專利名稱：一類人工靶向融合蛋白和蛋白偶聯(lián)物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制藥及分子診斷領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一類半衰期和靶向性可進行人工改造而不影響其穩(wěn)定性和功能部分的非抗體類靶向結(jié)合分子，及其衍生的融合蛋白或蛋白偶聯(lián)物，乃至以上蛋白的制備方法和應(yīng)用。
背景介紹非抗體類祀向結(jié)合分子(non-antibodyscaffold ；antibody mimetics)是新一代靶向藥物的發(fā)展方向。與抗體類似，非抗體類靶向結(jié)合分子能夠?qū)崿F(xiàn)高度的特異性和親和力，具備高度的熱穩(wěn)定性，但體積只有抗體的1/5-1/10甚至更小，而且能夠避免抗體藥物產(chǎn)業(yè)化中的幾個關(guān)鍵性制約因素，如(I)生產(chǎn)成本高；(2)穿透性差，修飾困難；(3)局限于部分疾病靶點；(4)關(guān)鍵性技術(shù)(如人源化、生產(chǎn)、篩選文庫等)已被壟斷，知識產(chǎn)權(quán)附加費 高昂。非抗體類靶向結(jié)合分子能夠在成本低廉的大腸桿菌和酵母細胞進行生產(chǎn)，容易修飾，而且理論上能夠結(jié)合絕大多數(shù)疾病靶點，包括化學分子、多肽和各種構(gòu)型的蛋白靶點。非抗體類靶向結(jié)合分子的產(chǎn)業(yè)化剛起步，知識產(chǎn)權(quán)爭端少。以上這些特點，使非抗體類靶向結(jié)合分子的藥物產(chǎn)業(yè)化具備廣闊的發(fā)展空間。從1997年到現(xiàn)在，約60個非抗體類靶向結(jié)合分子原型蛋白被發(fā)現(xiàn)，至少38個品種處于臨床前研究，超過10個品種進入臨床階段(6個品種處于2期)，2009年10月，有I個上市藥物(Ecallantide,美國Dyax公司)。預計第一批非抗體類祀向結(jié)合分子藥物的上市將于2015年前出現(xiàn)。目前該領(lǐng)域的代表性核心專利如下錨蛋白重復蛋白(EP1332209);C-型凝集素(US2004132094，EP1341912);金黃色葡萄球菌A結(jié)構(gòu)域蛋白(US5831012，EP0739353);轉(zhuǎn)鐵蛋白(US2004023334，EP1427750);載脂蛋白(US7250297，EP1017814)；纖維連接蛋白(US6818418，EP1266025) ；Kunitz結(jié)構(gòu)域型蛋白酶抑制劑(US2004209243，EP1587907);伽馬晶狀體(US2007111287，EP1200583);半胱氨酸結(jié)或打結(jié)素(US7186524，EP1328628);硫氧還蛋白 A (US6004746, EP0773952);核酸配基(US5475096，EP0786469)；定向進化獲得的靶向特異性蛋白酶(US2004146938，EP1608947);多聚物分子印跡產(chǎn)生的人造抗體(US2004157209，EP1292637)。例如，1995年由瑞典科學家Bj5rn Nilsson申請的專利US5831012和EP0739353，介紹并保護的是自然界細菌受體結(jié)構(gòu)域的表面暴露氨基酸發(fā)生突變產(chǎn)生的新型蛋白；沒有發(fā)生連續(xù)的基本結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性丟失獲得的蛋白；從包含了一系列新型蛋白的蛋白文庫中篩選獲得的蛋白；以及人造細菌受體結(jié)構(gòu)的制備方法。這項專利相關(guān)的產(chǎn)物是Affibody公司
的非抗體類革巴向結(jié)合分子蛋白-金黃色葡萄球菌A結(jié)構(gòu)域蛋白(Affibodies),它們是一
