本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
：，尤其涉及血漿s100a12在st段抬高型心肌梗死早期診斷中的應(yīng)用，具體為s100a12蛋白在st段抬高型心肌梗死(stemi)極早期診斷中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：急性心肌梗死，是嚴(yán)重威脅人類健康的常見的重要疾病之一。急性心肌梗死尤其是st段抬高型心肌梗死發(fā)病急，發(fā)病率和死亡率呈持續(xù)升高趨勢，早期診斷并進行再灌注治療是提高急性心肌梗死生存率的關(guān)鍵。世界衛(wèi)生組織規(guī)定急性心肌梗死的診斷基于胸痛的臨床癥狀，心電圖的改變及生物標(biāo)記物如心肌酶學(xué)的升高。目前，傳統(tǒng)的生物標(biāo)記物各有缺陷，ck-mb雖然是診斷stemi患者的金標(biāo)準(zhǔn)，但是敏感性差，在發(fā)病早期(發(fā)病前4h內(nèi))不升高；在1990年，大量的臨床研究證實，肌鈣蛋白(tnt、tni)可以用于stemi的早期診斷及對病情的評估，美國心臟病學(xué)學(xué)會/美國心臟病協(xié)會修改了對stemi診斷標(biāo)準(zhǔn)，把肌鈣蛋白納入為診斷stemi的心肌標(biāo)記物，stemi定義更新為心肌標(biāo)記物，特別是肌鈣蛋白升高達到心肌損傷的界定值，即可診斷為stemi。但是，肌鈣蛋白在發(fā)病后3-4h開始升高，10-24h才能達到高峰，對stemi患者早期診斷意義有限；ck-mb及肌鈣蛋白在stemi患者發(fā)病早期(發(fā)病后3h)升高幅度小，診斷效能低，肌紅蛋白在stemi患者發(fā)病后1h開始升高，但是診斷特異性低，多需要聯(lián)合其他指標(biāo)對stemi進行診斷。臨床上約有1/3的stemi患者早期臨床癥狀及心電圖表現(xiàn)不典型，目前在臨床使用的心肌損傷標(biāo)記物又存在上述不足，ck-mb升高較遲，且診斷敏感性較低；肌鈣蛋白亦不能在stemi發(fā)病2h內(nèi)被檢出；肌紅蛋白雖然在stemi發(fā)病后的1-2h開始升高，但特異性差，不具有單獨診斷價值。因此，研發(fā)在發(fā)病內(nèi)1-2h內(nèi)即可被檢測敏感性及特異性均較高的stemi標(biāo)志物，對于stemi患者的極早期診斷,顯得尤為重要。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對上述問題，本發(fā)明的目的在于提供血漿s100a12在st段抬高型心肌梗死早期診斷中的應(yīng)用，具體為s100a12蛋白在st段抬高型心肌梗死早期診斷中的應(yīng)用。所述的s100a12的氨基酸序列如seq.id.no.1所示：metthrlysleuglugluhisleugluglyilevalasnilephehisglntyrservalarglysglyhispheaspthrleuserlysglygluleulysglnleuleuthrlysgluleualaasnthrilelysasnilelysasplysalavalileaspgluilepheglnglyleuaspalaasnglnaspgluglnvalasppheglnglupheileserleuvalalailealaleulysalaalahistyrhisthrhislysglu。所述的s100a12蛋白可以作為st段抬高型心肌梗死早期診斷的生物標(biāo)志物；具體的，具體為s100a12蛋白制備st段抬高型心肌梗死早期診斷試劑盒。為了實現(xiàn)上述問題，本發(fā)明提供的一種s100a12蛋白檢測試劑盒直接購于日本circulextm公司。所述的s100a12蛋白檢測試劑盒應(yīng)用于st段抬高型心肌梗死極早期診斷。所述的s100a12蛋白在st段抬高型心肌梗死患者早期診斷中的應(yīng)用，方法如下。步驟1、血漿的采集：研究對象入選后即刻抽取其靜脈血，用含edta真空抗凝管收集血標(biāo)本5ml；連續(xù)抽取發(fā)病小于2hstemi患者的靜脈血，采血時間點為stemi發(fā)病30min、1h、2h、4h、6h、12h、24h、3d、7d、30d共10個時間點。步驟2、樣本的處理：抽取靜脈血10分鐘內(nèi)，抗凝管3000轉(zhuǎn)/min離心處理10min，分離血漿，將處理好的血漿儲藏于-80℃冰箱保存，用s100a12elisa檢測試劑盒(購于日本circulextm公司)統(tǒng)一檢測入選研究對象血漿s100a12濃度；促凝管采集血標(biāo)本即刻送本院檢驗科，檢測其hsctnt、ck-mb及myo濃度。