本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及重組蛋白質(zhì)Slit2D2-HSA的制備及其作為抗腫瘤藥物在抗腫瘤中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腫瘤是機體細胞異常生長造成的疾病，腫瘤細胞增殖不可調(diào)控，并轉(zhuǎn)移侵潤周圍或通過血液循環(huán)侵潤遠端組織，導(dǎo)致機體的惡變，危及生命。此類疾病極大地危害人類生命健康，但對其治療方法仍然十分有限。對于癌癥的治療，雖然過去20年有一定進展，但有效藥物仍然有限，目前急需要創(chuàng)新性思維開發(fā)新的藥物。腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展其關(guān)鍵步驟涉及細胞遷移、侵潤和遠處轉(zhuǎn)移，基于這一特性可用于開發(fā)新一代抗癌藥物。過去20多年神經(jīng)導(dǎo)向因子的研究發(fā)現(xiàn)了許多重要蛋白因子和揭示新的細胞生理機制。代表因子Slit是神經(jīng)軸突導(dǎo)向和神經(jīng)元遷移趨勢因子。近年來發(fā)現(xiàn)Slit及其受體Robo調(diào)節(jié)腫瘤細胞的遷移、炎癥細胞的遷移、血管內(nèi)皮細胞的遷移，與腫瘤細胞及炎癥疾病的發(fā)展密切相關(guān)。雖然Slit/Robo信號通路具有腫瘤藥物開發(fā)的潛力。但將slit2蛋白直接用于藥物開發(fā)存在四個問題，第一，slit2的分子量接近200kd，分子量較大，在體內(nèi)藥物吸收會受到影響；第二、Slit2本身在體內(nèi)的半衰期比較短。第三，關(guān)于Slit2對腫瘤的遷移也有相反的結(jié)論，認為Slit2可以促進腫瘤轉(zhuǎn)移(Wang,Xiaoetal.2003,Wang,Zhaoetal.2008)。第四，Slit2會影響體內(nèi)血管生成，Slit2本身可以促進血管內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)移和血管生成，但在VEGF細胞因子作用下，其可以抑制VEGF引起的血管內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)移和血管生成,Slit2用于藥物開發(fā)，會影響體內(nèi)心血管系統(tǒng)，產(chǎn)生不良反應(yīng)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種融合蛋白及其在抗腫瘤中的應(yīng)用。本發(fā)明的第一方面，提供了一種融合蛋白，所述融合蛋白具有式Ia或式Ib所述結(jié)構(gòu)：C-A-B(Ia)，或C-B-A(Ib)其中，A為包括Slit2的第二個結(jié)構(gòu)域D2的蛋白元件，并且元件A的長度為200-300個氨基酸；B為HSA蛋白元件；C為任選的信號肽序列；“-”表示連接上述各元件的肽鍵或肽接頭。在另一優(yōu)選例中，所述元件A具有SEQIDNO.:1所示的氨基酸序列并且長度為207-250個氨基酸。在另一優(yōu)選例中，所述元件A序列如SEQIDNO.:1所示。在另一優(yōu)選例中，所述元件B序列如SEQIDNO.:2所示。在另一優(yōu)選例中，所述D2具有側(cè)翼序列，所述側(cè)翼序列包括：位于D2氨基端的第一側(cè)翼序列；和/或位于D2羧基端的第二側(cè)翼序列。在另一優(yōu)選例中，所述第一側(cè)翼序列由1-5個氨基酸殘基組成。在另一優(yōu)選例中，所述第二側(cè)翼序列由1-2個氨基酸殘基組成。在另一優(yōu)選例中，所述的第一和第二側(cè)翼序列分別來自天然Slit2蛋白的第二結(jié)構(gòu)域D2(SEQIDNO.:1)兩側(cè)的氨基酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述元件A衍生自哺乳動物(如人)的Slit2蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述元件B衍生自哺乳動物(如人)的HSA蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的肽接頭的長度為0-10氨基酸，較佳地為1-5個氨基酸。在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白還包括信號肽元件C。在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白不含信號肽，并且結(jié)構(gòu)式為A-B(IIa)，或B-A(IIb)式中，A、B和“-”的定義如上所述。在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白選自下組：(A)具有SEQIDNO:3所示氨基酸序列的多肽；(B)具有與SEQIDNO:3所示氨基酸序列≥80％同源性(優(yōu)選地，≥90％的同源性；等優(yōu)選地≥95％的同源性；最優(yōu)選地，≥97％的同源性，如98％以上，99％以上)的多肽，且所述多肽具有腫瘤抑制活性；(C)將SEQIDNO:3中任一所示氨基酸序列經(jīng)過1-5個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且保留腫瘤抑制活性的衍生多肽。在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白具有選自下組的一個或多個特性：a)具有抑制腫瘤細胞遷移的活性；b)具有抑制HUVEC遷移的活性；c)具有抑制腫瘤細胞侵襲的活性和；d)抑制腫瘤生長的活性。本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸編碼本發(fā)明第一方面所述的融合蛋白。本發(fā)明的第三方面，提供了一種載體，它含有本發(fā)明第二方面所述的多核苷酸。本發(fā)明的第四方面，提供了一種宿主細胞，它含有本發(fā)明第三方面所述的載體或基因組中整合有本發(fā)明第二方面所述的多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞(如CHO細胞、NS0細胞、或293細胞)。本發(fā)明的第五方面，提供了一種產(chǎn)生蛋白的方法，它包括步驟：在適合表達的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明第四方面所述的宿主細胞，從而表達出本發(fā)明第一方面所述的融合蛋白；和分離所述融合蛋白。本發(fā)明的第六方面，提供了一種藥物組合物，其特征在于，所述組合物包含：本發(fā)明第一方面所述的融合蛋白，以及藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的第七方面，提供了本發(fā)明第一方面所述的融合蛋白的用途，用于制備治療或預(yù)防腫瘤的藥物。