種蛋白質(zhì)結(jié)合配體，類似于抗體，卻有著抗體所沒有的優(yōu)點分子較小-只有抗體的4%，但其結(jié)合位點與抗體的相似；非常穩(wěn)定的，容易制造，儲存而且耐高溫；非特異性結(jié)合率非常低；與抗體相較，非常廉宜；能以幾克/升的濃度批量生產(chǎn)。又例如，2004年由美國Dyax公司的科學家Ladner Robert C和Nixon Andrew申請的專利US2004209243和EP1587907，介紹并保護的是Kunitz結(jié)構(gòu)域文庫，載體，噬菌體，宿主細胞以及展示Kunitz結(jié)構(gòu)域的方法。2009年10月，該公司的第一個非抗體類祀向結(jié)合分子藥物ecallantide上市，用于治療在遺傳性血管水腫(HAE)患者中可能發(fā)生的突發(fā)性、致命性體液増加，這也是世界上的第一個非抗體類靶向結(jié)合分子藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的ー個目的是提供ー類新型的人工改造后可與靶抗原特異性結(jié)合的、基于人源蛋白的非抗體類靶向結(jié)合分子(下文中稱人源蛋白基結(jié)合分子)。本發(fā)明的另ー個目的是提供了將該類結(jié)合分子與一個或多個功能分子(如化學小分子藥物、多肽藥物、蛋白藥物、顯影標記)連接的方法。根據(jù)該類結(jié)合分子的靶抗原的不同，所得融合蛋白或蛋白偶聯(lián)物可以用于延長功能分子在體內(nèi)的半衰期或提高功能分子的靶向性，其效果受到結(jié)合分子與靶抗原的結(jié)合強度影響。本發(fā)明還提供了針對靶抗原篩選人源蛋白基結(jié)合分子的方法，以及制備人源蛋白基結(jié)合分子的方法。此外，本發(fā)明還提供了包含人源蛋白基結(jié)合分子的組合物，以及此類組合物在多種治療和診斷應(yīng)用中的用途。從而一方面，本發(fā)明提供了一類人源蛋白基結(jié)合分子，相比于野生型序列(SEQ IDNO: I)的特定區(qū)域，有至少ー個氨基酸被改變以產(chǎn)生與特定靶標結(jié)合的外源序列。該外源 序列可以來自例如抗體CDR區(qū)、T細胞受體的全部或部分、具有特定空間構(gòu)象的非線性多肽(例如能夠形成雙硫鍵的多肽)序列，也可以來自隨機突變。相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了從文庫中篩選具有外源序列的結(jié)合分子的方法。另ー方面，本發(fā)明還提供了ー種包含上述人源蛋白基結(jié)合分子的融合蛋白。所述融合蛋白有由以下通式I表示[(功能分子)-(連接肽)]n -(人源蛋白基結(jié)合分子)_[(連接肽)_ (功能分子)]m。其中，m和n為正整數(shù)且不同時等于O。相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了編碼上述融合蛋白的核酸序列，包含該核酸序列的重組載體，以及包含該重組載體的宿主細胞。本發(fā)明提供了上述融合蛋白的制備方法，包括以下步驟(1)構(gòu)建所述融合蛋白的核酸序列；(2)構(gòu)建包括(I)的核酸序列的表達載體；(3)將步驟(2)的表達載體用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細胞，并使所述核酸序列在宿主細胞中表達。(4)純化步驟(3)所表達的蛋白，并去除多余序列。另ー方面，本發(fā)明還提供了ー種包含上述人源蛋白基結(jié)合分子的蛋白偶聯(lián)物。其中的人源蛋白基結(jié)合分子與野生型人源蛋白結(jié)構(gòu)域(例如SEQ ID N0:1)相比還包含至少ー個修飾的氨基酸殘基用于共價偶聯(lián)特定功能分子。本發(fā)明提供了上述蛋白偶聯(lián)物的制備方法，包括以下步驟(1)構(gòu)建所述人源蛋白基結(jié)合分子的核酸序列；(2)構(gòu)建包括(I)的核酸序列的表達載體；(3)將步驟(2)的表達載體用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細胞，并使所述核酸序列在宿主細胞中表達。