本發(fā)明涉及免疫磁珠的制備領(lǐng)域，具體地說是一種CD133、CD24、CD44多重抗體免疫磁珠及其制備方法。
背景技術(shù)：
癌癥干細(xì)胞(CSC)又稱癌干細(xì)胞、癌癥干細(xì)胞，是指具有干細(xì)胞的自我復(fù)制及多細(xì)胞分化性質(zhì)的腫瘤細(xì)胞，可以作為腫瘤細(xì)胞侵襲力判斷的標(biāo)志。通常這類的細(xì)胞被認(rèn)為有形成腫瘤，發(fā)展成癌癥的潛力，特別是隨著癌癥轉(zhuǎn)移出去后，產(chǎn)生新型癌癥的來源。癌癥干細(xì)胞自我更新的特性是造成腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良的主要原因。癌癥干細(xì)胞內(nèi)部復(fù)雜的機制能夠解釋癌癥耐藥性以及很多典型的腫瘤的行為。癌癥發(fā)生的細(xì)胞假說就是指有一小部分亞群的腫瘤細(xì)胞有干細(xì)胞的特質(zhì)，有能力產(chǎn)生新的腫瘤。癌癥干細(xì)胞不僅能誘導(dǎo)原發(fā)腫瘤的形成，還是引起腫瘤化療和放射治療后復(fù)發(fā)的關(guān)鍵誘因。癌干細(xì)胞存在于癌細(xì)胞中，由于存在數(shù)量極少，因此很難被發(fā)現(xiàn)和捕獲。
針對不同來源的腫瘤，癌癥干細(xì)胞表面的生物標(biāo)志物不盡相同。其中，CD133、CD24和CD44都是癌癥干細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)識物。它們的表達(dá)不僅在癌癥細(xì)胞系中被發(fā)現(xiàn)，而且在宮頸癌、前列腺癌、頭頸癌、肝臟腫瘤、腦癌、乳腺癌、肺癌等癌癥患者的組織中均有發(fā)現(xiàn)。
免疫磁珠分選法(Immunomagnetic separation，IMS)是近年來興起的一種用于細(xì)胞分選的方法，它是在磁珠表面包被具免疫反應(yīng)性的抗體進行抗原-抗體反應(yīng)，在細(xì)胞表面形成“抗原-抗體-磁珠”免疫復(fù)合物。這些結(jié)合了磁珠的細(xì)胞一旦置于強大的磁場下，就會定向移動，使免疫復(fù)合物與其他未被結(jié)合的細(xì)胞分群。當(dāng)具超順磁性的磁珠脫離磁場后，磁性立即消失，從而達(dá)到陽性或陰性選擇特定細(xì)胞的目的。
將免疫磁珠分選法應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞的分選是本領(lǐng)域近年來興起的技術(shù)。但是利用免疫磁珠分選法從血液復(fù)雜的環(huán)境中分選出腫瘤細(xì)胞，需要免疫磁珠具有特異性的生物標(biāo)志物，而且穩(wěn)定性、分散性好，不能團聚。并且多標(biāo)志物抗體的聯(lián)合應(yīng)用可有效提高檢測敏感性和特異性(Journal of the National Cancer Institute,2009,101(1):61-66)。同時，免疫磁珠的粒徑不能過大，過大會壓迫腫瘤細(xì)胞；免疫磁珠的粒徑也不能過小，粒徑過小磁響應(yīng)性也小，容易無法達(dá)到腫瘤細(xì)胞分選的效果。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的主要目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足提供一種CD133、CD24、CD44多重抗體免疫磁珠，磁珠粒徑小，磁響應(yīng)性好，用本發(fā)明的免疫磁珠進行癌癥干腫瘤細(xì)胞捕獲，不僅捕獲效率高，靈敏性高，富集時間短，而且捕獲的癌癥干細(xì)胞準(zhǔn)確有效，同時多重免疫磁珠的制備過程簡單，成本低。
在本發(fā)明的一方面，本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：一種CD133、CD24、CD44多重抗體免疫磁珠，所述多重抗體免疫磁珠由CD133免疫磁珠、CD24免疫磁珠和CD44免疫磁珠組成，其中CD133免疫磁珠、CD24免疫磁珠和CD44免疫磁珠分別為CD133抗體、CD24抗體和CD44抗體和磁性微球偶聯(lián)得到的免疫磁珠。
