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一種利用ApoE-/-小鼠建立非酒精性脂肪肝模型的方法

文檔序號:10495457閱讀:4634來源:國知局
一種利用ApoE-/-小鼠建立非酒精性脂肪肝模型的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及非酒精性脂肪肝病動物模型的建立,具體為伴有嚴(yán)重血脂異常的一類高脂誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝動物模型的建立。選用SPF級雄性AopE?/?小鼠和C57BL/6小鼠,按照鼠種隨機分模型組和對照組,共4組,每組8只,所有小鼠用普通維持飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,模型組給予高脂飼料,對照組給予對照飼料,10周后取血處死,檢測常規(guī)血脂四項及肝功能;取鮮活肝組織勻漿,測定組織內(nèi)膽固醇與甘油三酯含量;另取肝組織做石蠟、冰凍切片,分別進(jìn)行H.E.和油紅O染色,判定NAFLD模型效果與質(zhì)量。本發(fā)明使用單純性高脂高熱量飲食造模,在很短的周期10周內(nèi)造出重度NAFLD模型,模型血脂、肝臟脂肪等指標(biāo)穩(wěn)定性極好,可重復(fù)性高,為NAFLD高質(zhì)量模型的建立提供了一種可靠的方法。
【專利說明】
一種利用ApoE-/-小鼠建立非酒精性脂肪肝模型的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及非酒精性脂肪肝病(NAFLD)動物模型的建立,具體為伴有嚴(yán)重血脂異 常的一類高脂誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝動物模型的建立。
【背景技術(shù)】
[0002] 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除酒精和其他明確的損肝因素以外,導(dǎo)致肝細(xì) 胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征。NAFLD由一系列連續(xù)發(fā)展的疾病組成,早 期僅發(fā)生單純性脂肪肝(SFL)與非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。隨著病變的發(fā)展,最終引發(fā)肝 組織的纖維化,并導(dǎo)致肝硬化的形成。同時NAFLD所引起的肥胖和血脂異常也是導(dǎo)致其他代 謝障礙性疾病的罪歸禍?zhǔn)?,如動脈粥樣硬化(AS)、高血壓和二型糖尿病等。隨著社會的進(jìn) 步,人們飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變,大批高脂肪,高膽固醇,高熱量的食物進(jìn)入了人們的餐桌,伴 隨而來的是我國脂肪肝發(fā)病率的不斷提升,已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝臟疾病。
[0003] 人們常用各種手段來研究各種疾病,其中最重要的方法之一就是構(gòu)建動物模型。 為了更全面了解脂肪肝的發(fā)生過程,已進(jìn)行了許多臨床研究。然而,NAFLD病情演變與發(fā)展 時間很長,這很大程度上限制我們得到具有合理解釋性的數(shù)據(jù)。于是,研究者將注意力轉(zhuǎn)至 發(fā)展合適的動物模型方向來探明脂肪肝形成過程。建立一個穩(wěn)定可靠、病理演變過程符合 的NAFLD動物模型,對研究NAFLD的發(fā)病機制及治療方法具有重要意義。