步驟3、elisa方法檢測血漿中s100a12表達含量：s100a12elisa檢測試劑盒(采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫試驗法)購于日本circulextm公司，檢測入選研究對象的血漿中s100a12濃度的變化，以實驗孔和副孔的平均值作為檢測對象的測定值。步驟4、數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理：按照試劑盒說明書配制s100a12標(biāo)準(zhǔn)品濃度，根據(jù)說明書要求按濃度梯度依次加入標(biāo)準(zhǔn)品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。步驟5、血漿心肌酶譜的檢測：用電化學(xué)發(fā)光法檢測入選對象血漿hsctnt和myo濃度，用酶法檢測入選對象血漿ck-mb活性。步驟6、急性心肌梗死患者血漿中s100a12的表達水平：結(jié)合其它診斷參數(shù)，根據(jù)測得的血漿中的s100a12的水平，與診斷臨界值比較，大于臨界值則診斷心肌梗死，小于臨界值則為非心肌梗死的患者。步驟7、免疫組織化學(xué)檢測s100a12在心源性猝死的患者冠狀動脈(尸檢標(biāo)本)的表達及stemi患者罪犯冠狀動脈內(nèi)血栓組織的表達。本發(fā)明的有益效果。本發(fā)明中，s100是新發(fā)現(xiàn)的鈣調(diào)節(jié)蛋白家族，其主要在中性粒細胞內(nèi)表達，并且在激活的單核巨噬細胞內(nèi)也有表達。s100a12是s100家族新發(fā)現(xiàn)的成員，s100a12分子量為12kd，主要由心肌細胞、血管壁動脈粥樣硬化的平滑細胞、血液中性粒細胞分泌，s100a12含有2個ef手型鈣離子結(jié)合區(qū)；在動脈粥樣硬化炎癥病灶處即斑塊內(nèi)中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞及內(nèi)皮細胞有大量s100a12表達，s100a12與其糖基化終產(chǎn)物受體結(jié)合，可引起細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子κb的表達上調(diào)，從而導(dǎo)致nf-κb介導(dǎo)的細胞因子的釋放，動脈粥樣硬化病變部位炎癥反應(yīng)的加劇；s100a12具有較強的趨化作用，趨化炎癥細胞游走到動脈粥樣硬化炎癥病變局部，并通過炎癥的級聯(lián)放大效應(yīng)引起炎性因子的釋放，介導(dǎo)并加強炎癥反應(yīng)和導(dǎo)致動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的形成；早發(fā)冠狀動脈疾病患者(不合并糖尿病)的外周血單個核細胞內(nèi)s100a12高表達，導(dǎo)致單個核細胞的不穩(wěn)定性增加，并促進單個核細胞轉(zhuǎn)化成巨噬細胞；猝死的糖尿病患者的冠狀動脈尸檢發(fā)現(xiàn)，患者的冠狀動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)s100a12大量表達，說明s100a12與動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的形成存在相關(guān)關(guān)系；急性心肌梗死的發(fā)病基礎(chǔ)是冠狀動脈內(nèi)粥樣硬化斑塊破裂和血栓形成，造成持久而嚴(yán)重的心肌缺血，導(dǎo)致心肌急性壞死，約90％-95％透壁性心肌梗死是由冠狀動脈斑塊破裂導(dǎo)致局部血栓形成所致。在猝死的冠狀動脈尸檢標(biāo)本中，我們發(fā)現(xiàn)冠狀動脈不穩(wěn)定斑塊破裂口處s100a12的表達明顯增強，同時在stemi患者罪犯血管的血栓標(biāo)本中s100a12表達明顯增強。因此，血漿s100a12可以在早期精確的診斷出st段抬高型心肌梗死疾病。附圖說明圖1為對照組、ua組、nstemi組及stemi組s100a12蛋白濃度變化。圖2為stemi患者血漿s100a12濃度的roc曲線。圖3為stemi患者發(fā)病后各生物標(biāo)記物血漿濃度的時相性改變；其中3-1為血漿s100a12濃度的時相性改變；3-2為myo濃度的時相性改變；3-3為ck-mb濃度的時相性改變；3-4為hsctnt濃度的時相性改變。圖4為s100a12與其它血漿生物標(biāo)記物在stemi發(fā)病后各時間點診斷stem的敏感性；其中4-1為血漿s100a12的敏感性；4-2為myo的敏感性；4-3為ck-mb的敏感性；4-4為hsctnt的敏感性。