(4)純化步驟(3)所表達的蛋白，并去除多余序列。(5)通過化學方法共價偶聯(lián)步驟(4)所得蛋白與相應(yīng)的功能分子。另ー方面，本發(fā)明提供了上述融合蛋白或蛋白偶聯(lián)物、核酸序列、重組載體或宿主細胞在制備治療慢性病、自身免疫性疾病、癌癥、感染性疾病等相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。再一方面，本發(fā)明提供了ー種藥物組合物。該藥物組合物包含上述融合蛋白或蛋白偶聯(lián)物，以及ー種或多種藥學上可接受的輔料。優(yōu)選地，所述藥物組合物為液體注射劑或凍干注射劑。
「00111適宜革巴標人源蛋白基結(jié)合分子的適宜靶標包括但不限于具有長半衰期的蛋白(例如血清白蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白)，抗體Fe受體,細胞受體,細胞受體配體等。革巴標可參與人類疾病，如自身免疫病、癌癥、感染性疾病等。適宜的靶標還包括賦予附加功能特性的分子，如細胞毒性、成像、誘導多聚化、內(nèi)吞效應(yīng)等。人源蛋白基結(jié)合分子的產(chǎn)生人源蛋白基結(jié)合分子的序列，相比于野生型序列(SEQ ID NO: I)的12-38區(qū)間位點，有至少ー個氨基酸被改變，可由例如隨機誘變、模糊突變或精確突變ー個或多個野生型序列中的殘基而生成單個分子或多樣性的分子文庫。后者的核酸序列可由本領(lǐng)域公認的方法構(gòu)建，包括但不限于基于PCR或酶介導的基因工程法，從頭開始的DNA合成法，盒式誘變。任何抗體或T細胞受體可變區(qū)的CDR或抗原結(jié)合片斷、非線性多肽均適合作為外源序列，直接插入或取代野生型序列(SEQ ID NO: I)的12-38區(qū)間位點間的全部或部分殘基， 以生成新的人源蛋白基結(jié)合分子。鑒定生成分子的篩選方法對于上述方法生成的大容量、多祥性分子文庫，可采用多種篩選測定法來鑒定人源蛋白基分子對于期望靶標的結(jié)合能力。例如，在細胞、病毒或噬菌體表面展示人源蛋白基結(jié)合分子，并利用固定化的靶標對其進行選擇。適宜的篩選方法描述在美國專利No. 7063943, 6699658，7063943和5866344中。此類表面展示可能要求創(chuàng)建本發(fā)明人源蛋白基結(jié)合分子和正常存在于細胞、病毒或噬菌體外表面上的適宜蛋白質(zhì)之間的融合蛋白。適宜制備此類融合物的蛋白質(zhì)在本領(lǐng)域公知。篩選方法可以包括ー個或多個體外或體內(nèi)親和カ成熟步驟?？刹捎萌魏斡H和カ成熟方法，引起本發(fā)明人源蛋白基結(jié)合分子中的氨基酸變化，提高其與期望靶標的結(jié)合能力。這些方法在美國專利No. 7195880; 6951725;7078197; 7022479; 5922545; 5830721; 5605793; 5830650; 6194550; 6699658;7063943; 5866344和專利寫作條約公開W006023144中有所描述。融合蛋白中的連接肽及蛋白功能分子的選擇本發(fā)明的人源蛋白基結(jié)合分子可與蛋白功能分子通過基因工程方法形成融合蛋白。連接肽的序列包括但不限于GGGGS，GS, PSTSTST，EIDKPSQ及其多聚體。蛋白功能分子、連接肽與人源蛋白基結(jié)合分子可以在同一載體上編碼并作為單個蛋白質(zhì)在宿主細胞中表達。蛋白功能分子可以是擁有期望生物學活性的蛋白質(zhì)或多肽。例如，此類蛋白質(zhì)可以包括酶活性毒素或其活性片段，例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒素A、假單胞菌外毒素、白喉毒素等；蛋白質(zhì)例如腫瘤壞死因子、胰高血糖樣素I、干擾素等；或細胞因子，如白介素、粒細胞集落刺激因子等。