進一步的，所述CD133免疫磁珠、CD24免疫磁珠和CD44免疫磁珠的結(jié)構(gòu)式為：A-NH-N＝CH-B，其中A表示磁性微球，B表示CD133、CD24、CD44抗體，或者A表示CD133、CD24、CD44抗體，B表示磁性微球。
優(yōu)選的，所述磁性微球為核殼結(jié)構(gòu)的無機或有機高分子包裹的磁性微球。比如二氧化硅包裹的磁性四氧化三鐵、或者葡聚糖包裹的磁性四氧化三鐵等。最優(yōu)選的，所述磁性微球為二氧化硅包裹的磁性四氧化三鐵。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種制備上述CD133、CD24、CD44多重抗體免疫磁珠的方法，其步驟包括：
s1.磁性納米簇的制備；
s2.氨基修飾的磁性微球的制備；
s3.肼基修飾的A部分的制備；
s4.醛基修飾的B部分的制備；
s5.免疫磁珠的制備：將步驟s3所述肼基修飾的A部分與步驟s4所述醛基修飾的B部分混合，在4～25℃下進行偶聯(lián)反應(yīng)2～24小時，得到CD133免疫磁珠、CD24免疫磁珠和CD44免疫磁珠。
在本發(fā)明的一種實施方式中，對氨基修飾的磁性微球進行醛基修飾，并且對CD133抗體、CD24抗體和CD44抗體分別進行肼基修飾?；蛘邔Π被揎椀拇判晕⑶蜻M行肼基修飾，并且對CD133抗體、CD24抗體和CD44抗體分別進行醛基修飾，均可以實現(xiàn)上述結(jié)構(gòu)的免疫磁珠。
進一步的，所述步驟s3中的肼基修飾的A部分是通過：將氨基修飾的磁性微球或抗體用摩爾當(dāng)量為10～50倍的SANH進行肼基修飾后得到的。所述SANH為對-丙腙基吡啶甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(CAS：362522-50-7)，在室溫條件下可以溫和的將氨基轉(zhuǎn)換為肼基。所述SANH一般溶解在DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶液中進行反應(yīng)，濃度可以根據(jù)磁性微球部分或抗體部分的濃度進行調(diào)整，不影響反應(yīng)結(jié)果。該反應(yīng)過程可以在15～25℃室溫條件下進行，反應(yīng)時間根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)的檢測技術(shù)判斷，本發(fā)明一般采用對磁珠部分的修飾反應(yīng)時間16～24h，對抗體部分的修飾反應(yīng)時間2～4h。
進一步的，所述步驟s4中的醛基修飾的B部分是通過：將氨基修飾的磁性微球或抗體用摩爾當(dāng)量為5～20倍的SFB進行醛基修飾后得到的。所述SFB為4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亞胺酯(CAS：60444-78-2)，在室溫條件下可以溫和的將氨基轉(zhuǎn)換為醛基。所述SFB一般溶解在DMF溶液中進行反應(yīng)，濃度可以根據(jù)磁性微球部分或抗體的濃度進行調(diào)整，不影響反應(yīng)結(jié)果。該反應(yīng)過程可以在15～25℃室溫條件下進行，反應(yīng)時間根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)的檢測技術(shù)判斷，本發(fā)明一般采用對磁珠部分的修飾反應(yīng)時間16～24h，對抗體部分的修飾反應(yīng)時間2～4h。
所述步驟s1中的磁性納米簇是通過水熱法、溶劑熱法或共沉淀法制備得到，也可以采用市售商品。制備磁性納米簇的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)，得到的產(chǎn)品只需要滿足具有良好的磁性，并且可以與無機或有機高分子形成核殼結(jié)構(gòu)即可。
作為優(yōu)選的，所述步驟s1中的磁性納米簇是通過如下方法制備得到：
