿染色，從于布安氏溶液(Boilin'S solution)中預(yù)固定的左側(cè)肝組織的石蠟 塊上進行切片，并用Lillie-Mayer蘇木精(Muto化re化emicals，日本）和曙紅溶液(Wako 化re Qiemical Indushies)染色。NAS根據(jù)克萊納標(biāo)準(zhǔn)計算化leiner DE.等Η邱atology, 2005:41:1313)。為了使膠原沉積可視化，布安氏固定的左側(cè)肝切片使用天狼星紅(picro- Sirius red)溶液(Waldeck，德國）染色。
[01%] 對于免疫組織化學(xué)，從包埋在組織-Tek O.C.T.化合物中并在丙酬中固定的冷凍 左側(cè)肝組織進行切片。內(nèi)源性過氧化酶活性使用0.03%出化阻斷5分鐘，然后用Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma,日本）解育10分鐘。將切片在室溫下用抗-α-SMA 化pitomics，美國）或抗-F4/80抗體(BMA Biomedicals，瑞±)的200倍稀釋液解育1小時。在 用二抗化RP-山羊抗-大鼠抗體，Inv i trogen，美國）解育后，使用3，3 ' -二氨基聯(lián)苯胺/出化溶 液(Nichirei，日本)進行酶-底物反應(yīng)。
[0127] 對于纖維化面積、炎癥面積和a-SMA半定量的定量分析，在中央靜脈周圍使用數(shù)碼 相機(DFC280;Leica，德國）W200倍放大捕獲天狼星紅染色的F4/80和a-SMA-免疫染色切片 的明場圖像，并且5個視野/切片中的陽性面積使用Image J軟件(美國國立衛(wèi)生研究院）測 量。
[0128] 定量 RT-PCR
[0129] 總RNA從肝樣品使用RNAiso(化kara Bio,日本)根據(jù)制造商的說明提取。lyg的RNA 使用于20化最終體積中含有4.4mM MgCl2(Roche，瑞±)、40U RNA酶抑制劑(Toyobo,日本）、 0.5mM dNTP(Promega，美國）、6.2祉Μ隨機六聚體（Promega)、5 X 第一鏈緩沖液（Promega)、 lOmM二硫蘇糖醇（Invitrogen)和200U MMLV-RTdnvitrogen)的反應(yīng)混合物進行逆轉(zhuǎn)錄。反 應(yīng)在37°C下進行1小時，然后在99°C下進行5分鐘。使用實時PCR DICE和SYBR預(yù)混合液Taq (Takara Bi0)進行實時PCR。為了計算相對mRNA表達(dá)水平，將每個基因的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為參照 基因36B4(基因符號:化IpO)的表達(dá)。PCR-引物對和板布局的信息描述于表1中。
[0130] 統(tǒng)計檢驗
[0131 ]統(tǒng)計分析使用Gra地Pad Prism 4(Gra地化d Software,美國）上的Bonferroni多 重比較檢驗進行。P值<0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計學(xué)顯著的。當(dāng)單尾t-檢驗回到P值<0.10時，假定趨 勢或傾向。結(jié)果被表達(dá)為平均值±50。
[0132] 實驗設(shè)計和治療
[0133] 研究組
[0134] 組1:正常
[0135] 向十只正常小鼠自由飼喂正常膳食而不經(jīng)任何治療直至9周齡。
[0136] 組2:媒介物
[0137] 向十只NA甜小鼠從6周齡至9周齡WlOmL/kg的量每日一次經(jīng)口施用媒介物。
[013引組3:MN-001-低劑量
[0139] 向十只NA細(xì)小鼠從6周齡至9周齡WlOmg/kg的劑量每日一次經(jīng)口施用補充有麗- 001的媒介物。
[0140] 組 4:MN-001-中劑量
[0141] 向十只NA細(xì)小鼠從6周齡至9周齡W30mg/kg的劑量每日一次經(jīng)口施用補充有麗- 001的媒介物。
[0142] 組 5:MN-001-高劑量
[0143] 向十只NA甜小鼠從6周齡至9周齡WlOOmg/kg的劑量每日一次經(jīng)口施用補充有MN- 001的媒介物。
[0144] 組6:替米沙坦
[0145] 向六只NA甜小鼠從6周齡至9周齡W1 Omg/kg的劑量每日一次經(jīng)口施用補充有替米 沙坦的純水。下表匯總了治療方案。
[0146]
[0147] 動物監(jiān)測和處死
[0148] 每日監(jiān)測存活力、臨床體征和行為。在治療前記錄體重。在每次施用后大約60分鐘 觀察小鼠的毒性、溯死和死亡的顯著臨床體征。將動物經(jīng)由通過在酸麻醉（W a k 0 P U r e Qiemical Industries)下直接屯、臟穿刺的驅(qū)血法處死。
[0149] 結(jié)果
[01加]組織學(xué)分析
