本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種人甲狀旁腺激素PTH(1-34)融合蛋白及其在制備藥物組合物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：骨質(zhì)疏松癥是一種以低骨量和骨組織退化為特征的最常見的代謝性骨病。市場上多數(shù)治療骨質(zhì)疏松癥的藥物，如雌激素、雙磷酸鹽類和降血鈣素均屬骨吸收抑制劑。而其他一些藥物，如氟化物、甲狀旁腺激素(PTH)則屬于骨形成促進(jìn)劑。PTH(1-34)(teriparatide)的商品名為Forteo，由禮來公司研制開發(fā)，2002年12月在美國首次上市，隨后相繼在奧地利、丹麥、芬蘭、德國、希臘、冰島、愛爾蘭、荷蘭、挪威、葡萄牙、瑞士、英國、澳大利亞等國上市。該品于2011年進(jìn)口到我國市場，適用于患骨質(zhì)疏松癥、有高度骨折危險的絕經(jīng)期婦女，亦適用于有高度骨折危險的原發(fā)性或性腺功能減退性骨質(zhì)疏松癥男性患者，包括有骨質(zhì)疏松性骨折史、有骨折多種危險因素或經(jīng)評價對先前療法無效或不耐受的骨質(zhì)疏松癥患者。該品原研產(chǎn)品為重組人甲狀旁腺激素(rhPTH)1-34，與內(nèi)源性PTH類似，可與特異性高親和性細(xì)胞表面受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用。動物實(shí)驗表明，該品以1次/天給藥對成骨細(xì)胞的刺激作用高于其對破骨細(xì)胞的作用，可引起小梁骨和皮質(zhì)骨表面的新骨生成。此外，可改善小梁骨微結(jié)構(gòu)，并通過刺激松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨中的新骨生成，增加骨量，提高骨強(qiáng)度。臨床研究提示，該品的促合成效應(yīng)表現(xiàn)為增加骨量、骨形成和再吸收，從而提高骨強(qiáng)度。與安慰劑組病例相比，使用PTH(1-34)治療1～2年可使脊骨骨折危險性下降65％，非外傷性非脊骨骨折危險性下降53％?，F(xiàn)有的PTH(1-34)藥物不具有緩釋性，每天靜脈或皮下注射一次，病人治療時痛苦較大，依從性較低。PTH(1-34)的消除半衰期約為1小 時，安全性及患者對PTH(1-34)的耐受性良好，這使得開發(fā)長效作用的衍生物以減少每天一次注射帶來的不便成為可能。為了解決以上問題，科研人員對PTH(1-34)劑型進(jìn)行研究，開發(fā)出了PTH(1-34)緩釋微球制劑(例如CN103157096A)，但是，藥物在緩釋微球中包埋的工藝難度較大，特別是在大規(guī)模生產(chǎn)中，這個問題更加難以解決。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷，一方面提供了一種PTH(1-34)-Fc融合蛋白，該融合蛋白中的PTH(1-34)部分來自人甲狀旁腺激素(rhPTH)1-34和柄區(qū)的部分序列，免疫球蛋白Fc部分包括其鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)，PTH(1-34)序列和Fc序列之間直接融合或經(jīng)連接序列而融合。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫球蛋白Fc片段選自人或動物的免疫球蛋白Fc，為Fc全長或部分序列。在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)c選自IgG，包括其各種亞型，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，特別優(yōu)選IgG1。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白由人甲狀旁腺激素(rhPTH)1-34的第1至34氨基酸序列與免疫球蛋白IgG1Fc融合而成，該融合蛋白的序列如序列1所示。本發(fā)明另一方面提供了一種特異性擴(kuò)增上述特別優(yōu)選的融合蛋白的引物，其具有序列7和序列8所示的核苷酸序列。在本發(fā)明另一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白由人甲狀旁腺激素(rhPTH)1-34的第1至42氨基酸序列與免疫球蛋白IgG1Fc融合而成，其序列如序列2所示。本發(fā)明另一方面提供了一種特異性擴(kuò)增上述特別優(yōu)選的融合蛋白的引物，其具有序列9和序列10所示的核苷酸序列。