[0004] 現(xiàn)有的非酒精性脂肪肝動物模型類別繁雜,動物選擇上也各有長短,嚙齒類動物 多為SD大鼠、wistar大鼠、C57BL/6小鼠、荷蘭兔等,非嚙齒類動物包括豬、犬等。這些動物模 型雖能在一定程度上反應(yīng)非酒精性脂肪肝發(fā)病進(jìn)程,但大都存在穩(wěn)定性差,成模周期長的 特點。本文特別采用以C57BL/6為背景的ApoE-/-基因敲除鼠代替野生型C57BL/6作為研究 對象,ApoE-/-小鼠因為載脂蛋白E的缺乏,導(dǎo)致先天性脂類代謝障礙,小鼠每日攝入充足的 高脂食物不能及時代謝出體外,造成脂質(zhì)在肝臟的積累。更重要的是,ApoE-/-小鼠模型出 現(xiàn)嚴(yán)重的血脂異常,這是脂肪肝發(fā)展進(jìn)程中的一個重要指標(biāo),為進(jìn)一步探討NAFLD和心血管 疾病互為作用的發(fā)病機制,提供了一種可靠的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種利用ApoE-/-小鼠建立經(jīng)高脂誘導(dǎo)的伴有嚴(yán)重血脂異常的單純性 脂肪肝病變動物模型。
[0006] 本發(fā)明選用SPF級雄性AopE-/-小鼠和C57BL/6小鼠,按照鼠種隨機分模型組和對 照組,共4組,每組8只。所有小鼠用普通維持飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,模型組給予高脂飼料, 對照組給予對照飼料,早晚各一次定量定投飼料,保證40g/籠,每籠4只小鼠。10周后取血處 死,檢測常規(guī)血脂四項(1'(:、了6、0^-(3、^1-(3)及肝功能以1^和431');取鮮活肝組織勻漿,測 定組織內(nèi)膽固醇與甘油三酯含量;另取肝組織做石蠟、冰凍切片,分別進(jìn)行H.E.和油紅0染 色,判定NAFLD模型效果與質(zhì)量。
[0007] 本發(fā)明特點采用以C57BL/6為背景的ApoE-/-基因敲除鼠,經(jīng)高脂飲食誘導(dǎo)發(fā)展形 成非酒精性脂肪肝模型。ApoE-/-小鼠因為載脂蛋白E的缺乏,導(dǎo)致先天性脂類代謝障礙,使 得每日攝食的脂質(zhì)不能在體內(nèi)正常運輸,造成其在肝臟中的積累,同時伴有嚴(yán)重的血脂異 常,與NAFLD臨床病理相似度極高。C57BL/6小鼠在本發(fā)明中作為對照使用。本發(fā)明方法中的 動物飼料為對照飼料(ND)和高脂飼料(HFD)均購自江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司。本發(fā)明 方法中的SPF級雄性AopE-/-小鼠購自江蘇省常州市卡文斯實驗動物有限公司;SPF級雄性 C57BL/6小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。
[0008] 本發(fā)明使用單純性高脂高熱量飲食造模,亦可以在很短的周期10周內(nèi),造出重度 NAFLD模型。更重要的是,模型血脂、肝臟脂肪等指標(biāo)穩(wěn)定性極好,可重復(fù)性高。為NAFLD高質(zhì) 量模型的建立,提供了一種可靠的方法。
【附圖說明】
[0009] 圖1是對照飼料喂養(yǎng)的C57BL/6小鼠肝臟病理切片圖(H.E.染色X400);
[0010]圖2是對照飼料喂養(yǎng)的AopE-/-小鼠肝臟病理切片圖(H.E.染色X400);
[0011]圖3是高脂飼料喂養(yǎng)的C57BL/6小鼠肝臟病理切片圖(H.E.染色X400);
[0012]圖4是高脂飼料喂養(yǎng)的AopE-/-小鼠肝臟病理切片圖(H.E.染色X400);
[0013]圖5是對照飼料喂養(yǎng)的C57BL/6小鼠肝臟病理切片圖(油紅0染色X400);
[0014]圖6是對照飼料喂養(yǎng)的AopE-/-小鼠肝臟病理切片圖(油紅0染色X400);
[0015] 圖7是高脂飼料喂養(yǎng)的C57BL/6小鼠肝臟病理切片圖(油紅0染色X400);
[0016] 圖8是高脂飼料喂養(yǎng)的AopE-/-小鼠肝臟病理切片圖(油紅0染色X400)。
【具體實施方式】
[0017]實施例丨本發(fā)明動物模型的制備
[0018] 1、實驗動物:SPF級雄性AopE-/-小鼠,6~8周齡,體重(22 ± 2) g,購自江蘇省常州 市卡文斯實驗動物有限公司【SCXK(蘇UOll-OOShSPF級雄性C57BL/6小鼠,6~8周齡,體重 (22±2)g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2011-0011】。