在另一優(yōu)選例中，所述腫瘤選自：乳腺癌，肺癌，大腸癌，胰腺癌，卵巢癌，前列腺癌，腎癌，肝癌，腦癌，黑色素瘤，多發(fā)性骨髓瘤，慢性粒細胞性白血病，血液腫瘤，和淋巴腫瘤。本發(fā)明的第十方面，提供了一種治療腫瘤的方法，其特征在于，包括步驟：給需要的對象施用本發(fā)明第一方面所述的融合蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的融合蛋白以單體和/或二聚體形式施用。在另一優(yōu)選例中，所述的對象是人。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明圖1顯示了SlitD2-HSA融合蛋白電泳鑒定結(jié)果。圖2顯示了SlitD2-HSA融合蛋白純化后的HPLC檢測結(jié)果。圖3顯示了肺癌A549的抑制活性，Slit2D2-HSA能夠抑制SDF-1誘導(dǎo)下肺癌A549細胞的遷移，在濃度為0.1uM條件下其抑制率為82％，P<0.001；在濃度為1uM條件下其抑制率為：98％P<0.001；Slit2N在濃度為0.1uM條件下對A549無明顯抑制效果。圖4顯示了肝癌HepG2的抑制活性，Slit2D2-HSA能夠抑制SDF-1誘導(dǎo)下肝癌細胞HepG2的遷移，在濃度為0.1uM條件下其抑制率為67％，P<0.001：在濃度為1uM條件下其抑制率為：71％P<0.001；Slit2N在濃度為0.1uM條件下對HepG2無明顯抑制效果。圖5顯示了黑色素瘤的抑制活性，Slit2D2-HSA能夠抑制SDF-1誘導(dǎo)下黑色素瘤MDA-MB-435S細胞的遷移，在濃度為0.1uM條件下其抑制率為63％(P<0.001)：在濃度為1uM條件下其抑制率為：84％(P<0.001)；Slit2N在濃度為0.1uM條件下對MDA-MB-435S細胞遷移抑制率為77％(P<0.001)。圖6顯示了胰腺癌ASPC-1的抑制活性，Slit2D2-HSA能夠抑制SDF-1誘導(dǎo)下胰腺癌ASPC-1細胞的遷移，在濃度為0.1uM條件下其抑制率為79％(P<0.001)：在濃度為1uM條件下其抑制率為：95％(P<0.001)；Slit2N在濃度為0.1uM條件下對胰腺癌ASPC-1細胞的遷移的抑制率為83％(P<0.001)。圖7顯示了乳腺癌MDA-MB-231(HGF誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移)的抑制活性，Slit2D2-HSA能夠抑制HGF誘導(dǎo)下乳腺癌MDA-MB-231細胞的遷移，在濃度為1uM條件下其抑制率為：41％(P<0.01)。圖8顯示了乳腺癌MDA-MB-231(SDF-1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移)的抑制活性，Slit2D2-HSA能夠抑制SDF-1誘導(dǎo)下乳腺癌MDA-MB-231細胞的遷移，在濃度為0.1uM條件下其抑制率為69％(P<0.001)；在濃度為1uM條件下其抑制率為：92％(P<0.001)。圖9顯示了黑色素瘤A375的抑制活性，Slit2D2-HSA能夠抑制SDF-1誘導(dǎo)下黑色素瘤A375細胞的遷移，在濃度為0.1uM條件下其抑制率為54％，P<0.001；在濃度為1uM條件下其抑制率為：66％P<0.001；SlitN在濃度為0.1uM條件下對黑色素瘤A375細胞的遷移無明顯抑制效果。圖10顯示了乳腺癌MCF-7/ADR的抑制活性，Slit2D2-HSA能夠抑制SDF-1誘導(dǎo)下乳腺癌MCF-7/ADR細胞的遷移，在濃度為0.1uM條件下其抑制率為58％(P<0.001)；在濃度為1uM條件下其抑制率為：71％(P<0.001)；SlitN在濃度為0.1uM條件下對MCF-7/ADR細胞的遷移具有明顯的促進效果，與Slit2D2-HSA效果相反。圖11顯示了肝癌SMMC7721的抑制活性，Slit2D2-HSA能夠抑制SDF-1誘導(dǎo)下肝癌SMMC7721細胞的遷移，在濃度為0.1uM條件下其抑制率為68％(P<0.001)；在濃度為1uM條件下其抑制率為：99％(P<0.001)；Slit2N在濃度為0.1uM條件下對SMMC7721細胞的遷移具有明顯的促進效果效果，與Slit2D2-HSA效果相反。圖12顯示了血管內(nèi)皮細胞遷移實驗結(jié)果。Slit2D2-HSA能夠抑制VEGF誘導(dǎo)下血管內(nèi)皮細胞的遷移。圖13顯示了人乳腺癌MDA-MB-231-Luc尾靜脈注射轉(zhuǎn)移模型的藥效學(xué)研究，結(jié)果顯示，Slit2D2-HSA蛋白能夠顯著抑制MDA-MB-231細胞在小鼠體內(nèi)的肺部轉(zhuǎn)移。圖14顯示了藥物在MDA-MB-231人乳腺癌原位移植BALB/c裸小鼠動物模型中的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用和安全性評價。圖14A顯示了不同實驗組中小鼠的腫瘤體積，顯示融合蛋白實驗組的腫瘤體積明顯小于溶媒對照組；圖14B顯示了腫瘤的生長曲線，融合蛋白實驗組中腫瘤生長速度顯著低于溶媒對照組；圖14C顯示各實驗組中接種腫瘤后，小鼠體重的變化情況，對照組和實驗組無顯著差別，表明本發(fā)明的融合蛋白無明顯的毒副作用。圖14D顯示各實驗組接種腫瘤細胞并長到一定階段后，通過手術(shù)切除腫瘤方法建立轉(zhuǎn)移評價模型，評價藥物對腫瘤細胞轉(zhuǎn)移抑制效果。結(jié)果顯示，本發(fā)明的融合蛋白對MDA-MB-231細胞在小鼠體內(nèi)的肺轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有明顯的抑制作用。圖14E顯示了腫瘤肺轉(zhuǎn)移H&E染色，圖14F(A為對照，B為1mg/kgSlit2D2-HSA,C為5mg/kgSlit2D2-HSA,D為10mg/kgSlit2D2-HSA)顯示了腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移H&E染色。具體實施方式本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，獲得一種SlitD2-HSA融合蛋白，實驗結(jié)果表明，所述融合蛋白能夠顯著的抑制腫瘤細胞的遷移。而且，現(xiàn)有的文獻表明Slit2對不同的腫瘤具有促進和抑制的雙重作用，但是本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的融合蛋白對不同腫瘤均顯示抑制效果，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。在描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所述的具體方法和實驗條件，因為這類方法和條件可以變動。還應(yīng)當(dāng)理解本文所用的術(shù)語其目的僅在于描述具體實施方案，并且不意圖是限制性的，本發(fā)明的范圍將僅由所附的權(quán)利要求書限制。除非另外定義，否則本文中所用的全部技術(shù)與科學(xué)術(shù)語均具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。