圖5為s100a12與其它血漿生物標(biāo)記物在stemi發(fā)病后各時間點診斷stemi的特異性；其中5-1為血漿s100a12的特異性；5-2為myo的特異性；5-3為ck-mb的特異性；5-4為hsctnt的特異性。圖6為s100a12在人正常冠狀動脈及心源性猝死患者冠狀動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的標(biāo)本中的表達；a、d、g正常人的冠狀動脈血管組織標(biāo)本；b、e、h、c、f、i猝死患者冠狀動脈血管組織標(biāo)本；a-f為he染色；g-i為免疫組化染色。圖7為s100a12在stemi患者罪犯冠狀動脈內(nèi)血栓組織標(biāo)本中的表達；a、d為健康人外周血凝塊組織；b、e為自身非罪犯冠狀動脈血凝塊組織；c、f為罪犯冠狀動脈內(nèi)血栓組織。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例1。本發(fā)明的研究基礎(chǔ)。1、酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測stemi患者血清s100a12表達變化。1.1、研究對象。連續(xù)入選2014年5月至2016年12月因胸痛就診并符合入選標(biāo)準(zhǔn)的研究對象共1050例，全部為沈陽軍區(qū)總醫(yī)院心血管內(nèi)科住院病人；其中男性820例，女性230例。根據(jù)美國心臟病學(xué)學(xué)會/歐洲心臟病學(xué)會診斷指南，將入選患者分為不穩(wěn)定型心絞痛組(unstableanginapectoris，ua)50例；非st段抬高型心肌梗死組(non-st-segmentelevationmyocardialinfarction，nstemi)50例；stemi組930例；冠狀動脈造影顯示左主干(lm)、左前降支(lad)、左回旋支(lcx)、右冠狀動脈(rca)中，任何一支心外膜下冠狀動脈均無任何狹窄者視為冠狀動脈正常，將其入選為正常對照組20例。1.2、入選標(biāo)準(zhǔn)。1.2.1、本研究經(jīng)沈陽軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意，研究中所有符合入選標(biāo)準(zhǔn)的研究對象均知情并簽署知情同意書。1.2.2、入選年齡35歲-75歲。1.2.3、正常對照組：因胸痛就診于胸痛中心，冠脈造影陰性，排除冠心病的患者。1.2.4、nstemi及ua組：根據(jù)世界衛(wèi)生組織ua的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：入院前48h內(nèi)心絞痛發(fā)作至少1次；缺血性胸痛時間≤30min；心電圖表現(xiàn)為st段水平型或下斜型壓低≥1mm或st段抬高(肢體導(dǎo)聯(lián)≥1mm，胸導(dǎo)聯(lián)≥2mm)，發(fā)作后st段又恢復(fù)到發(fā)作前的水平；無心肌壞死標(biāo)記物的改變。根據(jù)acc/esc診斷指南，nstemi的診斷標(biāo)準(zhǔn)：a:st-t的動態(tài)衍變持續(xù)時間較長往往超過24h(一過性心肌缺血發(fā)作的st-t改變常在數(shù)小時恢復(fù))；b:胸痛持續(xù)至少半小時以上，符合心肌梗死的胸痛特點；c:血清酶學(xué)的改變符合心肌梗死的變化規(guī)律和(或)血清肌鈣蛋白t或i升高不小于正常值的2倍以上，如有“a和c”或“b和c”兩條，即可診斷為nstemi。1.2.5、stemi組：患者出現(xiàn)持續(xù)30分鐘以上的典型胸痛癥狀；心電圖出現(xiàn)動態(tài)演變過程，至少兩個肢體導(dǎo)聯(lián)st段抬高≥0.1mv，或者胸導(dǎo)聯(lián)st段抬高≥0.2mv，或者新發(fā)的左束支傳導(dǎo)阻滯；血清心肌酶有動態(tài)變化。1.3、排除標(biāo)準(zhǔn)。患者患有以下疾?。夯顒有匝仔约膊?；自身免疫病；嚴(yán)重的心衰；血流動力學(xué)不穩(wěn)定；可疑心肌炎或心包炎；造血系統(tǒng)疾??；進展期腎臟或肝臟疾??；惡性腫瘤疾?。环妹庖咭种扑幬?；既往曾行冠狀動脈介入治療或冠狀動脈搭橋手術(shù)。1.4、實驗流程。1.4.1、胸痛患者就診即刻抽取靜脈血，按照入選標(biāo)準(zhǔn)、排除標(biāo)準(zhǔn)及冠狀動脈造影結(jié)果入選研究對象共1050例，并分為對照組20例、ua組50例、nstemi組50例及stemi組930例。1.4.2、從上述930例stemi患者中選出發(fā)病小于2h的stemi患者120例，并采集120例stemi患者發(fā)病后30min、1h、2h、4h、6h、12h、24h、3d、7d及30d共10個時間點的血漿樣品。