1)在空氣中，向二價鐵鹽的水溶液中加入氨水，然后攪拌使溶液變成黑色，得到黑色Fe3O4顆粒；
2)向步驟1)中加入油酸，混合均勻后轉(zhuǎn)移至密閉的反應(yīng)釜中，在60～130℃下加熱反應(yīng)3～5小時，即可得到所述磁性納米簇。
進一步的，所述步驟s2中的氨基修飾的磁性微球部分為核殼結(jié)構(gòu)的二氧化硅包裹的磁性微球，效果更加優(yōu)于直接在磁性納米簇粒子表面進行氨基修飾得到的磁性微球，可以采用市售商品或者按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的常規(guī)方法制備，均不影響本發(fā)明的結(jié)果?？梢允辜{米簇聚集在二氧化硅內(nèi)部，形成核殼結(jié)構(gòu)，增大粒徑，并且增加磁性和穩(wěn)定性即可。優(yōu)選的，本發(fā)明采用如下方法制備氨基修飾的二氧化硅包裹的磁性微球：向含有磁性納米簇的溶液中加入氨水、硅烷化試劑和氨基硅烷偶聯(lián)劑，反應(yīng)1～3天后得到氨基修飾的磁性微球部分；所述磁性納米簇、氨水、硅烷化試劑、氨基硅烷偶聯(lián)劑加入的質(zhì)量比為：1:(12.5～40):(2～8):(0.5～3)。其中氨水的質(zhì)量百分濃度為25～28％。其中，硅烷化試劑可以為正硅酸四乙酯(CAS：562-90-3)，氨基硅烷偶聯(lián)劑可以為(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(CAS：919-30-2)。本領(lǐng)域技術(shù)人員在選擇其他的硅烷化試劑與氨基硅烷偶聯(lián)劑時，可以對反應(yīng)原料的比例進行調(diào)整，均不超出本發(fā)明的保護范圍。
優(yōu)選的，所述步驟s5中，磁性微球和抗體的質(zhì)量比為1：(0.01～1)?？贵w與磁性微球的質(zhì)量比越高越有利于磁性微球表面偶聯(lián)抗體，但是考慮到抗體的成本因素，本發(fā)明采用磁性微球和抗體的質(zhì)量比為1：(0.01～0.2)。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種用于捕獲癌癥干細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒中含有上述多重免疫磁珠，其中，多重免疫磁珠為CD133免疫磁珠、CD24免疫磁珠和CD44免疫磁珠按照混合得到。由于不同的腫瘤干細(xì)胞表達(dá)的表面抗原量不同，因此CD133免疫磁珠、CD24免疫磁珠和CD44免疫磁珠混合的比例可以根據(jù)腫瘤的類型不同進行選擇，本發(fā)明采用1:1:1。
所述癌癥可以為宮頸癌、前列腺癌、頭頸癌、肝臟腫瘤、腦癌、乳腺癌或肺癌。
本發(fā)明的有益效果為：
(1)將本發(fā)明的多重免疫磁珠用于捕獲癌癥干細(xì)胞，可以捕獲癌細(xì)胞中極少量的癌癥干細(xì)胞，用于進一步的培養(yǎng)和分析，指導(dǎo)靶向性用藥，其捕獲的特異性、靈敏性好，而且磁響應(yīng)迅速、富集時間短，捕獲效率高?？梢杂糜谕饷隗w、體液或活檢組織的腫瘤細(xì)胞捕獲與分析。
(2)本發(fā)明的免疫磁珠，其磁性微球部分和抗體部分通過腙鍵結(jié)構(gòu)相連，得到的免疫磁珠在弱堿性條件下(血液中)性質(zhì)穩(wěn)定，同時粒徑小，磁響應(yīng)性好、分散性好。
(3)本發(fā)明的制備方法簡單，反應(yīng)條件溫和，氨基、醛基和肼基修飾的過程均可以在室溫下進行，不容易造成抗體的變質(zhì)、降解等，同時避免了使用還原劑，使抗體可以在低溫下與細(xì)胞孵育，保持抗體和細(xì)胞的活性。
(4)本發(fā)明原料簡單易得，成本低，工藝步驟簡單，抗體包被量大，具有很強的實用性。
具體實施方式
以下通過具體實施例來進一步說明本發(fā)明：下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。
實施例1多重抗體免疫磁珠的制備
(1)磁性納米簇的制備：