如本文所用，在提到具體列舉的數(shù)值中使用時，術(shù)語“約”意指該值可以從列舉的值變動不多于1％。例如，如本文所用，表述“約100”包括99和101和之間的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。雖然在本發(fā)明的實施或測試中可以使用與本發(fā)明中所述相似或等價的任何方法和材料，本文在此處例舉優(yōu)選的方法和材料。Slit蛋白Slit是一類分泌性糖蛋白，分子量約為200kD，哺乳類動物中克隆到的Slit基因有三個，分別命名為Slit1,Slit2和Slit3。它的結(jié)構(gòu)由N-端的信號肽，4個富含亮氨酸的重復(fù)序列(LRRs)以及多個EGF樣的重復(fù)序列(在果蠅中是7個，在脊椎動物中是9個)組成；研究表明，其中的LRRs是Slit蛋白和受體Robo的結(jié)合區(qū)域。Slit蛋白通過結(jié)合受體Robo發(fā)揮功能。Robo是一次跨膜的受體蛋白,在哺乳動物中，已經(jīng)克隆到4個Robo基因。從物種進化的角度看，Robo1,2,3的胞外部分非常的保守，從果蠅到人類都是由5個Ig樣功能區(qū)和3個FibronectinIII型重復(fù)序列組成。Robos有很短的跨膜區(qū)域和一個較長的胞內(nèi)區(qū)；按照序列的保守性，胞內(nèi)區(qū)被劃分為4個更小的區(qū)域，分別命名為：CC0,CC1,CC2,CC3。Robo4的結(jié)構(gòu)與其它三個家族成員有很大的不同，它的胞外只有2個Ig樣功能區(qū)和3個FibronectinIII型重復(fù)序列；胞內(nèi)也只有CC0和CC2兩個區(qū)域。Robos胞外的IgG結(jié)構(gòu)域被認為是與配體Slit結(jié)合所必需的，較長的胞內(nèi)區(qū)域則和一些重要的信號分子相互作用，參與Slit/Robo下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而完成刺激信號由細胞外部到內(nèi)部骨架的傳遞。slit2與Robo相互作用區(qū)域蛋白質(zhì)的機構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)slit2的第二個結(jié)構(gòu)域D2與Robo1的Ig1結(jié)合，啟動信號傳導(dǎo)(Morlot,Hemrikaetal.2007,Hohenester2008,Seiradake,vonPhilipsbornetal.2009)。近年來，趨化因子受體(CXCchemokinereceptor-4，CXCR4)及其配體基質(zhì)細胞衍生因子1(stromalcellderivedfactor-I,SDF-I)相互作用形成的反應(yīng)軸SDF-1/CXCR4在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用越來越受到人們的關(guān)注，趨化因子CXCL12和CXCR4結(jié)合后，能夠?qū)е录拥鞍拙酆虾图毎麄巫阈纬?，使癌細胞突破基底膜發(fā)生侵襲，同時促使癌細胞的運動和遠處轉(zhuǎn)移，從而產(chǎn)生趨化運動和侵襲反應(yīng)。這一系列作用與SDF-1劑量正相關(guān)，并已被證明SDF-1參與乳腺癌、前列腺癌、肝癌、非小細胞肺癌、纖維素肉瘤、卵巢癌、髓母細胞瘤、胰腺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤等癌癥的局部侵襲和器官特異性轉(zhuǎn)移。也有研究發(fā)現(xiàn)：45％的乳腺癌DU4475細胞中表達ROBO1，20％的乳腺癌DU4475細胞中表達ROBO2；35％MDA-MB-231細胞表達ROBO1，21％MDA-MB-231細胞表達ROBO4。SDF-1可以通過CXCR4/CXCL12信號通路誘導(dǎo)乳腺癌細胞遷移、侵襲，但該過程可以被slit2所抑制，同時也可抑制其細胞粘附行為。；其它研究也證明，Slit2(30pM或100pM)能夠有效抑制SDF-1(10nM)誘導(dǎo)下的腫瘤遷移。融合蛋白及其制備在本發(fā)明中，“融合蛋白”、“重組蛋白”、“本發(fā)明蛋白”、“本發(fā)明融合蛋白”可互換使用，指具有式Ia或Ib所述結(jié)構(gòu)，即含有包括Slit2D2的蛋白元件和HSA蛋白元件的融合蛋白。一個代表性的例子是Slit2D2-HSA。本發(fā)明蛋白可以是單體或由單體形成的多聚體(如二聚體)。此外，應(yīng)理解，所述術(shù)語還包括融合蛋白的活性片段和衍生物。如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。如本文所用，“分離的融合蛋白”是指融合蛋白基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化融合蛋白?；旧霞兊牡鞍自诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼多肽的功能。如本文所用，術(shù)語“引物”指的是在與模板配對，在DNA聚合酶的作用下能以其為起點進行合成與模板互補的DNA鏈的寡居核苷酸的總稱。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)與模板上一條鏈上的一個特殊的序列互補。引物必須與模板上的一條鏈充分互補才能開始延伸，但引物的序列不必與模板的序列完全互補。比如，在一個3'端與模板互補的引物的5'端加上一段與模板不互補的序列，這樣的引物仍大致上與模板互補。只要有足夠長的引物能與模板充分的結(jié)合，非完全互補的引物也可以與模板形成引物-模板復(fù)合物，從而進行擴增。本發(fā)明融合蛋白或其元件(如Slit2D2)的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)已公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。應(yīng)用PCR技術(shù)擴增DNA/RNA的方法被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或融合蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述蛋白質(zhì)的方法。通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)，可利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來表達或生產(chǎn)重組蛋白。一般來說有以下步驟：(1)用本發(fā)明的編碼本發(fā)明蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細胞；(2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；(3)從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含本發(fā)明蛋白的編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷毎允蛊淠軌虮磉_蛋白質(zhì)。