同時將待檢的血樣送到檢驗科檢測患者血漿中s100a12、心肌酶hsctnt、ck-mb及肌紅蛋白(myoglobin，myo)的濃度表達變化。1.4.3、詢問研究對象病史，對其進行常規(guī)體格檢查及血常規(guī)、血液生化、血脂分析、肝腎功能等常規(guī)的臨床檢查。1.5、標(biāo)本的采集及樣本的處理。1.5.1、標(biāo)本的采集：入選1050例研究對象，入選后即刻抽取其靜脈血，用含edta真空抗凝管收集血標(biāo)本5ml；連續(xù)抽取120例發(fā)病小于2hstemi患者的靜脈血，采血時間點為stemi發(fā)病30min、1h、2h、4h、6h、12h、24h、3d、7d、30d共10個時間點，每個時間點抽取兩管血標(biāo)本。1.5.2、樣本的處理：抽取靜脈血10分鐘內(nèi)，抗凝管3000轉(zhuǎn)/min離心處理10min，分離血漿，將處理好的血漿儲藏于-80℃冰箱保存，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫試驗法(elisa法)檢測血漿s100a12濃度；促凝管采集血標(biāo)本，即刻送本院檢驗科，檢測其hsctnt、ck-mb及myo濃度。1.5.3、s100a12的測定：本研究所采用的s100a12elisa檢測試劑盒購置于日本circulextm公司，其組分如下(各組分的具體濃度和含量參見說明書)：洗滌緩沖液、稀釋緩沖液、s100a12標(biāo)準(zhǔn)品、20×辣根過氧化酶、底物、終止試劑；其檢測范圍為0-5000ng/ml，檢測靈敏度為56pg/ml，按樣本說明書進行下述具體操作：建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：按照試劑盒說明書配制s100a12標(biāo)準(zhǔn)品濃度，標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度分別為5000pg/ml、2500pg/ml、1250pg/ml、625pg/ml、313pg/ml、156pg/ml、78pg/ml、0pg/ml，根據(jù)說明書要求按濃度梯度依次加入標(biāo)準(zhǔn)品，每孔100μl。待測血漿標(biāo)本稀釋100倍后，取100μl加入反應(yīng)板孔內(nèi)，將反應(yīng)板置于室溫25℃1h后洗板。每孔加入酶標(biāo)抗體工作液100μl，將反應(yīng)板置于室溫25℃1h后洗板。每孔加入底物工作液100μl，室溫25℃避光孵育20min。每孔加入100μl終止液，混勻后，用450nm光波檢測od值。1.5.4、血漿心肌酶譜的檢測：用電化學(xué)發(fā)光法檢測入選對象血漿hstnt和myo濃度；用酶法檢測入選對象血漿ck-mb活性；正常值范圍為：tnt<0.05ng/ml；myo28-72ng/ml；ck-mb<25u/l。1.5.5、冠狀動脈造影檢查：入選的研究對象入院1周內(nèi)在沈陽軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科導(dǎo)管室接受冠狀動脈造影檢查。采用judkins法，選擇多體位行左右冠狀動脈造影。根據(jù)冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)，心外膜下冠狀動脈lm、lad、lcx、rca中任一支均無任何狹窄者視為完全正常，如直徑狹窄小于50％為無意義病理病變，如直徑狹窄大于50％為有病理意義的病變。由有經(jīng)驗的臨床醫(yī)師分別評估冠狀狹窄程度及冠脈病變支數(shù)，分為單支病變、雙支病變、三支病變。1.5.6、急診經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(pci)及pci前后用藥：急診pci時，原則上只干預(yù)梗死相關(guān)血管，對相關(guān)病變植入藥物洗脫支架(des)或金屬裸支架。所有擬行急診pci的患者術(shù)前嚼服阿司匹林300mg、氯吡格雷300-600mg；首先給予5000u的肝素，造影結(jié)束后如行pci手術(shù)需要按照70-100u/kg補足用量，術(shù)后均轉(zhuǎn)入冠心病監(jiān)護室進行監(jiān)護治療，給予皮下注射低分子肝素，每12h皮下給予1次(5-7d)；服用氯吡格雷75mg(1次/d)，并長期服用阿司匹林100mg(1次/d)。所有入選的研究對象均嚴(yán)格按照指南要求進行冠心病的二級預(yù)防。2、免疫組化方法檢測人冠狀動脈組織及stemi患者罪犯血管血栓抽吸標(biāo)本s100a12的表達變化。2.1、正常人冠狀動脈和心源性猝死患者的冠狀動脈標(biāo)本的收集。