a.在空氣中，將7g FeCl2·4H2O加入到50mL去離子水中，得到濃度為0.14g/mL的FeCl2水溶液。向50mL FeCl2水溶液中加入氨水30mL，攪拌45min后，顏色逐漸變?yōu)闇\綠色，再變深綠色，最后變?yōu)楹谏?/p>
b.向步驟a中加入1.1g油酸，混合均勻后將混合液置于密閉的反應(yīng)釜中，在110℃下加熱反應(yīng)4小時，然后用去離子水和乙醇交替洗滌各一次，磁分離后分散在正己烷中，即可得到黑色的磁性納米簇Fe3O4。
(2)氨基修飾的磁性微球的制備：向10mg磁性納米簇Fe3O4 1的溶液中加入125mg氨水、30mg正硅酸四乙酯和30mg(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，反應(yīng)1天后進行磁分離，并且用乙醇和水交替洗滌各兩次，并用0.1M的pH 7～8的磷酸緩沖液分散后得到濃度為5mmol/L的氨基修飾的磁性微球1。
(3)肼基修飾的CD24抗體的制備：將5μL SANH的DMF溶液(濃度為5mmol/L)加入到100μL CD24抗體溶液(濃度為10μmol/L)中，在室溫反應(yīng)2h后，用超濾柱純化得到肼基修飾的CD24抗體(簡寫為CD24-SANH)1。
檢測CD24-SANH的濃度：通過BCA法計算修飾后的CD24-SANH的濃度為1.08mg/mL。
檢測肼基修飾率：用定量的2-甲酰苯磺酰鈉鹽溶液檢測肼基修飾率。取純化后的CD24-SANH加入到的2-甲酰苯磺酰鈉鹽溶液中，渦旋混勻后于37℃反應(yīng)1h，Nanodrop檢測348nm處的吸光值為0.22。通過348nm處的吸光值和CD24-SANH的濃度計算出CD24-SANH的肼基修飾率為2.9。
(4)醛基修飾的磁性微球的制備：將5μL的氨基修飾的磁性微球1加入到SFB的DMF溶液(濃度為5mmol/L)50μL中，在室溫反應(yīng)20h后，進行磁分離純化，得到醛基修飾的磁性微球1。
(5)將1mg步驟(4)中的醛基修飾的磁性微球與0.01mg步驟(3)中的肼基修飾的CD24抗體混合，在25℃下PBS緩沖液中混合4小時后，進行磁分離得到CD24免疫磁珠。
按照上述步驟(1)～(5)制備得到CD133免疫磁珠和CD44免疫磁珠。將CD133免疫磁珠、CD24免疫磁珠和CD44免疫磁珠按照質(zhì)量比1:1:1混合得到多重抗體免疫磁珠。
實施例2多重抗體免疫磁珠的敏感性檢測
取人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞(表面表達(dá)CD133/CD44抗原)、人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞(表面表達(dá)CD44/CD24抗原)和人乳腺腺癌細(xì)胞SK-BR-3細(xì)胞(表面表達(dá)CD24抗原)(均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫)，每組腫瘤細(xì)胞分別按照1:103、1:104、1:105、1:106的比例加入到PBMCs(5×106)中。將單獨的抗體免疫磁珠以及多重抗體免疫磁珠分別加入到上述各混合細(xì)胞懸液中，在4℃下孵育30分鐘。在2分鐘內(nèi)進行磁分選并用PBS洗滌2-3次，得到用免疫磁珠捕獲并回收的腫瘤細(xì)胞。統(tǒng)計回收的腫瘤細(xì)胞占加入的腫瘤細(xì)胞總數(shù)的比例，計算免疫磁珠的捕獲率，結(jié)果如表1所示：
表1不同免疫磁珠的捕獲率
表1的結(jié)果表明，在不同的細(xì)胞系中，用單獨的抗體磁珠捕獲腫瘤細(xì)胞，捕獲率明顯下調(diào)，但是用多重抗體免疫磁珠捕獲腫瘤細(xì)胞，在各種細(xì)胞系中的捕獲效率相近，并且明顯高于單獨的抗體磁珠捕獲效率。同時，隨著腫瘤細(xì)胞添加比例的增加，捕獲腫瘤細(xì)胞的數(shù)量呈線性。
實施例3模擬血液中CSC細(xì)胞的捕獲