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、NS0、COS7、或293細胞的動物細胞等。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細胞生長到適當(dāng)?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。在上面的方法中的蛋白質(zhì)可在細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，Slit2D2蛋白元件的氨基酸序列如下：LHCPAACTCSNNIVDCRGKGLTEIPTNLPETITEIRLEQNTIKVIPPGAFSPYKKLRRIDLSNNQISELAPDAFQGLRSLNSLVLYGNKITELPKSLFEGLFSLQLLLLNANKINCLRVDAFQDLHNLNLLSLYDNKLQTIAKGTFSPLRAIQTMHLAQNPFICDCHLKWLADYLHTNPIETSGARCTSPRRLANKRIGQIKSKKFRCS(SEQIDNO.:1)在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，HSA蛋白元件的氨基酸序列如下：DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL(SEQIDNO.:2)優(yōu)選地，本發(fā)明的SlitD2-HSA融合蛋白的氨基酸序列如下：LHCPAACTCSNNIVDCRGKGLTEIPTNLPETITEIRLEQNTIKVIPPGAFSPYKKLRRIDLSNNQISELAPDAFQGLRSLNSLVLYGNKITELPKSLFEGLFSLQLLLLNANKINCLRVDAFQDLHNLNLLSLYDNKLQTIAKGTFSPLRAIQTMHLAQNPFICDCHLKWLADYLHTNPIETSGARCTSPRRLANKRIGQIKSKKFRCSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL(SEQIDNO.:3)其編碼DNA序列包括：CTCTGGCTCCCCGGGGCgcgcTGTTTGCACTGCCCTGCCGCCTGTACCTGTAGCAACAATATCGTAGACTGTCGTGGGAAAGGTCTCACTGAGATCCCCACAAATCTTCCAGAGACCATCACAGAAATACGTTTGGAACAGAACACAATCAAAGTCATCCCTCCTGGAGCTTTCTCACCATATAAAAAGCTTAGACGAATTGACCTGAGCAATAAAGATCTCTGAACTTGCACCAGATGCTTTCCAAGGACTACGCTCTCTGAATTCACTTGTCCTCTATGGAAATAAAATCACAGAACTCCCCAAAAGTTTATTTGAAGGACTGTTTTCCTTACAGCTCCATATTGAATGCCAACAAGATAAACTGCCTTCGGGTAGATGCTTTTCAGGATCTCCACAACTTGAACCTTCTCTCCCTATATGACAACAAGCTTCAGACCATCGCCAAGGGGACCTTTTCACCTCTTGGCCATTCAAACTATGCATTTGGCCCAGAACCCCTTTATTTGTGACTGCCATCTCAAGTGGCTAGCGGATTATCTCCATACCAACCCGATTGAGACCAGTGGTGCCCGTTGCACCAGCCCCCGCCGCTGCAAACAAAAGAATTGGACAGATCAAAAGCAAGAAATTCCGTTGTTCAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCCTTGGTGTTGATTGCTTTGCTCAGTATCTTAGCAGTGTCCATTTGAAGATCATGTAAAATTAGTGAATGAAGTAACTGAATTTGCAAAAACATGTGTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCTTTTTGGAGACAAATTAGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTGACTGCTGTGCAAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAAAGATGACAACCCAAACTCCCCCGATTGGTGAGACAGAGGTTGATGTGATGTGCACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGACATTTTTGAAAAAATACTTATATGAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACCCTTTTCTTTGCTAAAAGGATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCAAACAGGACTCAAGTGTGCCAGTCTCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAAGCATGGGCAGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGAAGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACAAAGTCCACACGGAATGCTGCATGGAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAATCAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGCTGTGAAAAACTCTGTTGGAAAAATCCCACTGCTTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTGACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAACTATGCTGAGGCAAAGGATTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATAATATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATATGAAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCAGAATGCTATGCCAAAGTGTTCGATAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGCTATTAGTTCTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGCAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATCCTGAAGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATTATCCGTGGTCCTGAACCAGTTATGTTGTTGCATGAGAAAACGCCAGTAAGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGAACATACGTTCCCAAAGAGTTTAATGCTAAACATTCACCTTCCATGCAGATATATGCACACTTTCTGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGAGCTCGTGAAACACAAGCCCAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTTGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAACTGCCTTAGGCTTATAAGAATTCATTGATCATTAATCAGCCA(SEQIDNO.:4)應(yīng)理解，所述術(shù)語還包括本發(fā)明融合蛋白的衍生物，指本發(fā)明融合蛋白在經(jīng)過1-3個氨基酸添加或替換、1-2個氨基酸缺失并仍具有腫瘤抑制活性的多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產(chǎn)生。表1最初的殘基代表性的取代優(yōu)選的取代Ala(A)Val；Leu；IleValArg(R)Lys；Gln；AsnLysAsn(N)Gln；His；Lys；ArgGlnAsp(D)GluGluCys(C)SerSerGln(Q)AsnAsnGlu(E)AspAspGly(G)Pro；AlaAlaHis(H)Asn；Gln；Lys；ArgArgIle(I)Leu；Val；Met；Ala；PheLeuLeu(L)Ile；Val；Met；Ala；PheIleLys(K)Arg；Gln；AsnArgMet(M)Leu；Phe；IleLeuPhe(F)Leu；Val；Ile；Ala；TyrLeuPro(P)AlaAlaSer(S)ThrThrThr(T)SerSerTrp(W)Tyr；PheTyrTyr(Y)Trp；Phe；Thr；SerPheVal(V)Ile；Leu；Met；Phe；AlaLeu一旦鑒定獲得了相關(guān)的肽序列，就可以用重組法來大批量地獲得相關(guān)肽序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到相關(guān)肽(融合蛋白)。此外，還可用化學(xué)方法直接合成相關(guān)肽序列。肽接頭本發(fā)明提供了一種融合蛋白，它可任選地含有肽接頭。肽接頭大小和復(fù)雜性可能會影響蛋白的活性。通常，肽接頭應(yīng)當(dāng)具有足夠的長度和柔韌性，以保證連接的兩個蛋白在空間上有足夠的自由度以發(fā)揮其功能。同時避免肽接頭中形成α螺旋或β折疊等對融合蛋白的穩(wěn)定性的影響。連接肽的長度一般為0-10個氨基酸，較佳地1-5個氨基酸。藥物組合物及施用方法本發(fā)明還提供了一種組合物，它含有有效量的本發(fā)明的融合蛋白，以及藥學(xué)上可接受的載體。通常，可將本發(fā)明的融合蛋白配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。如本文所用，術(shù)語“有效量”或“有效劑量”是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量，如0.001-99wt％；較佳的0.01-95wt％；更佳的，0.1-90wt％。如本文所用，“藥學(xué)上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即具有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。本發(fā)明的藥物組合物含有安全有效量的本發(fā)明的融合蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。這類載體包括(但并不限于)：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通常藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配，本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。所述的藥物組合物宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量。本發(fā)明的藥物制劑還可制成緩釋制劑。本發(fā)明融合蛋白的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限于：本發(fā)明融合蛋白的藥代動力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。針對腫瘤患者，通常，當(dāng)本發(fā)明的融合蛋白每天以約0.5mg-5mg/kg動物體重(較佳的2mg-4mg/kg動物體重)的劑量給予，能得到令人滿意的效果。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：(1)本發(fā)明的slit2D2-HSA融合蛋白具備廣譜抗腫瘤作用，包括對肺癌(A549),乳腺癌(MDA-MB-231)，胰腺癌(ASPC-1),黑色素瘤(A435，MDA-MB-435S)和肝癌(HepG2)具有腫瘤轉(zhuǎn)移抑制作用，體現(xiàn)了其廣譜抗腫瘤作用；(2)slit2在不同腫瘤細胞中表現(xiàn)出不同的作用(促進或抑制)，但本發(fā)明開發(fā)的融合蛋白分子所針對的腫瘤細胞，均為抑制作用；(3)本發(fā)明的slit2D2-HSA融合蛋白對血管內(nèi)皮細胞遷移有顯著地抑制作用，進而抑制腫瘤營養(yǎng)供應(yīng)，在動物體內(nèi)表現(xiàn)出抑制腫瘤生長作用；(4)本發(fā)明的slit2D2-HSA融合蛋白安全性強，對動物體沒有明顯的毒副作用，而且半衰期長。下面結(jié)合具體實施例，進一步詳陳本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明詳細條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。以下實施例中所用的實驗材料和試劑如無特別說明均可從市售渠道獲得。實施例1：SlitD2-HSA融合蛋白的制備1.1SlitD2-HSA融合蛋白制備依據(jù)slit2序列[GenBank:EAW92793.1]分析設(shè)計構(gòu)建Slit2的第二個結(jié)構(gòu)域Slit2D2(Hohenester2008)和人血清白蛋白HSA的融合表達載體。