在本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白由人甲狀旁腺激素(rhPTH)1-34的第1至34氨基酸序列，連接序列6G1y，免疫球蛋白IgG1Fc融合而成，其序列如序列3所示。本發(fā)明另一方面提供了一種特異性擴(kuò)增上述最優(yōu)選的融合蛋白的引物，其具有序列11和序列12所示的核苷酸序列。本發(fā)明再一方面還提供了編碼本發(fā)明所述融合蛋白的DNA分子。在本 發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，該DNA分子具有序列4-6所示的核苷酸序列。本發(fā)明再一方面還提供了含有上述DNA分子的重組表達(dá)載體，其中優(yōu)選質(zhì)粒pET-32a。本發(fā)明再一方面還提供了含有上述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，其可以選自哺乳動物細(xì)胞、細(xì)菌、酵母和昆蟲細(xì)胞，優(yōu)選CHO細(xì)胞。本發(fā)明再一方面還提供了包含本發(fā)明所述融合蛋白的藥物組合物，其包含藥物可接受載體，該藥物組合物優(yōu)選為注射劑，包括水劑和冷凍干燥注射劑。本發(fā)明再一方面還提供了一種生產(chǎn)PTH(1-34)-Fc融合蛋白的方法，包括如下步驟：1、用上述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，獲得重組菌株；2、培養(yǎng)上述重組菌株，誘導(dǎo)所述融合蛋白的表達(dá)；3、回收并純化所表達(dá)的融合蛋白。本發(fā)明再一方面還提供了另外一種生產(chǎn)PTH(1-34)-Fc融合蛋白的方法，包括如下步驟：1、在適合表達(dá)融合蛋白的條件下，培養(yǎng)上述的宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)所述融合蛋白的表達(dá)；2、回收并純化所表達(dá)的融合蛋白。本發(fā)明再一方面還提供了本發(fā)明所述的融合蛋白、本發(fā)明所述的引物、本發(fā)明所述的DNA分子、本發(fā)明所述的重組表達(dá)載體以及本發(fā)明所述的宿主細(xì)胞在制備藥物組合物中的應(yīng)用。本發(fā)明最后還提供了一種生產(chǎn)藥物組合物的方法，包括如下步驟：1、采用本發(fā)明所述的方法生產(chǎn)PTH(1-34)-Fc融合蛋白；2、將上述融合蛋白與藥物可接受載體混合；3、按照制劑技術(shù)制備成所需要的劑型。由上述描述可知，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明將人IgG衍生的Fc區(qū)域連接于PTH(1-34)的C末端，從而有效延長了PTH(1-34)的循環(huán)半衰期和/或增加了其生物活性。因此，本發(fā)明的融合蛋白有效克服了現(xiàn)有PTH(1-34)降解的問題，具備長效生物學(xué)活性，其蛋白表達(dá)量高，可用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。附圖說明圖1為本發(fā)明三種PTH(1-34)-Fc融合蛋白結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為本發(fā)明三種PTH(1-34)-Fc融合蛋白在CHO細(xì)胞中蛋白表達(dá)量的比較圖。圖3為純化的P1、P2、P3融合蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳分析圖。具體實(shí)施方式下面通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，旨在用于說明本發(fā)明而非限定本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也同樣落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明所使用的英文縮寫的含義列于表1中。表1本發(fā)明使用的引文縮寫的中文含義表英文縮寫中文含義PTH甲狀旁腺激素DNA脫氧核糖核酸PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)IgG免疫球蛋白G實(shí)施例1：融合蛋白及其質(zhì)粒的構(gòu)建首先委托RNA合成公司合成RNA，然后用逆轉(zhuǎn)錄酶從RNA合成cDNA。再用不同的引物利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增獲得所需要的PTH(1-34)片段。