收集無cad病史，因意外死亡的年輕尸檢者冠狀動脈3例；同時收集生前有cad病史，心源性猝死患者的冠狀動脈標(biāo)本3例；冠狀動脈均在左冠狀動脈前降支根部取得，約1.5cm，截取為3段，每段約0.5cm；所有的冠狀動脈均放入10％多聚甲醛中固定；入選樣本均需經(jīng)過沈陽軍區(qū)總醫(yī)院倫理委員會同意，并簽署知情同意書。2.2、抽吸導(dǎo)管技術(shù)收集stemi患者罪犯冠狀動脈內(nèi)的血栓組織。入選stemi患者后，首先行冠狀動脈造影明確患者的罪犯病變血管，在導(dǎo)絲的指引下將血栓抽吸導(dǎo)管送至病變部位，反復(fù)抽吸4-6次直至血栓消失，血栓抽吸完成后直接在病變血管中置入支架，將一部分血栓組織放入4％多聚甲醛溶液中固定；另外一部分放至1.5mlep管中，-80℃保存?zhèn)溆?。入選樣本均需經(jīng)過沈陽軍區(qū)總醫(yī)院倫理委員會同意，并簽署知情同意書。2.3、體外實驗制備stemi患者非罪犯冠狀動脈的血凝塊。(1)收集冠脈造影陰性對照組的動脈血；同時收集stemi患者非罪犯冠狀動脈的動脈血2ml。(2)將500μl冠狀動脈血加到1.5mlep管中，加入20μl凝血酶溶液，充分混勻。(3)室溫放置2h，觀察血凝塊形成情況。(4)將一部分冠狀動脈血凝塊放到4％多聚甲醛溶液中固定，另外一部分放至1.5mlep管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?.4、石蠟切片的制備。取材：將stemi患者血栓組織及血凝塊組織放置4％多聚甲醛溶液中過夜，并修剪組織。脫水：具體順序如下：70％酒精2h-80％酒精2h-90％酒精2h-95％酒精i中4h-95％酒精ii中過夜-100％酒精i中1.5h-100％酒精ii中1.5h。透明：將組織塊放入二甲苯i中浸泡1h，取出后放入二甲苯ii中浸泡1h。浸蠟：具體順序如下：石蠟i中過夜-石蠟ii中1h-石蠟iii中1h。包埋：應(yīng)用石蠟對組織塊進行包埋，室溫放置。切片：使用石蠟切片機對組織塊進行切片，厚度為3μm，貼于載玻片上。烘片及烤片：將載玻片置于60℃烘片機上，放置1h；之后將載玻片放于65℃烤箱中，放置48h。2.5、組織he染色。切片脫蠟：具體順序如下：二甲苯i中20min-二甲苯ii中20min-95％酒精i中15min-95％酒精ii中15min-90％酒精10min-80％酒精5min-70％酒精5min-蒸餾水30min。細胞核染色：將石蠟切片放置蘇木素中染色10min，流水沖洗。分化：將石蠟切片放于1％鹽酸酒精中進行分化30s，流水沖洗。返藍：將石蠟切片放于氨水中進行細胞核返藍30s，流水沖洗。細胞質(zhì)染色：將石蠟切片放于水溶性伊紅溶液中染色5min，流水沖洗。透明：將石蠟切片放于80％酒精5min-90％酒精5min-100酒精i中5min-100％酒精ii中5min-二甲苯i中5min-二甲苯ii中5min。封片：將石蠟切片放于通風(fēng)櫥中晾干，應(yīng)用中性樹脂進行封片。2.6、組織免疫組織化學(xué)染色。(1)石蠟切片脫蠟：同he染色。(2)抗原修復(fù)：將石蠟切片放于200ml抗原修復(fù)液中，100℃煮40min，自然降溫。(3)滴加50μl試劑a至石蠟切片上，室溫孵育10min，pbs沖洗3次/5min。(4)滴加50μl試劑b至石蠟切片上，室溫孵育10min，去除血清。(5)滴加50μl稀釋后的一抗溶液至石蠟切片上(1:100稀釋，用pbs進行稀釋)，4℃孵育過夜。(6)次日將石蠟切片在室溫條件下進行復(fù)溫30min；pbs沖洗3次/5min。(7)滴加50μl試劑c溶液至石蠟切片上(1:100稀釋，用pbs進行稀釋)，室溫孵育10min；用pbs沖洗3次/5min。(8)滴加50μl試劑d溶液至石蠟切片上，室溫孵育10min；用pbs沖洗3次/5min。(9)應(yīng)用dab溶液進行顯色，顯微鏡下觀察染色效果。(10)細胞核染色，步驟同he染色。3、統(tǒng)計分析方法。采用spss19.0軟件包進行統(tǒng)計分析；統(tǒng)計檢驗均采用雙側(cè)檢驗，檢驗水準(zhǔn)為0.05；對各組的人口學(xué)信息和臨床變量進行統(tǒng)計；定量指標(biāo)采用均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用成組t檢驗或單變量anova進行組間比較；定性指標(biāo)采用例數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示；采用卡方檢驗或確切概率檢驗進行組間比較；依變量發(fā)生時間定義為：如發(fā)生終點事件，時間為stemi發(fā)病時間至終點事件發(fā)生的時間。多因素logistic回歸分析血漿s100a12濃度在stemi發(fā)病中的危險度。