通過全基因合成得到slit2D2和HSA基因片段，以其為模板通過引物T62F和T62RPCR擴增Slit2D2基因序列，通過引物T60F3和T59RPCR擴增HSA基因序列,用膠回收試劑盒純化上述674bp和1783bpPCR產(chǎn)物。含CMV啟動子pCDNA3.1載體(Invitrogen)用BssHII和EcoRI酶切，將2個PCR產(chǎn)物和酶切載體設(shè)置無縫連接反應(yīng)，之后轉(zhuǎn)換TOP10菌株(購自上海索萊寶生物科技有限公司)，氨芐青霉素篩選并挑取陽性克隆，通過測序確認載體構(gòu)建成功。用無內(nèi)毒素DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，用于轉(zhuǎn)染EXPI293細胞使用。培養(yǎng)EXPI293細胞(購自LifeTechnologies公司)，當(dāng)密度達到2.5x106細胞/毫升時轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染5天后收集上清。高速離心EXPI293培養(yǎng)液取上清，通過離子交換層析純化SlitD2-HSA融合蛋白。通過SDS-PAGE檢測目的蛋白分子量，通過HPLC檢測蛋白純度。本實施例中引物序列如下：>T62FCTCTGGCTCCCCGGGGCgcgcTGTTTGCACTGCCCTGCCGCCTGTACC(SEQIDNO.:5)>T62RGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCTGAACAACGGAATTTCTTGCTT(SEQIDNO.:6)>T60F3GATGCACACAAGAGTGAGGTTGC(SEQIDNO.:7)>T59RTGGCTGATTAATGATCAATGAATTCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTG(SEQIDNO.:8)圖1顯示了SlitD2-HSA重組蛋白表達鑒定結(jié)果，電泳圖譜為12％SDS-PAGE電泳圖譜，泳道1-3分別為分子量標(biāo)記、還原條件下的電泳情況和非還原條件下的電泳情況。圖2為HPLC檢測(SEC-HPLC；G3000swxl；0.5ml/min；40min；UV280)結(jié)果，表明本實施例中制備了極高純度的融合蛋白。上述結(jié)果表明，所構(gòu)建的融合蛋白分子量與預(yù)期相符，本實施例中成功構(gòu)建并制備了了SlitD2-HSA融合蛋白。實施例2：SlitD2-HSA蛋白體外廣譜抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性檢測2.1體外活性測試A.Transwell腫瘤體外轉(zhuǎn)移模型建立將腫瘤細胞消化打散，取15,000個細胞加入transwell小室上層，總體積為100ul，不含血清，各組含有不同濃度的藥物，每組三個平行。小室下層中加入600ul含有10％血清的培養(yǎng)基，并加入終濃度為10Nm的SDF1，除了NC組下層不加SDF1，其余各組都加。24小時后將小室用4％多聚甲醛固定，然后將上層膜的細胞輕輕擦除，下層膜的細胞用DAPI染色。將染色后的下層膜的細胞置于熒光顯微鏡下拍照，每個小室隨機選取5個視野，20X物鏡。對每張照片中的細胞數(shù)進行統(tǒng)計，試驗中所用slit2N蛋白為slit2全長蛋白N段，作為對照蛋白。購自sigma公司，貨號SRP3155)。對以下細胞系進行體外檢測，確定藥物抗瘤譜。肺癌：A549；乳腺癌：MCF-7/ADR、MDA-MB-231；黑色素瘤：MDA-MB-435S,A431；肝癌:HepG2，SMMC7721；胰腺癌：ASPC-1。上述細胞株均可通過市售渠道獲得。B.人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)遷移實驗：1.HUVEC饑餓處理12小時。2.在transwell小室下方加入600μL含VEGF(50ng/Ml)及不同蛋白的basic培養(yǎng)基(不含血清及其他生長因子)，小室上方加入用100μLbasic培養(yǎng)基重懸的經(jīng)過饑餓處理的細胞(4×104)以及不同蛋白，每組均設(shè)3個復(fù)孔。3.于37℃5％CO2培養(yǎng)箱中進行孵育，孵育6小時后固定，結(jié)晶紫染色，用棉棒輕輕擦去小室上方細胞，拍照(拍照倍數(shù)為10×1.6倍)并進行統(tǒng)計學(xué)分析。抑制率計算公式抑制率＝(HSA組細胞遷移數(shù)目-給藥組細胞遷移數(shù)目)/(HSA組細胞遷移數(shù)目-PBS組細胞遷移數(shù)目)*100％圖3顯示了肺癌A549的抑制活性，Slit2D2-HSA能夠抑制SDF-1誘導(dǎo)下肺癌A549細胞的遷移，在濃度為0.1Um條件下其抑制率為82％，P<0.001；在濃度為1Um條件下其抑制率為：98％P<0.001；Slit2N(Slit2N為slit2蛋白的N端，約為140kd，包含了slit2的D1—D4的結(jié)構(gòu)域和多個EGF重復(fù)序列，購自Sigma公司)在濃度為0.1Um條件下對A549無明顯抑制效果。圖4顯示了肝癌HepG2的抑制活性，Slit2D2-HSA能夠抑制SDF-1誘導(dǎo)下肝癌細胞HepG2的遷移，在濃度為0.1Um條件下其抑制率為67％，P<0.001；在濃度為1Um條件下其抑制率為：71％P<0.001；Slit2N在濃度為0.1Um條件下對HepG2無明顯抑制效果。圖5顯示了黑色素瘤的抑制活性，Slit2D2-HSA能夠抑制SDF-1誘導(dǎo)下黑色素瘤MDA-MB-435S細胞的遷移，在濃度為0.1Um條件下其抑制率為63％(P<0.001)；在濃度為1Um條件下其抑制率為：84％(P<0.001)；Slit2N在濃度為0.1Um條件下對MDA-MB-435S細胞遷移抑制率為77％(P<0.001)。圖6顯示了胰腺癌ASPC-1，Slit2D2-HSA能夠抑制SDF-1誘導(dǎo)下胰腺癌ASPC-1細胞的遷移，在濃度為0.1Um條件下其抑制率為79％(P<0.001)；在濃度為1Um條件下其抑制率為：95％(P<0.001)；Slit2N在濃度為0.1Um條件下對胰腺癌ASPC-1細胞的遷移的抑制率為83％(P<0.001)。圖7顯示了乳腺癌MDA-MB-231(HGF誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移)的抑制活性，Slit2D2-HSA能夠抑制HGF誘導(dǎo)下乳腺癌MDA-MB-231細胞的遷移，在濃度為1Um條件下其抑制率為：41％(P<0.01)。圖8顯示了乳腺癌MDA-MB-231(SDF-1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移)的抑制活性，Slit2D2-HSA能夠抑制SDF-1誘導(dǎo)下乳腺癌MDA-MB-231細胞的遷移，在濃度為0.1Um條件下其抑制率為69％(P<0.001)；在濃度為1Um條件下其抑制率為：92％(P<0.001)。