免疫球蛋白的Fc片段從已克隆的IgGlFc質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得。最后用PCR將PTH(1-34)片段斷和Fc序列相融合，從而構(gòu)建成PTH(1-34)-Fc融合蛋白的DNA序列。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)包括：變性95℃，30秒；退火56℃，45秒；延伸72℃，2分鐘，30個循環(huán)。用TAcloning試劑盒，把PTH(1-34)和Fc的PCR產(chǎn)物分別克隆入pET-32a質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染，E.coliBL21(DE3)，選取白色菌落，加入LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜。再用Qiangen質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切和測序鑒定PTH(1-34)和Fc序列。最后，采用拼接PCR方法把PTH (1-34)和IgGFc的cDNA連接在一起。將PTH(1-34)-Fc片段插入表達(dá)質(zhì)粒中。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染E.coli，選取陽性菌落，提取質(zhì)粒后經(jīng)酶切和測序鑒定目的序列。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞以獲得融合蛋白的表達(dá)。P1蛋白：PTH(1-34)1-34氨基酸+Fc。其氨基酸和DNA序列見序列表序列1和4。P2蛋白：PTH(1-34)1-42氨基酸+Fc。見序列表序列2和5。P3蛋白：PTH(1-34)1-34氨基酸+連接序列6Gly+Fc。見序列表序列3和6。AVSEIQFMHNLGKHLSSMERVEWLRKKLQDVHNFP1融合蛋白引物序列：正向引物：AGCCGTGTGGACC反向引物：GAGCTTGTTCP2融合蛋白引物序列：正向引物：AGCCGTGTGGA反向引物：GAGCTCTGGTP3融合蛋白引物序列：正向引物：AGCCGTGTGG反向引物：ACCTCCACCTCCA實(shí)施例2：PTH(1-34)-Fc融合蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)本實(shí)施例以哺乳動物細(xì)胞為例提供了表達(dá)PTH(1-34)-Fc融合蛋白的實(shí)例。將P1，P2，P3三種融合蛋白克隆到pET-32a質(zhì)粒(Invitrogen)中。融合蛋白的5’末端添加人F1t-1信號肽序列。用質(zhì)粒DNA提純試劑盒(MoBio公司)提取上述三種PTH(1-34)-Fc高純度質(zhì)粒DNA。然后利用FUGEN6轉(zhuǎn)染試劑盒(ROCHE公司)將質(zhì)粒DNA分別導(dǎo)入CHO細(xì)胞中。我們用瞬時轉(zhuǎn)染(Transienttransfection)的方法，對這四種PTH(1-34)-Fc融合蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行了比較。用含10％胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基將CHO細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至一定時，將質(zhì)粒DNA與FUGEN6試劑(Roche)的復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)三天后收集上清液。這些細(xì)胞上清液中含有表達(dá)的融合蛋白。融合蛋白的濃度用ELISA法定量確定。蛋白的濃度結(jié)果參見說明書附圖2，其中融合蛋白的 表達(dá)量以P3最高，P2其次，P1最低。因此，從蛋白的表達(dá)量來說，P3融合蛋白是最佳的分子組合。實(shí)施例3：高效表達(dá)細(xì)胞系的建立在確定P3融合蛋白是最佳的分子組合后，采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和基因擴(kuò)增的方法建立了CHO穩(wěn)定高效表達(dá)細(xì)胞株。將含有P3融合蛋白的基因克隆到含DHFR基因的質(zhì)粒中。用MoBio公司的DNA提純試劑盒提取高純度質(zhì)粒DNA，再采用電鉆孔法轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在選擇培養(yǎng)中進(jìn)行克隆培養(yǎng)，獲得抗性克隆。