人源蛋白基結(jié)合分子和融合蛋白的制備方法本發(fā)明人源蛋白基結(jié)合分子和融合蛋白一般通過重組表達產(chǎn)生。編碼所述分子的核酸插入到表達載體中。編碼所述分子的DNA區(qū)段在表達載體中有效連接以確保其表達的控制序列。表達控制序列包括但不限于啟動子、信號序列、增強子元件和轉(zhuǎn)錄終止序列。一旦載體已經(jīng)摻入到適當?shù)乃拗髦?，就將宿主維持在適合于高水平表達所述核酸序列、收集和純化該人源蛋白蛋白基結(jié)合分子的條件下。這些表達載體通常作為游離體或宿主染色體DNA的一部分而在宿主中復制。通常表達載體含有選擇標記(例如，氨芐青霉素抗性、四環(huán)素抗性等)，以便檢測表達了含有期望DNA序列的那些宿主細胞。宿主包括但不限于大腸桿菌，酵母菌等。
本發(fā)明人源蛋白基結(jié)合分子和融合蛋白一經(jīng)表達，則可按照本領(lǐng)域的標準方法純化，包括硫酸銨沉淀、親和柱、柱層析、HPLC純化、凝膠電泳等。對于制藥用途，優(yōu)選基本上純的、至少約90-95%純度的產(chǎn)物。蛋白偶聯(lián)物的共價偶聯(lián)方法、功能分子及連接子本發(fā)明的人源蛋白基結(jié)合分子可利用本領(lǐng)域已知的方法與功能分子進行共價偶聯(lián)。偶聯(lián)劑的實例包括蛋白質(zhì)A、碳化ニ亞胺、N-琥珀酰亞胺基-S-こ?；虼乘狨?SATA)等等。優(yōu)選的偶聯(lián)劑是N-琥珀酰亞胺基-S-こ?；虼乘狨?SATA)和4_(N_馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-I-羧酸磺基琥珀酰亞胺酷(sulfo-SMCC)。功能分子除前述蛋白類功能分子之外，還包括標簽分子(例如生物素分子)或化學品(例如化療藥物)。后者包括但不限于細胞毒性劑，即，任何對細胞有害的物質(zhì)。實例包括紫杉醇、細胞松弛素B、多柔比星、長春堿及他們的衍生物等。連接子的實例包括但不限于腙、硫醚、酷、ニ硫化物和含肽連接子。例如，連接子可以選擇為易被溶酶體內(nèi)的低PH斷裂、或易被蛋白酶(例如優(yōu)先地 在腫瘤組織中表達的蛋白酶)斷裂的連接子。功能分子還可包括放射性同位素。制備放射性免疫綴合物的方法在本領(lǐng)域已經(jīng)確立。本發(fā)明的組合物本發(fā)明的融合蛋白和蛋白偶聯(lián)物具有體內(nèi)治療用途，可以與ー種或幾種藥學上可接受的輔料共同制成藥物組合物。這些輔料包括水溶性填充劑、PH調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、注射用水、滲透壓調(diào)節(jié)劑等等。該藥物組合物可以通過肌肉、靜脈內(nèi)、皮下等注射途徑給藥，優(yōu)選的劑型為凍干或溶液注射劑。所述的水溶性填充劑輔料包括但不限于甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚こニ醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖等ー種或幾種的組合。所述的pH調(diào)節(jié)劑包括但不限于枸櫞酸、磷酸、鹽酸、氫氧化鉀或鈉或銨、碳酸鈉或鉀或銨鹽、碳酸氫鈉或鉀或銨鹽等生理可接受的有機或無機酸和堿及鹽等ー種或幾種的組合。所述的穩(wěn)定劑包括但不限于EDTA_2Na、硫代硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、磷酸氫ニ鉀、碳酸氫鈉、碳酸鈉、精氨酸、谷氨酸、聚こニ醇、十二烷基硫酸鈉、三羥甲基胺基甲烷等一種或幾種的組合。所述的滲透壓調(diào)節(jié)劑包括但不限于氯化鈉、氯化鉀等ー種或多種的組合。本發(fā)明的藥物組合物還可以在組合治療中給藥，即與其它藥劑組合。