本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)工程和農(nóng)作物抗病遺傳育種領(lǐng)域，具體地說，涉及一種與大豆抗疫病基因rpshc18共分離的分子標記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

由大豆疫霉(phytophthorasojaekaufmann&gerdemann)引起的大豆疫病是大豆生產(chǎn)中的一種毀滅性病害。該病已在我國黑龍江省、安徽、福建、吉林、新疆等省份發(fā)生。大豆疫霉在大豆所有生育期均可以侵染大豆，引起根腐、莖腐、植株矮化、枯萎和死亡，一般田塊減產(chǎn)10％-30％，嚴重地塊可達60％-90％，甚至造成絕產(chǎn)。目前全世界每年因大豆疫病造成的經(jīng)濟損失大約為10億美元(tyler,2007)。

防治大豆疫病最為經(jīng)濟、有效且環(huán)境安全的方法是種植抗病品種。目前，國內(nèi)外共發(fā)現(xiàn)了28個大豆抗疫病基因(rps)，分布于9個不同的大豆染色體上。rps1、rps7、rps9、rpsyd25、rpsyd29、rpsun1和therpsgeneincultivar‘waseshiroge’被定位在第3號染色體上，其中rps1位點具有5個等位基因分別為rps1a，rps1b，rps1c，rps1d和rps1k(demirbasetal.,2001；wengetal.,2001；gaoetal.,2005；范愛穎等,2009；sugimotoetal.,2011；sunetal.,2010；wuetal.,2011a；linetal.,2013；zhangetal.,2013a)。rps2和rpsun2被鑒定在第16號染色體上(demirbasetal.,2001；linetal.,2013)。rps3、rps8和rpssn10被定位在大豆13號染色體上，并且在rps3位點存在3個等位基因rps3a，rps3b和rps3c(demirbasetal.,2001；sandhuetal.,2005；gordonetal.,2006；yuetal.,2010)。rps4，rps5，rps6，rpsjs,rps12被定位在18號染色體上(demirbasetal.,2001；sandhuetal.,2005；sunetal.,2014；sahooetal.,2017)。而另外5個抗病基因rpszs18、rpsyb30、rpssu、rps10和rps11分別定位在2、19、10、17和7號染色體上(zhuetal.,2007；wuetal.,2011b；zhangetal.,2013b；pingetal.,2015)。大豆疫霉群體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，容易產(chǎn)生新的毒力型。一般認為大豆抗疫病基因的使用壽命為10-15年，但是新的抗病基因被淘汰的速度正在加快。因此有必要大力挖掘和利用新的抗病基因，并進行抗病基因的累加，培育抗性持久的大豆品種。

隨著測序技術(shù)的發(fā)展，snp和indel等多態(tài)性更強的分子標記被開發(fā)并且應(yīng)用到基因的定位中。大豆全基因組測序的完成為大豆基因的精細定位、克隆以及功能標記的開發(fā)提供了便利。極端群體混池測序技術(shù)(bsa-seq)具有高效，節(jié)省時間和人力，并且能夠大量的發(fā)掘目標區(qū)域中的snp等優(yōu)點，已經(jīng)應(yīng)用多種不同性狀基因的發(fā)掘、定位和功能標記的開發(fā)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一個與大豆抗疫病基因rpshc18緊密連鎖的分子標記及其應(yīng)用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本研究發(fā)明了一個與大豆抗疫病基因rpshc18緊密連鎖的分子標記caps1516，所述分子標記位于大豆3號染色體的ssr標記barcsoyssr_03_0269和barcsoyssr_03_0272之間，并且位于rpshc18候選基因內(nèi)部。

所述分子標記的核苷酸序列如seqidno.1所示，該標記片段大小為541bp。

本發(fā)明還提供了用于特異性pcr擴增分子標記caps1516的引物對，包括：

上游引物f:5'-aagtgcaacggactgccttt-3’；

下游引物r：5'-catcagggttgtccaggaatga-3'。

分子標記caps1516與基因rpshc18的遺傳距離為0cm。

pcr擴增使用的退火溫度為58.4℃，擴增產(chǎn)物大小為541bp，用于特異性切割rpshc18擴增片段的限制性內(nèi)切酶為bcli。

本發(fā)明還提供所述分子標記caps1516在鑒定抗疫病大豆品種中的應(yīng)用，包括以下步驟：

1)提取待測大豆的基因組dna

2)以待測大豆的基因組dna為模板，利用上述引物f和r，進行pcr擴增反應(yīng)；

3)檢測pcr擴增產(chǎn)物，如果能夠擴增出541bp的產(chǎn)物，并且能夠被限制性內(nèi)切酶bcli切割為一個69bp和472bp的兩個片段，則判定待測大豆品種含有抗疫病基因rpshc18。