用氨甲碟呤(MTX)加壓進(jìn)行基因擴(kuò)增，得到高效表達(dá)的細(xì)胞株。最后將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，在生物反應(yīng)器中大規(guī)模生產(chǎn)該融合蛋白。融合蛋白的濃度用ELISA法定量確定。用該方法，成功地大規(guī)模生產(chǎn)了P3融合蛋白。產(chǎn)量可達(dá)100mg/L。實(shí)施例4：PTH(1-34)-Fc融合蛋白的純化用1NNaOH將含有融合蛋白的條件培養(yǎng)基滴定到pH7-8，然后用0.45微米硝酸纖維濾膜過濾。將濾液加到磷酸鹽緩沖鹽(PBS)平衡的ProsepA柱上。待融合蛋白結(jié)合于ProsepA后，棄去流出的部分。用PBS洗滌該柱，直到280nm處的OD值低于0.01。然后用0.1MpH為3.75的檸檬酸緩沖液洗脫結(jié)合的融合蛋白。用0.4體積的1MK2HPO4中和，合并含有目標(biāo)產(chǎn)物的組分，并用PBS透析。然后用0.22微米硝酸纖維濾膜過濾，并儲存在4℃。實(shí)施例5：融合蛋白的電泳鑒定本實(shí)施例采用實(shí)驗證明優(yōu)化的融合蛋白在表達(dá)過程中不發(fā)生降解。將P1、P2、P3融合蛋白高效表達(dá)細(xì)胞株在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，等細(xì)胞生長至高密度后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，用A蛋白親和層析提純?nèi)诤系鞍?。將純化的融合蛋白與聚丙烯酰胺凝膠樣品緩沖液混合，置于沸水浴中3分鐘。將蛋白在聚丙烯酰胺凝膠加樣后電泳。電泳后的凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色，甲醇脫色后觀察蛋白條帶。實(shí)驗結(jié)果顯示P1、P2、P3蛋白呈單一條帶，參見說明書附圖3，電泳結(jié)果顯示，從CHO高效表達(dá)細(xì)胞系生產(chǎn)的P1、P2、P3融合蛋白呈單一條帶，其分子量約為420kD，與預(yù)期的融合蛋白的分子量相吻合。重要的是，沒有觀測到分子量小于420kD的蛋白條帶。這一結(jié)果 說明本發(fā)明的融合蛋白序列有效地防止了蛋白在表達(dá)過程中被切割和降解，可以用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。實(shí)施例6：PTH(1-34)-GlyGlyGlyGlyGlyGly-Fc融合蛋白在體外成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系中的活性檢測/破骨細(xì)胞形成實(shí)驗(TRACP染色法)首先，在無菌條件下，去除3-6周小鼠股骨，并沖洗骨髓腔，離心收集洗下的骨髓細(xì)胞。培養(yǎng)基重懸骨髓細(xì)胞，用直徑為10cm的培養(yǎng)皿在37℃，5％二氧化碳條件下培養(yǎng)2d。收集培養(yǎng)皿中的骨髓細(xì)胞培養(yǎng)液上清，合并上清液并離心收集細(xì)胞。用一定體積的培養(yǎng)基對細(xì)胞進(jìn)行重懸，血球計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。之后按16*104/孔鋪板，用培養(yǎng)基補(bǔ)至培養(yǎng)基體積為1mL，加藥后于37℃，5％二氧化碳條件下培養(yǎng)。實(shí)驗設(shè)對照組、PTH(1-34)陽性組、IgG組、融合蛋白P3組。每組設(shè)3個平行復(fù)孔。給藥濃度為10-7mol/L。分別在給藥后第1、3、5、7天對貼壁細(xì)胞進(jìn)行TRACP(耐酒石酸酸性磷酸酶)染色(TRACP/ALP染色試劑盒購自Takara)，具體步驟如下：往待測24孔板的孔中添加250μLFixationsolution固定細(xì)胞，室溫放置5min。每孔添加2mL無菌水清洗一次，移去液體。配制好含10％酒石酸的ACP(酸性磷酸酶)底物溶液，每孔添加250μL，蓋上蓋板于37℃孵育15-45min。移去上清液，用無菌水洗滌3次以終止顯色。顯微鏡下計算每孔中被染成紫紅色的細(xì)胞數(shù)(參見表2)。表2小鼠股骨骨髓培養(yǎng)體系的TRACP染色統(tǒng)計表(貼壁細(xì)胞計數(shù)/個)從實(shí)驗結(jié)果可以看到，本發(fā)明所優(yōu)化構(gòu)建的融合蛋白P3克服了PTH (1-34)降解的問題，具備長效生物學(xué)活性，其蛋白表達(dá)量高，可以用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。