圖9顯示了黑色素瘤A375的抑制活性，Slit2D2-HSA能夠抑制SDF-1誘導(dǎo)下黑色素瘤A375細胞的遷移，在濃度為0.1Um條件下其抑制率為54％，P<0.001；在濃度為1Um條件下其抑制率為：66％P<0.001；SlitN在濃度為0.1Um條件下對黑色素瘤A375細胞的遷移無明顯抑制效果。圖10顯示了乳腺癌MCF-7/ADR的抑制活性，Slit2D2-HSA能夠抑制SDF-1誘導(dǎo)下乳腺癌MCF-7/ADR細胞的遷移，在濃度為0.1Um條件下其抑制率為58％(P<0.001)；在濃度為1Um條件下其抑制率為：71％(P<0.001)；SlitN在濃度為0.1Um條件下對MCF-7/ADR細胞的遷移具有明顯的促進效果效果，與Slit2D2-HSA效果相反。圖11顯示了肝癌SMMC7721的抑制活性，Slit2D2-HSA能夠抑制SDF-1誘導(dǎo)下肝癌SMMC7721細胞的遷移，在濃度為0.1Um條件下其抑制率為68％(P<0.001)；在濃度為1Um條件下其抑制率為：99％(P<0.001)；SlitN在濃度為0.1Um條件下對SMMC7721細胞的遷移具有明顯的促進效果效果，與Slit2D2-HSA效果相反。圖12顯示了血管內(nèi)皮細胞遷移實驗結(jié)果。Slit2D2-HSA能夠抑制VEGF誘導(dǎo)下血管內(nèi)皮細胞的遷移。實施例3.人乳腺癌MDA-MB-231-Luc尾靜脈注射轉(zhuǎn)移模型的藥效學(xué)研究3.1細胞株及細胞準(zhǔn)備MDA-MB-231-Luc細胞株：購自南京金斯瑞生物科技有限公司。RPMI1640+10％胎牛血清+1％青/鏈霉素培養(yǎng)液中，置于37℃、5％CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3.2實驗動物種系與數(shù)量：SCID-Beige小鼠，32只年齡與性別：6-8周齡，♀，18-22g供應(yīng)商：上海靈暢生物科技有限公司飼養(yǎng)環(huán)境：SPF級動物房3.3試劑RPMI1640培養(yǎng)液:Hyclone,Cat.No.:SH30809.01B；胎牛血清:BiologicalIndustries,Cat.No.:04-001-1a；青/鏈霉素:Gibco,Cat.No.:15070-063；0.25％胰酶-EDTA:Invitrogen,Cat.No.:25200-072；HBSS-/-:Invitrogen,Cat.No.:14175；受試藥物：Slit2D2-HSA，濃度：1mg/ml，規(guī)格：500ul/支*20，性狀：液體，儲存條件：-80℃；Plerixafor，規(guī)格：5mg，性狀：白色粉末，儲存條件：-20℃，藥物配制：各組受試藥物均采用PBS稀釋至相應(yīng)濃度后進行給藥，稀釋后溶液保存于4℃待用。陽性對照藥物Plerixafor采用PBS溶解至相應(yīng)濃度并進行給藥，溶液保存于4℃待用。3.4實驗步驟動物接種擴增MDA-MB-231-Luc細胞，按1.5×106細胞量/只小鼠，分別進行32只SCID小鼠的尾靜脈注射，后進行后續(xù)的藥效學(xué)研究。分組與給藥建模當(dāng)天將小鼠隨機分為4組，每組8只小鼠，并于造模當(dāng)天開始給藥治療。具體分組及給藥見表1：表1:動物分組與給藥觀察和檢測接種后至實驗結(jié)束前，每天觀察動物狀態(tài)，若發(fā)現(xiàn)動物生病或異常死亡，則由獸醫(yī)進行處理或解剖。給藥過程中，若動物體重下降超過20％，動物需要停藥。若實驗過程中，有荷瘤鼠死亡，及時估計并記錄死亡時間、解剖以進行尸檢。如果不能及時解剖，則先放入-20℃冰箱以減少組織自溶；若荷瘤鼠狀態(tài)很差或瀕臨死亡，根據(jù)動物福利，應(yīng)實行安樂死；體重下降超過基礎(chǔ)體重的30％，也應(yīng)實行安樂死。動物體重：每周兩次進行動物體重稱量，并記錄。腫瘤生長情況的測量：細胞接種當(dāng)天記為Day0,分別為Day0、Day3、Day8、Day13、D17、D21共6個時間點進行動物生物發(fā)光活體成像的檢測腫瘤轉(zhuǎn)移速率＝(第21天熒光值-第8天熒光值)/第8天熒光值；腫瘤轉(zhuǎn)移速率越小，表明藥物抑制腫瘤轉(zhuǎn)移能力越強。(腫瘤前7d在體內(nèi)處于平穩(wěn)期，從第8d開始表現(xiàn)出生長和轉(zhuǎn)移趨勢)圖13顯示了人乳腺癌MDA-MB-231-Luc尾靜脈注射轉(zhuǎn)移模型的藥效學(xué)研究，結(jié)果顯示，Slit2D2-HSA蛋白能夠顯著抑制MDA-MB-231細胞在小鼠體內(nèi)的肺部轉(zhuǎn)移。實施例4.測試藥物在MDA-MB-231人乳腺癌原位移植BALB/c裸小鼠動物模型中的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用和安全性評價細胞培養(yǎng)：MDA-MB-231細胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清的L-15培養(yǎng)液中。收集指數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞至適合濃度用于裸鼠原位腫瘤接種。動物造模及分組：BALB/cnude裸鼠，雌性，4-5周，14-18g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。分組后共2組，每組10只。所有實驗小鼠均飼養(yǎng)在SPF級動物房中，并且提前適應(yīng)環(huán)境至少7天。實驗小鼠右側(cè)乳腺脂肪墊下接種1×107MDA-MB-231細胞，細胞重懸在1：1的L-15培養(yǎng)液與基質(zhì)膠中(0.1ml/只)，定期觀察腫瘤生長情況，待腫瘤生長至平均～150mm3時根據(jù)腫瘤大小和小鼠體重隨機分組給藥。給藥兩周后，手術(shù)切除腫瘤組織，繼續(xù)給藥六周。詳細的給藥方法、給藥劑量和給藥途徑見表1。表2MDA-MB-231動物模型中的給藥途徑、劑量及方案注：n：動物只數(shù)；給藥體積為10ul/g；i.p.：腹腔注射給藥。各組受試藥物均采用PBS稀釋至相應(yīng)濃度后進行給藥，稀釋后溶液保存于4℃待用。藥物為蛋白類，避免反復(fù)凍融。實驗動物飼養(yǎng)室的環(huán)境條件：實驗動物均飼養(yǎng)于恒溫恒濕的獨立通風(fēng)盒內(nèi)，飼養(yǎng)室溫度20-26℃，濕度30-70％，10-20次/小時換氣，晝夜明暗交替時間12h/12h；持續(xù)供給鈷60放射滅菌鼠全價顆粒飼料，不限量自由攝取，飲用自來水(高壓蒸汽滅菌后使用)，飲水瓶不間斷供水，自由攝取。飼養(yǎng)鼠盒是聚砜鼠盒，無病原微生物；墊料是玉米芯，每盒5只動物，籠卡上標(biāo)明IACUC批準(zhǔn)號、實驗編號、實驗開始時間、課題負責(zé)人、實驗人員、動物來源、組別和動物號等；實驗動物打耳號進行標(biāo)記。無菌操作：化合物溶液的配制、給藥、腫瘤測量及體重稱量等全部過程都在生物安全柜或超凈工作臺中進行。隨機分組：在給藥開始前，稱量所有動物的體重，并用游標(biāo)卡尺測量腫瘤體積。鑒于腫瘤體積會影響治療的有效性，所以用隨機分組設(shè)計的方法，根據(jù)鼠的腫瘤體積對其分組，以保證不同組別間的腫瘤體積相似。