其中，pcr擴增反應(yīng)使用的擴增體系以10μl計為：大豆基因組dna模板濃度2ng/μl，2×pcrmastermix(tiangen)4μl，引物f和r各0.2μmol/l，用ddh2o補足至10μl。

pcr擴增反應(yīng)使用的反應(yīng)條件為：95℃3分鐘；94℃45秒，58.4℃45秒，72℃45秒，共40個循環(huán)；72℃10分鐘。

本發(fā)明還提供用于檢測抗疫病大豆的pcr試劑盒，所述試劑盒中含有上述用于特異性pcr擴增分子標記caps1516的引物對與限制性內(nèi)切酶bcli。還包括dntps、taqdna聚合酶、mg²⁺、pcr反應(yīng)緩沖液、限制性內(nèi)切酶標準陽性模板中的一種或多種。

本發(fā)明進一步提供所述分子標記caps1516在大豆抗疫病分子育種中的應(yīng)用。

具體地，本發(fā)明的與大豆抗疫病基因rpshc18共分離的分子標記通過如下方法獲得：

本研究以抗疫病品種華春18為父本、感病品種吉科豆2號為母本雜交產(chǎn)生的177個f2:3家系為作圖群體。采用下胚軸創(chuàng)傷接種法選取不同毒力的大豆疫霉分離物psjs2和psmc1進行群體表型鑒定。選擇純合抗病和感病家系各20個進行極端群體混池測序分析，將該基因定位于大豆3號染色體上767kb的區(qū)域，并對候選區(qū)域內(nèi)的基因進行功能注釋。

使用ssr標記和indel標記對177家系進行基因型鑒定，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，將rpshc18進一步精細定位在147kb的區(qū)域中，位于indel標記indelhj22和ssr標記barcsoyssr_03_0272之間。根據(jù)測序結(jié)果，在這個區(qū)間中僅有兩個nbs-lrr基因含有非同義突變的snp位點。其中一個位于基因rpshc18-nbl2(參考基因組中模型：glyma03g04590)的snp含有限制性酶切位點，被開發(fā)成caps標記，并進行群體驗證，獲得與基因rpshc18共分離的標記。

具體實施方案：

(1)華春18的抗性遺傳分析

以抗病品種華春為父本，感病品種吉科豆2號作為母本，雜交產(chǎn)生f1代，f1代自交產(chǎn)生f2代，f2代自交產(chǎn)生的177個f2：3家系的抗性遺傳分析、抗病基因鑒定及作圖群體。采用下胚軸創(chuàng)傷接種方法，每個家系鑒定：25-30個植株對大豆疫霉分離物psjs2和psmc1的反應(yīng)進行抗性遺傳分析。接種后在24℃，濕度為100％的條件下，保濕48小時，然后傳入溫室培養(yǎng)，4天后進行病情調(diào)查。參照gordon等(2006)方法評價標準，調(diào)查f3家系的抗病、分離、感病家系的分離比，研究華春18對大豆疫病的抗性遺傳規(guī)律。

(2)基因dna的提取和極端群體混池測序

采用tiangen植物基因組提取試劑盒提取2個親本及177個f2單株的基因組dna。將20個純和抗病和20個純和感病的家系分別等量混合進行極端群體混池測序分析，具體分析方法參照(takagietal.2013)。獲得華春18中抗疫病基因的候選區(qū)域。