[0151] 肥染色和NAFLD活性評分
[0152] 來自媒介物組的肝切片展現(xiàn)出嚴(yán)重的微觀和宏觀囊泡脂肪沉積、肝細(xì)胞鼓脹和炎 性細(xì)胞浸潤。與運些觀察一致，與正常組相比，在媒介物組中NAS顯著升高。與媒介物組相 比，替米沙坦組顯示肝細(xì)胞鼓脹和炎性細(xì)胞浸潤的顯著改善，其中NAS顯著降低。MN-001-高 劑量組顯示肝細(xì)胞鼓脹的顯著改善和炎性細(xì)胞浸潤的適度改善。與媒介物組相比，NAS在 MN-001-高劑量組中顯著降低。與媒介物組相比，MN-001-低劑量組和MN-001-中劑量組顯示 肝細(xì)胞鼓脹適度減小。媒介物組與任何其它組之間的NAS不存在顯著差異（正常:0.0±00、 媒介物：5.3±0.5、麗-001-低:4.7±0.5、麗-001-中：4.7±0.5、麗-001-高：3.3±0.8、替米 沙坦:2.6±0.7)。參見圖1-3和下表。
[0153] NAFLD 活性評分(NAS)表
[0154]
[0巧日]NAS成分的定義
[0156]
[0157] 天狼星紅染色
[0158] 與正常組相比，來自媒介物組的肝切片顯示肝小葉的中屯、周圍區(qū)域內(nèi)的膠原沉積 增加。與正常組相比，在媒介物組中的纖維化面積（天狼星紅-陽性面積）的百分比顯著增 加。與媒介物組相比，在替米沙坦組和MN-001治療組兩者中纖維化面積顯著減小（正常： 0.29±0.08%、媒介物：0.97±0.19%、]\〇^-001-低：0.76±0.19%、]\〇^-001-中：0.76± 0.16%、]^-001-高:0.69±0.18%、替米沙坦:0.62±0.09%)。參見圖4。
[0159] F4/80免疫染色
[0160] 與正常組相比，來自媒介物組的肝切片顯示肝小葉中F4/80-陽性細(xì)胞的數(shù)目和尺 寸增加。與正常組相比，在媒介物組中炎癥面積(F4/80-陽性面積)的百分比顯著增加。與媒 介物組相比，在替米沙坦組和MN-001-低組兩者中炎癥面積顯著減小。媒介物組與任何其它 組之間的炎癥面積沒有顯著差異(正常:3.26 ± 0.66 %、媒介物:6.56 ± 1.19 %、MN-001-低： 5.18±0.85%、麗-001-中：6.33±0.84%、麗-001-高：6.31±0.76%、替米沙坦：4.46± 0.88%)。參見圖5。
[0161] a-SMA免疫染色
[0162] 與正常組相比，來自媒介物組的肝切片顯示肝小葉中a-SMA-陽性細(xì)胞增加。與正 常組相比，在媒介物組中a-SMA-陽性面積的百分比顯著增加。與媒介物組相比，在MN-001- 低和MN-001 -高組中a-SMA-陽性面積傾向于減小。媒介物組與任何其它組之間的a-SMA-陽 性面積沒有顯著差異（正常：0.07 ± 0.03 %、媒介物：0.15 ± 0.08 %、MN-001-低：0.10 ± 0.05%、]^-001-中：0.11±0.04%、]^-001-高:0.11±0.04%、替米沙坦:0.12±0.05%)。
[0163] 體重變化和一般情況
[0164] 在治療期間在除了替米沙坦組之外的所有組中體重逐漸增加。在整個治療期間， 媒介物組的平均體重低于正常組的平均體重。從第11天至第22天，替米沙坦組的平均體重 顯著低于媒介物組的平均體重。在治療期間，媒介物組與任何其它組之間的平均體重沒有 顯著差異。在本研究中，沒有動物顯示一般情況惡化。
[0165] 處死當(dāng)天的體重
[0166] 與正常組相比，處死時的平均體重在媒介物組中顯著較低。與媒介物組相比，替米 沙坦組顯示平均體重顯著減少。媒介物組與任何其它組之間的平均體重沒有顯著差異（正 常：25.0±0.4g、媒介物：20.5±1.9g、MN-001-低：21.1±1.3g、MN-001-中：20.3±1.0g、MN- 001-高:20.6±1.5g、替米沙坦:18.0±1.9g)。
[0167] 肝重量和肝與身體重量比率
[0168] 與正常組相比，平均肝重量在媒介物組中顯著增加。與媒介物組相比，替米沙坦組 顯示平均肝重量顯著減少。與媒介物組相比，在MN-001-中組中肝重量傾向于減少。媒介物 組與任何其它組之間的平均肝重量沒有顯著差異（正常：1083±83111肖、媒介物：1555± 112mg、MN-001-低：1567±165111邑、]^-001-中：1439±118111邑、]^-001-高：1480±145111邑、替米 沙坦：1172 ±90mg)。
[0169] 與正常組相比，在媒介物組中肝與身體重量比率顯著增加。與媒介物組相比，替米 沙坦組顯示平均肝與身體重量比率顯著降低。與媒介物組相比，在MN-001-中組和MN-001- 高組中肝與身體重量比率傾向于降低。媒介物組與MN-001-低組之間的肝與身體重量比率 沒有顯著差異（正常：4.3±0.3%、媒介物：7.6±0.6%、MN-001-低：7.4±0.8%、MN-001- 中：7.1±0.5%、MN-001-高:7.2±0.6%、替米沙坦:6.5±0.4%)。
[0170] 全血和生物化學(xué)