[0019] 2、實驗動物均飼養(yǎng)于本部屏障環(huán)境內(nèi),溫度22~25°C,濕度50%,12小時晝夜交 替。
[0020] 3、實驗動物經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機分四組,每組8只,詳細(xì)分組情況如下表1。造 模10周,早晚各一次定量定投飼料,保證40g/籠,每籠4只小鼠,期間自由引水,水源為SPF級 的滅菌水,每兩周稱量體重一次。動物飼料為對照飼料(MD12031)和高脂飼料(MD12032)均 購自江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司。
[0021] 表1動物詳細(xì)分組
[0023] 4、造模10周后,各組小鼠同一時間全部處死,處死前禁食12小時。4%水合氯醛腹 腔注射麻醉,摘眼球取血后,全血37°C靜置1小時,4°C放置血塊析出,3000rmp離心10min取 上層血清。全自動生化分析儀檢測血清中的TC、TG、LDL-c、HDL-c、AST和ALT等指標(biāo),結(jié)果如 表2所示。
[0024] 表2各組血清生化指標(biāo)變化表(^±s、n = 6)
[0026]注:TC、TG、LDL-C和HDL-C單位為mmol/L,AST和ALT單位為U/Ua:與A組比較,P〈 0.01;b:與 B組比較,P〈0.01;c:與C組比較,P〈0.01。
[0027]高脂飼料喂養(yǎng)的AopE-/-小鼠組相較于其他三組TC、TG和LDL-C均有極顯著上升(P 〈0.01);高脂飼料喂養(yǎng)的C57BL/6小鼠組相較于對照飼料喂養(yǎng)的C57BL/6小鼠組TC、TG和 LDL-C均有極顯著降上升(P〈0.01)但數(shù)值相較差距不大;有趣的是同是對照飼料喂養(yǎng)的 AopE-/-小鼠組相較于對照飼料喂養(yǎng)的C57BL/6小鼠組TC、TG和LDL-C均有極顯著降上升(P〈 0.01)且數(shù)值差距較大。各組間血清中AST和ALT指標(biāo)沒有顯著性差異,顯示出高脂誘導(dǎo)10 周,各組肝臟沒有較大損傷,根據(jù)NAFLD病情發(fā)展判斷,本發(fā)明中模型應(yīng)為單純性脂肪肝。以 上數(shù)據(jù)表明ApoE-/-小鼠在血清脂質(zhì)提升上的優(yōu)勢比較明顯。
[0028] 5、肝臟脂質(zhì)的檢測,具體方法以一只小鼠為例,分別各取100mg新鮮肝組織根據(jù)試 劑盒自帶裂解液各加lml進(jìn)行勻漿,各自勻漿液一部分用來檢測甘油三酯(TG)和總膽固醇 (TC)的含量,另一部分分別測定其蛋白含量,最后必須用每毫克蛋白濃度來校正甘油三酯 (TG)和總膽固醇。甘油三酯(組織)酶法測定試劑盒(E1013)和總膽固醇(組織)含量測定試 劑盒(E1015)購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。結(jié)果如表3所示。
[0029]表3各組肝臟脂質(zhì)變化表(S±s ,n = 6)
[0031] 注:TC和TG的單位為mmol/kga:與A組比較,P〈0 ? 01;b:與B組比較,P〈0 ? 01; c :與C 組比較,P〈〇.〇l。
[0032] 與血脂對應(yīng)的是ApoE-/-小鼠肝臟脂質(zhì)蓄積比較嚴(yán)重,其中高脂飼料喂養(yǎng)的 AopE-/-小鼠組相較于其他三組,肝臟TG和TC上升明顯(P〈0.01),高脂飼料喂養(yǎng)的C57BL/6 小鼠組相較于對照飼料喂養(yǎng)的C57BL/6小鼠組肝臟TG和TC上升也是比較明顯(P〈0.01)說明 C57BL/6小鼠高脂誘導(dǎo)成功,但效果遜于ApoE-/-小鼠。
[0033] 6、肝臟組織病理學(xué)的檢測,具體方法以一只小鼠為例,取肝臟同一部位,分兩份。
[0034] 6a、一部分用Bouin ' S固定液固定,用作石錯切片進(jìn)行H. E.染色。