(3)利用ssr標記定位華春18的抗病基因

根據(jù)混池測序分析的結(jié)果，首先采用ssr標記對混池測序分析抗病基因定位結(jié)果進行驗證。選用目前已經(jīng)公布的位于混池測序分析獲得的候選區(qū)域內(nèi)部及其附近的ssr標記進行親本間多態(tài)性分析，具有多態(tài)性ssr標記再用于群體的基因型鑒定。用mapmaker3.0軟件分析ssr標記與抗病基因的連鎖關(guān)系。使用mapdraw軟件構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，獲得新的定位區(qū)間。pcr反應(yīng)體系為10μl，含有2×taqpcrmastermix(tiangen)4μl，上、下游引物各0.2μmol/l，模板dna濃度為2ng/μl，用ddh2o補足至10μl。

pcr反應(yīng)擴增程序：95℃預(yù)變性3分鐘；94℃變性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸45秒，共35個循環(huán)；72℃10分鐘，10℃保存。擴增產(chǎn)物在8-12％聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳和分析。

(4)indel標記群體驗證及候選基因的發(fā)掘

基于遺傳連鎖圖譜結(jié)果，獲得含有rpshc18的在參考基因組上的物理位置，結(jié)合親本的基因組測序結(jié)果，發(fā)掘該區(qū)間內(nèi)indel位點。根據(jù)indel位點上下游200bp的序列設(shè)計引物，開發(fā)indel標記，用來鑒定177個家系在ssr定位區(qū)間內(nèi)的重組位置，從而進一步縮小定位區(qū)間。在縮小后的定位區(qū)間中，查找含有非同義突變snp及indel的基因，并將這些基因作為rpshc18候選的抗疫病基因。

(5)基于rpshc18候選基因的特異性標記的開發(fā)及驗證

引起非同義突變的snp用于開發(fā)成特異性檢測rpshc18的caps標記，caps標記的開發(fā)方法參照thiel等(2004)的方法，使用premier5.0設(shè)計引物用于擴增抗病品種華春18和感病品種吉科豆2號的非同義snp兩側(cè)序列。將抗、感親本的pcr產(chǎn)物進行測序并且發(fā)掘各自的酶切位點，通過對比獲得華春18特有的酶切位點。再用對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶bcli切割抗感品種擴增出的片段。能夠被切割的說明含有rpshc18。將含有已知抗疫病基因的20個大豆品種按上述方法進行目標區(qū)域的pcr擴增，并且酶切，若只有華春18的片段能夠被酶切，說明該標記為rpshc18的特異性標記。

大豆疫病是大豆生產(chǎn)過程中的一種毀滅性病害。本發(fā)明利用bsa全基因組混池測序性狀定位以及ssr和indel分子標記作圖方法，對大豆抗疫病基因rpshc18進行精細定位，并發(fā)現(xiàn)其共分離和緊密連鎖的分子標記。該抗病基因?qū)Υ蠖挂呙咕哂袕V譜抗性，可有效控制我國大豆疫病的發(fā)生，減輕該病害造成的產(chǎn)量損失。

利用與該基因共分離的caps分子標記caps1516，可有效應(yīng)用到分子標記輔助育種中，克服常規(guī)育種方法所需周期長的缺點；基于pcr技術(shù)，在室內(nèi)對大豆資源進行抗性分析抗疫病基因鑒定；同時為克隆該rpshc18基因奠定基礎(chǔ)，這對進一步了解該基因的分子遺傳學(xué)機理具有重要意義，在大豆生產(chǎn)實踐、育種工作和抗病理論研究中具有重要的價值。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：

(一)本發(fā)明對3號染色體上發(fā)現(xiàn)的新的大豆抗疫病基因rpshc18進行了精細定位。該基因?qū)ξ覈蠖挂呙咕哂袕V譜抗性，可有效控制我國大豆疫病的發(fā)生，減輕該病害造成的產(chǎn)量損失。

(二)本發(fā)明提供的與抗疫病基因rpshc18共分離的分子標記caps1516，是在華春18及其抗性穩(wěn)定的雜交后代家系中獲得的分子標記，并進行了有效性驗證?？捎糜诳勾蠖挂卟≠Y源鑒定和抗大豆疫病后代的分子標記輔助育種。