[0171] 全血葡萄糖（圖3.1和表3)與正常組相比，在媒介物組中血糖水平顯著升高。與媒 介物組相比，替米沙坦組顯示血糖水平顯著升高。媒介物組與任何其它組之間的血糖水平 沒有顯著差異（正常：192 ± 40mg/化、媒介物：632 ± 95mg/化、MN-001-低：614 ± 98mgAlL、MN- 001-中：609 ± 78mgAlL、MN-001-高：671 ± 124mgAlL、替米沙坦:876 ± 29mgAlL)。
[0172] 血漿 ALT
[0173] 與正常組相比，在媒介物組中血漿ALT水平傾向于升高。與媒介物組相比，在替米 沙坦組中血漿ALT水平傾向于降低。在媒介物組與任何其它組之間血漿ALT水平?jīng)]有顯著差 異（正常：31±10U/L、媒介物：51±2211/1、麗-001-低：71±601]/1、麗-001-中：48±231]/1、 MN-001-高：54 ± 11U/L、替米沙坦:37 ± 抓/L)。
[0174] 血漿 AST
[0175] 與正常組相比，在媒介物組中血漿AST水平傾向于降低。與媒介物組相比，在MN- 001-中組和MN-001-高組中血漿AST水平傾向于升高。媒介物組和MN-001-低組之間的血漿 AST 水平?jīng)]有顯著差異(正常:300± 77U/L、媒介物：193±95U/L、MN-001-低：214± 210U/L、 MN-001-中：270±11411/1、麗-001-高：385±1831]/1、替米沙坦：190±281]/1)。
[0176] 肝徑脯氨酸含量
[0177] 正常組和媒介物組之間的肝徑脯氨酸含量沒有顯著差異。與媒介物組相比，在替 米沙坦組中肝徑脯氨酸含量傾向于增加。與媒介物組相比，在MN-001-高組中肝徑脯氨酸含 量傾向于減少。媒介物組與任何其它組之間的肝徑脯氨酸含量沒有顯著差異(正常:0.61± 0.12yg/mg蛋白質(zhì)、媒介物:0.67 ± 0.16yg/mg蛋白質(zhì)、MN-001 -低:0.78 ± 0.34yg/mg蛋白質(zhì)、 MN-001-中：0.63 ± 0.12yg/mg蛋白質(zhì)、MN-001-高:0.55 ± 0.14yg/mg蛋白質(zhì)、替米沙坦:0.87 ±0.23yg/mg蛋白質(zhì)）。參見圖6。
[0178] 基因表達(dá)分析
[0179] a-SMA
[0180] 與正常組相比，在媒介物組中a-SMA mRNA表達(dá)水平傾向于上調(diào)。與媒介物組相比， 在替米沙坦組中α-SMA mRNA表達(dá)水平傾向于上調(diào)。媒介物組與任何其它組之間的α-SMA mRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異（正常：1.00 ± 0.44、媒介物:4.08 ± 2.56、ΜΝ-001-低：36.8 ± 111、麗-001-中：3.13±2.52、麗-001-高：5.78±3.45、替米沙坦:5.21±1.43)。
[0181] TNF-a
[0182] 與正常組相比，在媒介物組中TNF-amRNA表達(dá)水平傾向于上調(diào)。媒介物組與任何其 它組之間的TNF-amRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異(正常：1.00 ± 0.48、媒介物:9.88 ± 19.3、MN- 001-低：3.42±2.53、]^-001-中：7.97±9.30、]^-001-高：9.74±3.34、替米沙坦：8.35± 2.84)。
[018引 CCR2
[0184] 與正常組相比，在媒介物組中CCR2mRNA表達(dá)水平顯著地上調(diào)。與媒介物組相比，在 MN-001-低組和MN-001-中組中CCR2mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)。媒介物組與任何其它組之間的 CCR2mRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異(正常：1.00 ± 0.27、媒介物:6.83 ± 9.89、MN-001-低:0.13 ±0.09、麗-001-中：0.22±0.35、麗-001-高：3.86±1.43、替米沙坦:3.21±0.85)。
[0185] MCP-1
[01化]與正常組相比，在媒介物組中MCP-lmRNA表達(dá)水平顯著地上調(diào)。與媒介物組相比， 在MN-001-低組中MCP-lmRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)。與媒介物組相比，在MN-001-高組和替米沙 坦組中MCP-lmRNA表達(dá)水平傾向于下調(diào)。