例如，組合治療可包括本發(fā)明的組合物連同至少ー種或多種其它治療劑，例如抗炎藥、抗癌藥和化療藥物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(I)本發(fā)明的融合蛋白或蛋白偶聯(lián)物能夠按照所述方法進行卓有成效的、有目的性的人工改造，不會對自身結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性帶來不良影響，。(2)本發(fā)明的融合蛋白或蛋白偶聯(lián)物能夠避免活性降低乃至喪失等不良影響。(3)本發(fā)明的融合蛋白或蛋白偶聯(lián)物優(yōu)選來源于人的天然序列，減少了融合蛋白在人體內(nèi)潛在的免疫原性。


圖I顯示了本發(fā)明的用于噬菌體文庫篩選人源蛋白基結(jié)合分子的克隆載體。圖2顯示了一個人源蛋白基結(jié)合分子的純化結(jié)果。泳道1，經(jīng)過固定金屬離子親和色譜(IMAC)純化后的蛋白；泳道2，上清蛋白結(jié)合Ni-NTA后的流出液；泳道3，誘導表達，破菌后的上清蛋白；泳道4，誘導表達，破菌后的總蛋白。圖3顯示了一個人源蛋白基結(jié)合分子的ELISA親和力檢測結(jié)果。圖4顯示了一個人源蛋白基結(jié)合分子與Exendin-4的融合蛋白的經(jīng)過酶切以及兩步固定金屬離子親和色譜(IMAC)后的純化效果。左圖顯示了融合蛋白的表達情況以及第一步IMAC純化后的結(jié)果。泳道1，破菌后總蛋白，泳道2，破菌離心后上清中的蛋白，泳道3，第一步IMAC純化后的Trx-融合蛋白。中圖顯示了腸激酶的酶切效果。泳道4，腸激酶濃度I下的酶切效率，泳道5，腸激酶濃度2下的酶切效率。右圖顯示了經(jīng)過第二步IMAC后的純化效果。泳道6，酶切純化后的目標融合蛋白。 圖5顯示了一個人源蛋白基結(jié)合分子與Exendin-4的融合蛋白的活性檢測結(jié)果。圖6顯示了一個人源蛋白基結(jié)合分子與裂解肽的融合蛋白的靶向腫瘤殺傷效果。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。實施例I:獲得針對人血■清白蛋白的人源蛋白基結(jié)合分子將SEQ ID NO: I序列與含有噬菌體衣殼蛋白P3 C末端的核酸序列的質(zhì)粒相融合(圖 I ;參考文獻Koide A, Bailey Cff, Huang X, Koide S. The fibronectin type IIIdomain as a scaffold for novel binding proteins. J Mol Biol. 1998;284:1141 -1151；Koide A, Gilbreth RN, Esaki K, Tereshko V, Koide S. High-affinitysingle-domain binding proteins with a binary-code interface. Proc Natl Acad SciUSA. 2007; 104:6632 - 6637.)，采用Kunkel突變方法進行區(qū)域隨機化。Kunkel突變的具體步驟可參考Krojer, T., Garrido-Franco, M., Huber, R. , Ehrmann, M., & Clausen,T. (2002) Nature 416, 455-459 ；Ferrer, M. , Maiolo, J. , Kratz, P. , Jackowski,J. , Murphy, D. , Delagrave, S. , & Inglese, J. (2005) Protein Eng Des Sel 18,165-173 ；Garcia, K. C. , Degano, M. , Stanfield, R. L., Brunmark, A. , Jackson, M.R. , Peterson, P. A. , Teyton, L. , & Wilson, I. A. (1996) Science 274, 209-219。隨機突變區(qū)域可選擇野生型人源蛋白序列的12-38區(qū)域(SEQ ID NO: I黑色粗體下劃線)。