(三)本發(fā)明提供的與抗疫病基因rpshc18共分離的分子標記caps1516，為該基因的克隆和測序奠定基礎(chǔ)，從而明確該序列信息的結(jié)構(gòu)特征。另外，根據(jù)共分離的分子標記和大豆基因組序列信息，進行該基因的單倍型分析，有望克隆獲得新的抗疫病基因。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中華春18(左)和吉科豆2號(右)接種大豆疫霉4天后的調(diào)查結(jié)果，其中，a為接種菌株psmc1的結(jié)果，b為接種菌株psjs2的結(jié)果。

圖2為基于極端群體全基因組混池測序分析的delta-snp-index結(jié)果。

圖3為本發(fā)明實施例1中大豆抗疫病基因rpshc18遺傳連鎖圖譜。

圖4為本發(fā)明caps1516在抗病，雜合和感病家系不同分子帶型，以及與含有不同抗疫病基因的材料鑒定后不同帶型的比較。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。

實施例1大豆抗疫病基因rpshc18特異性分子標記caps1516的獲得

1、華春18的抗性遺傳分析

以抗病品種華春為父本，感病品種吉科豆2號作為母本，雜交產(chǎn)生f1代，f1代自交產(chǎn)生f2代，f2代自交產(chǎn)生的188個f2：3家系的抗性遺傳分析、抗病基因鑒定及作圖群體。采用下胚軸創(chuàng)傷接種方法，每個家系鑒定:25-30個植株對大豆疫霉分離物psjs2和psmc1的反應(yīng)進行抗性遺傳分析。接種后在24℃，濕度為100％的條件下，保濕48小時，然后傳入溫室培養(yǎng)，4天后進行病情調(diào)查(圖1)。參照gordon等(2006)方法評價標準，調(diào)查f3家系的抗病、分離、感病家系的分離比，研究華春18對大豆疫病的抗性遺傳規(guī)律。

吉科豆2號與華春18雜交組合衍生的177個f2:3家系對分離物psjs2和psmc1的反應(yīng)一致，純和抗病家系為47個，純和感病家系為50個，雜合型家系為80個。經(jīng)x²檢驗符合期望的1:2:1的分離比例。

(2)基因dna的提取和極端群體混池測序

采用tiangen植物基因組提取試劑盒提取2個親本及177個f2:3家系f2單株的基因組dna。將20個純和抗病和20個純和感病的家系分別等量混合進行極端群體混池測序分析，具體分析方法參照(takagietal.2013)。獲得華春18中抗疫病基因的候選區(qū)域。

通過混池測序分析，抗池、感池以及抗病和感病親本通過比對共發(fā)現(xiàn)了3780800個snp及indel位點。通過計算delta-snp-index的數(shù)值來確定抗病基因的候選區(qū)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)位于大豆3號染色體上的堿基位置4152795與4919481之間的767kb的區(qū)域平均delta-snp-index大于0.9。因此我們推測這一區(qū)域為抗疫病基因的候選區(qū)域(圖2)。

(3)利用ssr標記定位華春18的抗病基因

根據(jù)混池測序分析的結(jié)果，首先采用ssr標記對混池測序分析結(jié)果進行驗證。選用目前已經(jīng)公布的位于混池測序分析候選區(qū)域內(nèi)部及其附近的ssr標記。用mapmaker3.0軟件分析ssr標記與抗病基因的連鎖關(guān)系。使用mapdraw軟件構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，獲得新的定位區(qū)間。pcr反應(yīng)體系為10μl，含有2×taqpcrmastermix(tiangen)4μl，上、下游引物各0.2μmol/l，模板dna濃度為2ng/μl，用ddh2o補足至10μl。

pcr反應(yīng)擴增程序：95℃預(yù)變性3分鐘；94℃變性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸45秒，共35個循環(huán)；72℃10分鐘，10℃保存。擴增產(chǎn)物在8-12％聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳和分析。

在新設(shè)計的145對ssr中通過親本篩選和群體驗證。有16對在群體中具有多態(tài)性。其中16個標記在群體中均呈現(xiàn)1:2:1的分布。使用mapmaker3.0軟件分析表明，這16對多態(tài)性ssr引物與rpshc18均連鎖。使用mapdraw軟件繪制遺傳連鎖圖譜，rpshc18被定位在標記barcsoyssr_03_0254(0.3cm)和barcsoyssr_03_0272(0.5cm)之間，同時與ssr標記barcsoyssr_03_0267和barcsoyssr_03_0269共分離，與rpshc18的遺傳距離為0cm(圖3a)。