[0187] 媒介物組與任何其它組之間的MCP-lmRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異（正常：1.00 ± 0.35、媒介物：2.17±42.2、]^-001-低：1.97±2.06、]^-001-中：4.00±7.78、]^-001-高： 3.64±1.52、替米沙坦:2.69±0.95)。
[018引1型膠原
[0189] 與正常組相比，在媒介物組中1型膠原mRNA表達(dá)水平傾向于上調(diào)。1型膠原mRNA表 達(dá)水平顯著。
[0190] TIMP-1
[0191] 與正常組相比，在媒介物組中TIMP-lmRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)。與媒介物組相比，在 MN-001-低組和MN-001-中組中TIMP-lmRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)。媒介物組與任何其它組之間 的TIMP-lmRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異(正常：1.00 ± 0.37、媒介物:9.78 ± 7.28、MN-001-低： 2.20±1.52、]^-001-中：3.64±1.66、]^-001-高：10.6±5.83、替米沙坦:7.82±2.62)。
[0192] 總之，W各種劑量施用的MN-001在本研究中顯示出抗NA甜、抗纖維化和抗炎性作 用中的一種或多種作用。
【主權(quán)項】
1. 一種抑制患有脂肪變性的患者的脂肪變性的方法，包括向有需要的所述患者施用有 效量的式(I)化合物：或其代謝物、或者所述式（I)化合物或其代謝物的酯、或者其各自的藥學(xué)上可接受的 鹽，其中，m是2至5的整數(shù)且η是3至8的整數(shù)，X1和X2各自獨立地表示硫原子、氧原子、亞硫酰 基基團或磺?；鶊F，條件是X 1和X2不同時為氧原子。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述式(I)化合物具有式(IA):3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述式(I)化合物的代謝物是式(IB)化合物：4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述化合物經(jīng)口施用。5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述化合物作為片劑或膠囊劑施用。6. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述化合物以基本上不含其它多晶型的斜方晶系多 晶型A存在。7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述化合物作為液體劑型施用。8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述化合物以IOOmg/天至4000mg/天的量分成一份、 兩份或三份施用。9. 一種抑制患有小葉炎癥的患者的小葉炎癥的方法，包括向有需要的所述患者施用有 效量的式(I)化合物：或其代謝物、或者所述式（I)化合物或其代謝物的酯、或者其各自的藥學(xué)上可接受的 鹽，其中，m是2至5的整數(shù)且η是3至8的整數(shù)，X1和X2各自獨立地表示硫原子、氧原子、亞硫酰 基基團或磺酰基基團，條件是X 1和X2不同時為氧原子。10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述式(I)化合物具有式(IA):11. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述式(I)化合物的代謝物是式(IB)化合物：12. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述化合物經(jīng)口施用。13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述化合物作為片劑或膠囊劑施用。14. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述化合物以基本上不含其它多晶型的斜方晶系 多晶型A存在。15. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述化合物作為液體劑型施用。16. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述化合物以IOOmg/天至4000mg/天的量分成一 份、兩份或三份施用。17. -種抑制患有肝鼓脹的患者的肝鼓脹的方法，包括向有需要的所述患者施用有效 量的式(I)化合物：或其代謝物、或者所述式（I)化合物或其代謝物的酯、或者其各自的藥學(xué)上可接受的 鹽，其中，m是2至5的整數(shù)且η是3至8的整數(shù)，X1和X2各自獨立地表示硫原子、氧原子、亞硫酰 基基團或磺酰基基團，條件是X 1和X2不同時為氧原子。