[0035] 6b、另一部分用4%多聚甲醛固定液固定,用作冰凍切片進(jìn)行油紅0染色。
[0036]由病理切片可以看出,對照飼料喂養(yǎng)的C57BL/6小鼠肝組織結(jié)構(gòu)緊湊,放射性肝鎖 結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞核質(zhì)飽滿(圖1和5);對照飼料喂養(yǎng)的AopE-/-小鼠肝組織結(jié)構(gòu)依舊清晰,但 細(xì)胞外周已出現(xiàn)輕微的脂肪侵潤,應(yīng)發(fā)展至輕度脂肪肝(圖2和6);高脂飼料喂養(yǎng)的C57BL/6 小鼠組肝細(xì)胞內(nèi)已發(fā)生脂肪病變,出現(xiàn)空泡面積已達(dá)1/2以上,應(yīng)發(fā)展為中度脂肪肝(圖3和 7);高脂飼料喂養(yǎng)的AopE-/-小鼠組,已經(jīng)出現(xiàn)嚴(yán)重的肝細(xì)胞脂肪彌漫集聚,呈大脂滴樣,已 發(fā)展為重度脂肪肝(圖4和8)。進(jìn)一步說明基因敲除ApoE-/-小鼠NAFLD模型的成功。
[0037]綜上所述,利用ApoE-/-小鼠經(jīng)高脂誘導(dǎo)成功建立了伴有嚴(yán)重血脂異常的非酒精 性脂肪肝NAFLD動物模型。為研究NAFLD發(fā)病機理尤其是NAFLD與心血管疾病脂質(zhì)代謝異常 所形成的相互作用提供了一種新型動物模型。
【主權(quán)項】
1. 一種利用ApoE-/-小鼠建立非酒精性脂肪肝模型的方法,期特征在于,建立模型的步 驟為: 1) 、選取鼠種:分別選取SPF級雄性ΑορΕ-/-小鼠,6~8周齡,體重22 ± 2g,SPF級雄性 C57BL/6小鼠,6~8周齡,體重22±2g,飼養(yǎng)于本部屏障環(huán)境內(nèi),溫度22~25°C,濕度50%,12 小時晝夜交替,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周; 2) 、分組與造模:經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機分四組,其中ΑορΕ-/-小鼠兩組,命名為對照 組Β和高脂組D,C57BL/6小鼠兩組,命名為對照組Α和高脂組C,每組8只;造模10周,期間對照 組喂食對照飼料,高脂組喂食高脂飼料,早晚各一次定量定投飼料,保證40g/籠,每籠4只小 鼠,自由引水,水源為SPF級的滅菌水,每兩周稱量體重一次; 3) 、采血與檢測:造模10周后,各組小鼠同一時間全部處死,處死前禁食12小時,4%水 合氯醛腹腔注射麻醉,摘眼球取血后,全血37°C靜置1小時,4°C放置血塊析出,3000rmp離心 1 Omin取上層血清,全自動生化分析儀檢測血清中的TC、TG、LDL-c、HDL-c、AST和ALT指標(biāo); 4) 、肝臟脂質(zhì)的檢測:各組以一只小鼠為例,分別各取100mg新鮮肝組織根據(jù)試劑盒自 帶裂解液各加lml進(jìn)行勻漿,各自勻漿液一部分用來檢測甘油三酯TG和總膽固醇TC的含量, 另一部分分別測定其蛋白含量,最后必須用每毫克蛋白濃度來校正甘油三酯TG和總膽固醇 TC; 5) 、肝臟組織病理學(xué)的檢測:各組以一只小鼠為例,取肝臟同一部位,分兩份,一部分用 Bouin's固定液固定,用作石錯切片進(jìn)行H.E.染色,另一部分用4%多聚甲醛固定液固定,用 作冰凍切片進(jìn)行油紅〇染色; 6) 、對步驟3)-步驟5)進(jìn)行分析,確定利用ApoE-/-小鼠經(jīng)高脂誘導(dǎo)成功建立了伴有嚴(yán) 重血脂異常的非酒精性脂肪肝NAFLD動物模型。
【文檔編號】A23K50/50GK105850868SQ201610189192
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年3月28日
【發(fā)明人】劉慶平, 路遙, 林家彬, 王仁軍
【申請人】大連大學(xué)
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