隨機突變方案可以選擇突變?nèi)繗埢?如石；j=6-30 ；SEQ ID N0:2)或具備兩個半胱氨酸鍵的突變(如；j=4-10, i+j+k <30 ；SEQ ID NO:3)或者具備一定選擇性(如XiCX2GPX4CXk ；SEQ ID NO:4)等。其中X是任一天然氨基酸殘基類型。YDAFLGTffKLYDSKNFDDYMKSLGYGFATRQVASMTKPTTIIEKNGDILTLKTHSTFKNTEISFKLGVEFDETTADDRKVKSIVTLDGGKLVHLQKWDGQETTLVRELIDGKLILTLTHGTAVCTRTYEKE (SEQ ID NO:I)VDAFLGTffKLV J TTIIEKNGDILTLKTHSTFKNTEISFKLGVEFDETTADDRKVKSIVTLDGGKLVHLQKffDGQETTLVRELIDGKLILTLTHGTAVCTRTYEKE (SEQ ID NO: 2)VDAFLGTffKLV X1CXjCXk TTIIEKNGDI LTLKTHSTFKNTE I SFKLGVEFDETTADDRKVKS IVTLDGGKLVHLQKffDGQETTLVRELIDGKLILTLTHGTAVCTRTYEKE (SEQ ID NO: 3)VDAFLGTffKLV A,(X (,!'X4CXk TTIIEKNGDI LTLKTHSTFKNTE I SFKLGVEFDETTADDRKVKS IVTLDGGKLVHLQKffDGQETTLVRELIDGKLILTLTHGTAVCTRTYEKE (SEQ ID NO: 4)將該文庫通過電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌細胞ss320中進行表達。以人血清白蛋白為靶點，從以上所建文庫進行篩選。人血清白蛋白通過化學修飾的方法加上BI0TIN，以帶有 Streptavidin 修飾的磁珠(Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles,Promega)來進行篩選。四輪篩選分別使用的人血清白蛋白的濃度為100，20, 4 and I nM.每輪篩選由kingfisher磁珠儀自動化進行。每輪篩選，將靶蛋白與文庫孵育15分鐘，然后經(jīng)過三輪TBS洗漆。富集的卩遼菌體經(jīng)過4輪panning,挑選單菌落進行phage ELISA.陽性克隆送測序，以得到基因序列，并轉(zhuǎn)化至適合蛋白表達的質(zhì)粒中。另一方面，亦可用已知與多種屬血清白蛋白有一定結(jié)合能力的非線性多肽(SEQID NO: 5; Dennis et al. J. Biol. Chem.)直接替換野生型人源蛋白序列(SEQ ID NO: I)的12-38區(qū)域(下劃線)，生成新序列(SEQ ID NO: 6)EVRSFCTDWPAEKSCKPLRG (SEQ ID NO:5) VDAFLGTWKLVEVRSFCTDWPAEKSCKPLRGTTIIEKNGDILTLKTHSTFKNTEISFKLGVEFDETTADDRKVKSIVTLDGGKLVHLQKWDGQETTLVRELIDGKLILTLTHGTAVCTRTYEKE (SEQ ID NO: 6)實施例2:人源蛋白基結(jié)合分子的表達、純化將含有便于純化的聚組氨酸標簽、便于后續(xù)ELISA檢驗的FLAG標簽、Tev蛋白酶酶切位點的序列以及SEQ ID NO: 6序列，克隆入表達質(zhì)粒。待表達的融合蛋白序列為(SEQID NO: 7)MGHHHHHHHHHHSSDYKDDDDKGENLYFQGSVDAFLGTWKLVDSKNFDDYMKSLGVGFATRQVASMTKPTTIIEKNGDILTLKTHSTFKNTEISFKLGVEFDETTADDRKVKSIVTLDGGKLVHLQKffDGQETTLVRELIDGKLILTLTHGTAVCTRTYEKE (SEQ ID NO: 7)將凍存菌株置于冰上冰浴融化,使用接種環(huán),劃板活化菌株于含30 iig/ml卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37 ° C孵育過夜。