18. 如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述式(I)化合物具有式(IA):19. 如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述式(I)化合物的代謝物是式(IB)化合物：20. 如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述化合物經(jīng)口施用。21. 如權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述化合物作為片劑或膠囊劑施用。22. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述化合物以基本上不含其它多晶型的斜方晶系 多晶型A存在。23. 如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述化合物作為液體劑型施用。24. 如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述化合物以IOOmg/天至4000mg/天的量分成一 份、兩份或三份施用。25. -種抑制患有肝結(jié)疤的患者的肝結(jié)疤的方法，包括向有需要的所述患者施用有效 量的式(I)化合物：或其代謝物、或者所述式（I)化合物或其代謝物的酯、或者其各自的藥學(xué)上可接受的 鹽，其中，m是2至5的整數(shù)且η是3至8的整數(shù)，X1和X2各自獨立地表示硫原子、氧原子、亞硫酰 基基團或磺?；鶊F，條件是X 1和X2不同時為氧原子。26. 如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述式(I)化合物具有式(IA):27. 如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述式(I)化合物的代謝物是式(IB)化合物：28. 如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述化合物經(jīng)口施用。29. 如權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述化合物作為片劑或膠囊劑施用。30. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中，所述化合物以基本上不含其它多晶型的斜方晶系 多晶型A存在。31. 如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述化合物作為液體劑型施用。32. 如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述化合物以IOOmg/天至4000mg/天的量分成一 份、兩份或三份施用。33. -種降低和/或抑制患有升高的肝羥脯氨酸水平的患者的升高的肝羥脯氨酸水平 的方法，包括向有需要的所述患者施用有效量的式(I)化合物：或其代謝物、或者所述式（I)化合物或其代謝物的酯、或者其各自的藥學(xué)上可接受的 鹽，其中，m是2至5的整數(shù)且η是3至8的整數(shù)，X1和X2各自獨立地表示硫原子、氧原子、亞硫酰 基基團或磺?；鶊F，條件是X 1和X2不同時為氧原子。34. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述式(I)化合物具有式(IA):35. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述式(I)化合物的代謝物是式(IB)化合物：36. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述化合物經(jīng)口施用。37. 如權(quán)利要求36所述的方法，其中，所述化合物作為片劑或膠囊劑施用。38. 如權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述化合物以基本上不含其它多晶型的斜方晶系 多晶型A存在。39. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述化合物作為液體劑型施用。40. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述化合物以IOOmg/天至4000mg/天的量分成一 份、兩份或三份施用。
【文檔編號】A61K31/192GK105934243SQ201580004269
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2015年1月7日
【發(fā)明人】松田和子
【申請人】美迪諾亞公司