實驗觀察和數(shù)據(jù)收集：試驗過程中，動物實驗操作均根據(jù)AAALAC的要求。腫瘤接種后，常規(guī)監(jiān)測包括了腫瘤生長及治療對動物正常行為的影響，具體內(nèi)容有實驗動物的活動性，攝食和飲水情況，體重增加或降低情況，眼睛、被毛及其它異常情況。試驗過程中觀察到的臨床癥狀均記錄在原始數(shù)據(jù)中。整個實驗過程中，每周測量兩次小鼠的體重和腫瘤的大小。腫瘤大小計算公式：腫瘤體積(mm3)＝0.5×(腫瘤長徑×腫瘤短徑2)。實驗終結(jié)時,采集肺組織和淋巴組織，對收集的肺組織和淋巴組織進行H.E.染色,計數(shù)肺組織和淋巴組織中的轉(zhuǎn)移灶，統(tǒng)計發(fā)生轉(zhuǎn)移的動物數(shù)量。實驗觀察指標(biāo)及計算：1.相對腫瘤抑制率TGI(％)：TGI％＝(1-T/C)×100％。T/C％為相對腫瘤增值率，即在某一時間點，治療組和對照組相對腫瘤體積或瘤重的百分比值。T和C分別為治療組和對照組在某一特定時間點的相對腫瘤體積(RTV)或瘤重(TW)。計算公式如下：T/C％＝TRTV/CRTV×100％(TRTV：治療組平均RTV；CRTV：溶媒對照組平均RTV；RTV＝Vt/V0，V0為分組時該動物的瘤體積，Vt為治療后該動物的瘤體積)。或T/C％＝TTW/CTW×100％(TTW：治療組實驗終結(jié)時平均瘤重；CTW：溶媒對照組實驗終結(jié)時平均瘤重)。2.腫瘤轉(zhuǎn)移率T/C(％)：T/C％＝T/C×100％。T/C％為腫瘤轉(zhuǎn)移率，即在實驗結(jié)束時，治療組和對照組相對腫瘤轉(zhuǎn)移率的百分比值。T和C分別為治療組和對照組在實驗終結(jié)時肺和淋巴組織中腫瘤轉(zhuǎn)移的數(shù)目。結(jié)束實驗標(biāo)準(zhǔn)：在實驗過程中，會密切觀察老鼠的進食、進水及體重狀態(tài)。達到以下標(biāo)準(zhǔn)時將對老鼠進行安樂死：當(dāng)一組動物平均瘤體積超過3000mm3，或者在動物在瀕臨死亡前將或整組動物安樂死。當(dāng)小鼠體重下降>20％超過72小時，將對其實施安樂死。若小鼠有其他健康問題，如：持續(xù)稀便，呼吸困難，弓背或者不能夠正常采食與飲水時，將其安樂死。當(dāng)對照組小鼠瘤體積均值超過2000mm3時或最后一次給藥后一星期將終止實驗。統(tǒng)計學(xué)處理：所有實驗結(jié)果以平均瘤體積±SE(標(biāo)準(zhǔn)誤差)表示。用單因素方差分析(onewayANOVA)檢驗方法比較治療組腫瘤體積，瘤重和肺腫瘤轉(zhuǎn)移率與對照組相比有無顯著性差異。所有的數(shù)據(jù)均用SPSS18.0進行分析。p<0.05為具有顯著性差異。圖14顯示了藥物在MDA-MB-231人乳腺癌原位移植BALB/c裸小鼠動物模型中的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用和安全性評價。圖14A顯示了不同實驗組中小鼠的腫瘤體積，顯示融合蛋白實驗組的腫瘤體積明顯小于溶媒對照組；圖14B顯示了腫瘤的生長曲線，融合蛋白實驗組中腫瘤生長速度顯著低于溶媒對照組；圖14C顯示各實驗組中接種腫瘤后，小鼠體重的變化情況，對照組和實驗組無顯著差別，表明本發(fā)明的融合蛋白無明顯的毒副作用。圖14D顯示各實驗組接種腫瘤細胞并長到一定階段后，通過手術(shù)切除腫瘤方法建立轉(zhuǎn)移評價模型，評價藥物對腫瘤細胞轉(zhuǎn)移抑制效果,圖14E顯示了腫瘤肺轉(zhuǎn)移H&E染色，圖14F(A為對照，B為1mg/kgSlit2D2-HSA,C為5mg/kgSlit2D2-HSA,D為10mg/kgSlit2D2-HSA)顯示了腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移H&E染色。上述結(jié)果顯示Slit2D2-HSA蛋白在10mg/kg給藥劑量下能夠一定程度抑制MDA-MB-231細胞的生長，抑瘤率達到33.4％；另外，本發(fā)明的融合蛋白對MDA-MB-231細胞在小鼠體內(nèi)的肺轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有抑制作用，其中5mg/kg給藥效果優(yōu)于10mg/kg。5mg/kg給藥劑量下陽性轉(zhuǎn)移率為66.7％,而對照組為90％，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度>10％的比率只有22％，而對照組達到50％。顯示該藥物具有較好的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移活性，給藥組與對照組動物體重?zé)o顯著差別，顯示藥物無明顯毒副作用。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。引用文獻Wang,B.,Y.Xiao,B.B.Ding,N.Zhang,X.Yuan,L.Gui,K.X.Qian,S.Duan,Z.Chen,Y.RaoandJ.G.Geng(2003)."InductionoftumorangiogenesisbySlit‐RobosignalingandinhibitionofcancergrowthbyblockingRoboactivity."CancerCell4(1):19‐29.Wang,L.J.,Y.Zhao,B.Han,Y.G.Ma,J.Zhang,D.M.Yang,J.W.Mao,F.T.Tang,W.D.Li,Y.Yang,R.WangandJ.G.Geng(2008)."TargetingSlit‐Roundaboutsignalinginhibitstumorangiogenesisinchemical‐inducedsquamouscellcarcinogenesis."CancerSci99(3):510‐517.Hohenester,E.(2008)."StructuralinsightintoSlit‐Robosignalling."BiochemSocTrans36(Pt2):251‐256.Morlot,C.,W.Hemrika,R.A.Romijn,P.Gros,S.CusackandA.A.McCarthy(2007)."ProductionofSlit2LRRdomainsinmammaliancellsforstructuralstudiesandthestructureofhumanSlit2domain3."ActaCrystallogrDBiolCrystallogr63(Pt9):961‐968.Seiradake,E.,A.C.vonPhilipsborn,M.Henry,M.Fritz,H.Lortat‐Jacob,M.Jamin,W.Hemrika,M.Bastmeyer,S.CusackandA.A.McCarthy(2009)."StructureandfunctionalrelevanceoftheSlit2homodimerizationdomain."EMBORep10(7):736‐741.當(dāng)前第1頁1 2 3