roc曲線分析血漿s100a12濃度診斷stemi的最佳臨界值、敏感性及特異性。兩組間比較，均采用雙側(cè)檢驗(two-sidetest)，取α＝0.05；p≤0.05者，認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義；所有可信區(qū)間的可信度采用95％。4、實驗結(jié)果。4.1、正常對照組、ua組、nstemi組及stemi組研究對象臨床基線資料及血漿s100a12濃度的比較：比較四組入選研究對象臨床基線資料顯示，年齡、性別、體重、血壓、心率、近期吸煙史、糖尿病史、卒中病史、心梗病史、載脂蛋白a、甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、血尿素氮、肌酐、血小板計數(shù)、血糖、hscrp、pro-bnp在四組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。而高血壓史、pci史、高密度脂蛋白膽固醇、白細胞計數(shù)、ck-mb峰值、hsctnt峰值及血漿s100a12濃度在四組研究對象間存在明顯差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)，詳見表1。表1對照組、ua組、nstemi組及stemi組一般臨床基線情況。注：1.連續(xù)正態(tài)分布變量用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；2.分類變量用例數(shù)(百分?jǐn)?shù)％)表示；3.ua：不穩(wěn)定性心絞痛；4.nstemi：急性非st段抬高型心肌梗死；5.stemi：急性st段抬高型心肌梗死；6.mi：心肌梗死；7.pci：經(jīng)皮冠狀動脈介入治療；8.apoa：載脂蛋白a；9.tg：甘油三酯；10.tc：總膽固醇；11.ldl-c：低密度脂蛋白膽固醇；12.hdl-c：高密度脂蛋白膽固醇；13.bun：尿素氮；14.crea：肌酐；15.wbc：白細胞計數(shù)；16.plt：血小板計數(shù)；17.ck-mb：肌酸激酶同工酶；18.hsctnt：超敏肌鈣蛋白t；19.hs-crp：超敏c反應(yīng)蛋白；20.pro-bnp：腦利鈉肽前體。結(jié)果表明，隨著心肌損傷程度的加重，白細胞計數(shù)、ck-mb峰值、hstnt峰值及血漿s100a12濃度逐漸升高；具有高血壓史、pci史的病例數(shù)逐漸增多；高密度脂蛋白膽固醇濃度則逐漸降低，說明這些因素與心肌損傷壞死的嚴(yán)重程度有一定相關(guān)關(guān)系。將stemi作為因變量，以高血壓史、pci病史、hdl-c、白細胞計數(shù)、ck-mb峰值、hsctnt峰值及血漿s100a12濃度作為協(xié)變量進行l(wèi)ogistic回歸分析，分析結(jié)果提示stemi患者血漿中s100a12濃度(or＝2.007，p＝0.009)及hsctnt峰值(or＝3.712，p＝0.034)是stemi發(fā)病的獨立危險因素，見表2。表2.二元logistic回歸分析與stemi相關(guān)的危險因素。or值95％cip值s100a122.0072.002-2.0120.009hsctnt3.7121.105-12.4720.034利用spearman’srho分析顯示stemi患者血漿中的s100a12表達水平與血漿中hsctnt濃度存在相關(guān)關(guān)系(or＝0.356，p＝0.000)，上述分析顯示stemi患者血漿中的s100a12濃度增高是stemi發(fā)生的獨立危險因素。結(jié)果顯示，入選的對照組、ua組、nstemi組及stemi組研究對象血漿中的s100a12濃度分別為135±75ng/ml、112±80ng/ml、144±70ng/ml及490±271ng/ml。stemi組研究對象血漿中s100a12濃度明顯高于正常對照組(p<0.000)、ua組(p<0.000)及nstemi組(p<0.000)，而在對照組、ua組及nstemi組3組間血漿s100a12濃度無統(tǒng)計學(xué)差異，見圖1，說明s100a12濃度變化與stemi的發(fā)生存在相關(guān)關(guān)系。4.2、血漿s100a12診斷stemi的最佳臨界值：通過比較930例stemi組患者與正常對照組、ua組、nstemi組患者血漿中的s100a12濃度變化，確定何種血漿s100a12濃度為診斷stemi的最佳臨界值。以正常對照組、ua組、nstemi組研究對象作為陰性參考群體，930例stemi患者作為陽性參考群體，繪制stemi患者血漿s100a12濃度的roc曲線，見圖2。