(4)indel標記群體驗證及候選基因的發(fā)掘

基于遺傳連鎖圖譜結(jié)果，獲得含有rpshc18的在參考基因組上的物理位置，結(jié)合基因組測序結(jié)果，發(fā)掘該區(qū)間的snp以及indel位點，并切根據(jù)這些snp和indel位于基因的位置進行注釋，包括5’-utr，3’-utr，外顯子,基因上游1000bp，基因下游1000bp，內(nèi)含子，非編碼rna或者其他類型。根據(jù)indel位點上下游200bp的序列設(shè)計引物，共開發(fā)了28個indel標記，用來鑒定177個家系在ssr定位區(qū)間內(nèi)的重組位置，從而進一步縮小定位區(qū)間。在縮小后的定位區(qū)間中，查找含有非同義突變snp及indel的基因，并將這些基因作為候選的抗疫病基因。

通過ssr標記將rpshc18的物理位置定位在3號染色體的barcsoyssr_03_0254(0.3cm)和barcsoyssr_03_0272(0.5cm)之間的295kb的物理距離?；诳垢杏H本及混池測序結(jié)果，在這一區(qū)間中共存在1949個snps及indels位點，但是僅有35個位點為非同義突變位點，分別位于5個不同基因中(表1)。將28個indel標記進行親本的多態(tài)性篩選及親本驗證，11個在親本及群體上具有多態(tài)性。其中3個標記與抗病基因rpshc18共分離(圖3b)。indel標記indelhj22與ssr標記barcsoyssr_03_0272之間組成了一個147kb的‘共分離’區(qū)域，在這個區(qū)域中僅存在兩個非同義突變的基因，并且均為抗病基因結(jié)構(gòu)，分別為rpshc18-nbl1(genemodelglyma03g04560)和rpshc18-nbl2(genemodelglyma03g04590)。于是這兩個基因被推測為抗病rpshc18的候選基因。

(5)基于rpshc18候選基因特異性標記的開發(fā)及驗證

引起非同義突變的snp用于開發(fā)成特異性檢測rpshc18的caps標記，caps標記的開發(fā)方法參照thiel等(2004)的方法，使用premier5.0設(shè)計引物用于擴增抗病品種華春18和感病品種吉科豆2號的非同義snp兩側(cè)序列。將pcr產(chǎn)物進行測序并且發(fā)掘各自的酶切位點，通過對比獲得華春18特有的酶切位點。再用對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切割抗感品種擴增出的片段。能夠被切割的說明含有rpshc18。將含有抗疫病基因的20個大豆品種按上述方法進行目標區(qū)域的pcr擴增，并且酶切，若只有華春18的片段能夠被酶切，說明該標記為rpshc18的特異性標記。

通過對抗病候選基因中的snp位點進行兩側(cè)片段的pcr擴增及酶切位點的發(fā)掘，僅在候選基因rpshc18-nbl2發(fā)現(xiàn)了一個snp位點a→t構(gòu)成了限制性內(nèi)切酶位點bcli。用于有效擴增caps標記caps1516的引物對為5'-aagtgcaacggactgccttt-3’/5'-catcagggttgtccaggaatga-3'，擴增產(chǎn)物為541bp，通過限制性內(nèi)切酶切割兩小時后，抗病親本及抗病家系pcr產(chǎn)物能夠被切割成兩個片段，大小分別為69bp和472bp，而對應(yīng)的感病親本及感病家系的pcr產(chǎn)物由于不存在相應(yīng)的酶切位點而不能被切割，仍然只有541bp的一條帶，而雜合家系則產(chǎn)生3條不同帶型，分別為69bp、472bp和541bp。將caps標記在20個含有不同抗疫病基因的大豆品種及兩個感病對照品種中進行驗證發(fā)現(xiàn)，僅有華春18對應(yīng)的條帶能夠被酶切，說明該標記為rpshc18的特異性標記(圖4)。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

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<120>與大豆抗疫病基因緊密連鎖的分子標記caps1516及其應(yīng)用

<130>khp171110867.2tq

<160>3

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