實(shí)施例7：PTH(1-34)-Fc融合蛋白在體外成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系中的活性檢測/破骨細(xì)胞形成實(shí)驗(TRACP染色法)首先，在無菌條件下，去除3-6周小鼠股骨，并沖洗骨髓腔，離心收集洗下的骨髓細(xì)胞。培養(yǎng)基重懸骨髓細(xì)胞，用直徑為10cm的培養(yǎng)皿在37℃，5％二氧化碳條件下培養(yǎng)2d。收集培養(yǎng)皿中的骨髓細(xì)胞培養(yǎng)液上清，合并上清液并離心收集細(xì)胞。用一定體積的培養(yǎng)基對細(xì)胞進(jìn)行重懸，血球計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。之后按16*104/孔鋪板，用培養(yǎng)基補(bǔ)至培養(yǎng)基體積為1mL，加藥后于37℃，5％二氧化碳條件下培養(yǎng)。實(shí)驗設(shè)對照組、PTH(1-34)陽性組、IgG組、融合蛋白P1組。每組設(shè)3個平行復(fù)孔。給藥濃度為10-7mol/L。分別在給藥后第1、3、5、7天對貼壁細(xì)胞進(jìn)行TRACP(耐酒石酸酸性磷酸酶)染色(TRACP/ALP染色試劑盒購自Takara)，具體步驟如下：往待測24孔板的孔中添加250μLFixationsolution固定細(xì)胞，室溫放置5min。每孔添加2mL無菌水清洗一次，移去液體。配制好含10％酒石酸的ACP(酸性磷酸酶)底物溶液，每孔添加250μL，蓋上蓋板于37℃孵育15-45min。移去上清液，用無菌水洗滌3次以終止顯色。顯微鏡下計算每孔中被染成紫紅色的細(xì)胞數(shù)(參見表3)。表3小鼠股骨骨髓培養(yǎng)體系的TRACP染色統(tǒng)計表(貼壁細(xì)胞計數(shù)/個)從實(shí)驗結(jié)果可以看到，本發(fā)明所優(yōu)化構(gòu)建的融合蛋白P1克服了PTH(1-34)降解的問題，具備長效生物學(xué)活性，其蛋白表達(dá)量高，可以用于 工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。實(shí)施例8：PTH(1-42)-Fc融合蛋白在體外成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系中的活性檢測/破骨細(xì)胞形成實(shí)驗(TRACP染色法)首先，在無菌條件下，去除3-6周小鼠股骨，并沖洗骨髓腔，離心收集洗下的骨髓細(xì)胞。培養(yǎng)基重懸骨髓細(xì)胞，用直徑為10cm的培養(yǎng)皿在37℃，5％二氧化碳條件下培養(yǎng)2d。收集培養(yǎng)皿中的骨髓細(xì)胞培養(yǎng)液上清，合并上清液并離心收集細(xì)胞。用一定體積的培養(yǎng)基對細(xì)胞進(jìn)行重懸，血球計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。之后按16*104/孔鋪板，用培養(yǎng)基補(bǔ)至培養(yǎng)基體積為1mL，加藥后于37℃，5％二氧化碳條件下培養(yǎng)。實(shí)驗設(shè)對照組、PTH(1-34)陽性組、IgG組、融合蛋白P2組。每組設(shè)3個平行復(fù)孔。給藥濃度為10-7mol/L。分別在給藥后第1、3、5、7天對貼壁細(xì)胞進(jìn)行TRACP(耐酒石酸酸性磷酸酶)染色(TRACP/ALP染色試劑盒購自Takara)，具體步驟如下：往待測24孔板的孔中添加250μLFixationsolution固定細(xì)胞，室溫放置5min。每孔添加2mL無菌水清洗一次，移去液體。配制好含10％酒石酸的ACP(酸性磷酸酶)底物溶液，每孔添加250μL，蓋上蓋板于37℃孵育15-45min。移去上清液，用無菌水洗滌3次以終止顯色。顯微鏡下計算每孔中被染成紫紅色的細(xì)胞數(shù)(參見表4)。表4小鼠股骨骨髓培養(yǎng)體系的TRACP染色統(tǒng)計表(貼壁細(xì)胞計數(shù)/個)從實(shí)驗結(jié)果可以看到，本發(fā)明所優(yōu)化構(gòu)建的融合蛋白P2克服了PTH(1-34)降解的問題，具備長效生物學(xué)活性，其蛋白表達(dá)量高，可以用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。當(dāng)前第1頁1 2 3