結(jié)果顯示，血漿中的s100a12濃度為263.9ng/ml時，可作為診斷stemi的最佳臨界值，血漿中的s100a12診斷stemi發(fā)生的特異性為81.7％、敏感性為87％、auc為0.904，說明在以血漿中s100a12的濃度為263.9ng/ml作為最佳臨界值時，其診斷stemi的診斷效能較高。4.3、stemi發(fā)生時，血漿中s100a12及其他生物標(biāo)記物的時相性改變：收集stemi發(fā)病至就診時間小于2h的患者共120例，入選stemi患者的基本臨床資料，見表3。檢測stemi患者發(fā)病后不同時間點(30min、1h、2h、4h、6h、12h、24h、3d、7d、30d)血漿s100a12及心肌標(biāo)記物(myo、ck-mb及hsctnt)濃度及時相性的改變，見圖3。表3.120例發(fā)病2h內(nèi)stemi患者一般臨床基線情況。變量stemi(n＝120)變量stemi(n＝120)年齡,(y)56±12apoamg/l204±195男性,[n(％)]98(82)tgmmol/dl1.4±1.4體重,(kg)72±11tcmmol/dl4.9±1.0血壓(mmhg)127±21ldl-cmmol/dl3.2±0.8心率(bpm)83±18hdl-cmmol/dl1.1±0.2病史,[n(％)]-血糖mmol/dl8.6±3.8近期吸煙史77(64)bunmmol/dl5.7±1.5糖尿病病史12(10)creaumol/dl72.8±21.9高血壓病史58(48)wbc109/l12.1±3.5卒中病史10(8)plt109/l213±47mi病史5(4)ck-mb峰值u/l309±204pci史10(8)hstnt峰值ng/ml5.6±3.2生化指標(biāo)-hs-crpng/ml2.5±3.0--pro-bnppg/ml149±149注：1.連續(xù)正態(tài)分布變量用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；2.分類變量用例數(shù)(百分?jǐn)?shù)％)表示；3.stemi：急性st段抬高型心肌梗死；4.mi：心肌梗死；5.pci：經(jīng)皮冠狀動脈介入治療；6.apoa：載脂蛋白a；7.tg：甘油三酯；8.tc：總膽固醇；9.ldl-c：低密度脂蛋白膽固醇；10.hdl-c：高密度脂蛋白膽固醇；11.bun：尿素氮；12.crea：肌酐；13.wbc：白細胞計數(shù)；14.plt：血小板計數(shù)；15.ck-mb：肌酸激酶同工酶；16.hsctnt：超敏肌鈣蛋白t；17.hs-crp：超敏c反應(yīng)蛋白；18.pro-bnp：腦利鈉肽前體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)在入選的stemi患者中，s100a12在stemi發(fā)病30min血漿中的濃度明顯增高，發(fā)病1h-2h其血漿中s100a12濃度達到峰值，可持續(xù)至發(fā)病10h，而后s100a12血漿濃度開始下降，直到發(fā)病3d血漿s100a12濃度基本降至正常；myo濃度在stemi發(fā)病的1h-2h左右增高，發(fā)病4h其血漿中myo濃度達到峰值，可持續(xù)至發(fā)病12h，發(fā)病24h基本降至正常范圍；ck-mb在stemi發(fā)病4h血漿中的濃度明顯增高，發(fā)病10h-12h其血漿中ck-mb濃度達到峰值，可持續(xù)至發(fā)病24h，而后ck-mb血漿濃度開始下降，直到發(fā)病3d血漿ck-mb濃度基本降至正常；hsctnt在stemi發(fā)病1h-2h血漿中的濃度明顯增高，發(fā)病12h-24h血漿hsctnt濃度達到峰值，可持續(xù)至發(fā)病7d-10d，而后hsctnt血漿濃度開始下降，直到發(fā)病30d血漿myo濃度基本降至正常。在stemi發(fā)病的早期，血漿s100a12濃度升高較經(jīng)典的心肌酶學(xué)標(biāo)志物出現(xiàn)的更早。以血漿中s100a12濃度263.9ng/ml作為stemi的最佳診斷臨界值(myo、ck-mb及hsctnt診斷stemi的最佳界值分別為72ng/ml、25u/l、0.05ng/ml)。以入選的正常對照組、ua組、nstemi組研究對象作為陰性參考群體，stemi患者作為陽性參考群體，分別繪制stemi患者發(fā)病后30min、1h、2h、4h、6h血漿s100a12、myo、ck-mb及hsctnt的roc曲線，見圖4和圖5。