采集健康志愿者血樣，將HCT116細(xì)胞與健康人的外周血混合，配成混合細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)HCT116細(xì)胞的濃度為1、10、20、50、500、1000個/mL，然后將多重抗體免疫磁珠依次加入到上述各混合細(xì)胞懸液中，在4℃下孵育30分鐘。在1分鐘內(nèi)進行磁分選并用PBS洗滌2-3次，得到用免疫磁珠捕獲并回收的HCT116細(xì)胞。統(tǒng)計回收的HCT116細(xì)胞占捕獲前細(xì)胞總數(shù)的比例，計算免疫磁珠捕獲血液樣品中HCT116細(xì)胞的捕獲效率，與實施例2中結(jié)果相近。
從實施例2-3的捕獲結(jié)果來看，多重抗體免疫磁珠在單純環(huán)境中(實施例2)的捕獲效率能夠精確到1：106，多重抗體免疫磁珠在復(fù)雜環(huán)境中(實施例3)也可以檢測到1個/mL的HCT116細(xì)胞，可以滿足目前液體活檢的要求。
對上述孵育后的磁珠用無鈣鎂的PBS緩沖液重懸，將洗脫得到的磁珠-細(xì)胞用PicoPure RNA Isolation Kit試劑盒(Thermo Cat No：KIT0214)提取純化總RNA，采用了PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TAKARA,Cat No：RR047A)，按說明書要求去除基因組DNA以及進行cDNA鏈合成。接下來涉及相應(yīng)Taqman引物，進行qPCR檢測，以GAPDH為內(nèi)標(biāo)比較qPCR檢測結(jié)果，在相同條件下，與HCT116細(xì)胞的qPCR檢測結(jié)果一致。說明用本發(fā)明的免疫磁珠捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞不會損傷細(xì)胞，可以用于后續(xù)細(xì)胞分析。并且說明，用本發(fā)明的免疫磁珠捕獲到的細(xì)胞幾乎沒有PBMCs細(xì)胞，PBMCs細(xì)胞則基本不與免疫磁珠結(jié)合。
實施例4癌癥病人的CSC細(xì)胞捕獲
取10個不同的原發(fā)灶結(jié)直腸癌癥病人的外周血血液3mL，對血液中的CSC細(xì)胞進行捕獲。要求受試者血常規(guī)白細(xì)胞值位于2×106～1.2×107個/mL之間，全血樣本未出現(xiàn)溶血或血塊凝結(jié)。將實施例1中的多重抗體免疫磁珠加入到上述經(jīng)過紅細(xì)胞裂解后的血液中，在4℃下孵育30分鐘，然后在1分鐘內(nèi)進行磁分選并用PBS洗滌2-3次，在其中三個癌癥病人血液中捕獲和富集到了癌癥干細(xì)胞。將得到的癌癥干細(xì)胞從免疫磁珠上洗脫后用無鈣鎂的PBS洗三遍，用100μl的DMEM培養(yǎng)基懸浮，靜脈注射進CD1-Foxn1nu免疫缺陷鼠中，對照組靜脈注射100ul的DMEM，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的癌癥干細(xì)胞注射的老鼠體內(nèi)都長了腫瘤，而對照組都沒有。將腫瘤取出并做成石蠟切片，用多重抗體染色(CD133、CD24、CD44)，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)每張片子都有熒光，用多重抗體染色(CD133、CD24、CD44)，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)每張片子都有熒光，說明腫瘤細(xì)胞的表面至少含有CD133/CD24/CD44抗原中的一個，腫瘤是由于靜脈注射癌癥干細(xì)胞轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的，表面至少有CD133、CD24、CD44中一個的腫瘤細(xì)胞具有癌癥干細(xì)胞的特征。
以上所述的實施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明實施例原理以及權(quán)利要求的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發(fā)明實施例的保護范圍。