通過roc曲線分析結(jié)果顯示，在stemi發(fā)病后30min，血漿s100a12、myo、ck-mb及hsctnt診斷stemi的敏感性分別為76.3％、35％、1.8％、30.3％，特異性分別為84％、21％、80.4％、59.3％；在stemi發(fā)病后1h，血漿s100a12、myo、ck-mb及hsctnt診斷stemi的敏感性分別為80％、39％、10％、33％，特異性分別為85.3％、23％、82.6％、58.6％，均以s100a12為最高；在stemi發(fā)病后2h，血漿s100a12、myo、ck-mb及hstnt診斷stemi的敏感性分別為80％、61％、14.5％、39.7％，特異性分別為85.5％、24％、84.2％、59.6％，均以s100a12為最高；在stemi發(fā)病后4h，血漿中的s100a12、myo、ck-mb及hsctnt診斷stemi的敏感性分別為81.8％、78％、33％、61％，特異性分別為82.1％、40％、80％、59.6％，均以s100a12為最高；在stemi發(fā)病后6h，血漿中的s100a12、myo、ck-mb及hsctnt診斷stemi的敏感性分別為82％、92.5％、72.2％、86.7％，特異性分別為84％、56％、80.9％、60％，s100a12的綜合診斷優(yōu)勢仍為最高。上述研究結(jié)果顯示在stemi發(fā)病小于2h內(nèi)，尤其在stemi發(fā)病極早期(<30min)，s100a12診斷stemi的敏感性明顯優(yōu)于經(jīng)典的心肌生化標(biāo)注物，特異性與經(jīng)典的心肌酶學(xué)標(biāo)志物相當(dāng)；而在stemi發(fā)病4h、6h這兩個時間點，s100a12診斷stemi的敏感性和特異性均與經(jīng)典的心肌酶學(xué)標(biāo)志物相當(dāng)。免疫組化檢測正常人冠狀動脈和心源性猝死患者的冠狀動脈組織中s100a12的表達：he染色結(jié)果顯示，正常的冠狀動脈血管中s100a12的表達水平較低，在心源性猝死患者的冠狀動脈血管組織中可以看到s100a12的表達明顯高于正常的冠狀動脈血管組織標(biāo)本。在猝死患者冠狀動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊破裂口周圍、粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊薄的纖維帽下的血管壁組織中s100a12大量表達，故在急性心肌梗死發(fā)生即刻斑塊組織中的s100a12大量釋放到患者的血漿中，因此，在急性心肌梗死發(fā)病的極早期，由于斑塊組織破裂導(dǎo)致s100a12的大量釋放，導(dǎo)致急性心肌梗死患者血清中s100a12表達增高，見圖6。免疫組織化學(xué)檢測s100a12在stemi患者罪犯冠狀動脈內(nèi)血栓組織的表達：he染色結(jié)果提示，罪犯冠狀動脈內(nèi)血栓組織的成分主要包括紅細胞、炎癥細胞、血小板和纖維蛋白等成分，而體外凝集的非罪犯冠狀動脈血凝塊的成分主要為紅細胞和纖維蛋白，血小板及炎癥細胞的含量較少。免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)ccl2及ccr2在stemi患者罪犯冠狀動脈內(nèi)血栓組織的表達明顯高于自身冠狀動脈血凝塊。在急性心肌梗死的患者的冠狀動脈血栓中s100a12的表達明顯高于正常血凝塊標(biāo)本、自身非罪犯冠狀動脈血凝塊組織，說明在急性心肌梗死的極早期，冠狀動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊破裂釋放大量的s100a12入血導(dǎo)致在急性心肌梗死的極早期，在急性心肌梗死患者的血清中檢測到s100a12的高表達，免疫組織化學(xué)顯示stemi患者罪犯冠狀動脈內(nèi)血栓組織標(biāo)本的中性粒細胞(mpo陽性)中的s100a12表達明顯增高，見圖7。序列表<110>中國人民解放軍沈陽軍區(qū)總醫(yī)院<120>血漿s100a12在st段抬高型心肌梗死早期診斷中的應(yīng)用<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>92<212>prt<213>人工合成metthrlysleuglugluhisleugluglyilevalasnilephehisglntyrserval15101520arglysglyhispheaspthrleuserlysglygluleulysglnleuleuthrlysglu2125303540leualaasnthrilelysasnilelysasplysalavalileaspgluilepheglngly4145505560leuaspalaasnglnaspgluglnvalasppheglnglupheileserleuvalalaile6165707580alaleulysalaalahistyrhisthrhislysglu81859092當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12