挑選活化的單克隆細菌于30 ml含30 U g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，置于37 ° C搖床中200 rpm振搖培養(yǎng)過夜。按照2%的接種量，將隔夜培養(yǎng)的細菌培養(yǎng)物接種到I升的含有30 u g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ° C200 rpm振搖，直到600 nm光密度(0D600)達到0. 5。將培養(yǎng)物置于冰上降溫至28 ° C，加入誘導劑異丙基-P -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度I mM。將加入IPTG后的細菌培養(yǎng)物置于28 ° C的搖床中，200 rpm振搖培養(yǎng)細菌6小時，以誘導人源蛋白基結(jié)合分子在大腸桿菌中的胞內(nèi)表達。以6000xg轉(zhuǎn)速離心10分鐘收獲大腸桿菌細胞，加入20 ml裂解緩沖液(50 mM磷酸鈉，0.5 M氯化鈉，20 mM咪唑，pH7. 4)，隨后加入溶菌酶和蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)分別至終濃度0.2 mg/ml和I禮。冰上孵育一小時，懸液間歇超聲破碎2分鐘。15000xg離心蛋白懸液I小時，收集上清，并以0. 45 um微孔濾膜過濾。以10倍柱體積的上樣緩沖液(50 mM磷酸鈉，0. 5 M氯化鈉，20 mM咪唑，pH7. 4)預平衡預裝在一次性柱中的3 ml的Ni-NTA樹脂，將經(jīng)過過濾的蛋白溶液緩慢上柱結(jié)合，收集流出液重新上柱于Ni-NTA樹脂。上樣結(jié)束后，使用上樣緩沖液緩慢洗滌Ni-NTA柱直至無蛋白脫出。使用洗脫緩沖液(50 mM磷酸鈉，0.5 M氯化鈉，0.5 M咪唑，pH7. 4)洗脫結(jié)合蛋白，每2 ml收集I管洗脫液。測定各管280 nm光密度(0D280)，匯集高分光度的各管蛋白溶液，4 ° C透析脫鹽置換于PBS緩沖液中。結(jié)果如圖2所示，顯示純化樣品的分子量與蛋白的預期質(zhì)量一致，純度在90%以上。實施例3:人源蛋白基結(jié)合分子的結(jié)合力測試在本實施例中，人源蛋白基結(jié)合分子(SEQ ID NO: 6)針對其目標靶點(血清白蛋白)的結(jié)合能力，經(jīng)由一種間接酶聯(lián)免疫吸附試驗方法進行結(jié)合力測試。實驗方案簡述如下96孔ELISA板(Nunc Maxisorb)的每孔用100 u I 5 u g/ml血清白蛋白的碳酸氫鈉緩沖液(40 mM NaHC03，pH 9.5)包被，附上封口膜，于4 ° C孵育過夜。同時每孔配以純碳酸氫鈉緩沖液(40 mM NaHC03, pH 9.5)包被ELISA孔作為空白對照。第二天，倒去包被緩沖液，分別使用純水和PBS洗滌一次。每孔加入300 u I的1% Ficoll 400(溶于PBS中)，置于潮濕密閉容器中室溫封閉2小時。倒去封閉液，PBS洗滌I次后，加入100 u I預先用PBST (PBS+0. 1%吐溫20)稀釋的具有血清白蛋白結(jié)合功能的人源蛋白基結(jié)合分子，震動室溫孵育I小時。隨后除去蛋白溶液，用PBST緩沖液洗滌3次，加入1000倍稀釋于PBST的 FLAG M2 monoclonal antibody (SigmaAldrich),室溫振搖 I 小時。除去抗體，用 PBST 洗滌3次，加入1000倍稀釋于PBST的用以顯色的Rabbit Anti-mouse IgG/HRP綴合物(生研(上海)生物科技有限公司)，室溫振搖I小時。除去抗體綴合物，PBST洗滌5次后，PBS洗漆 2 次。加入 100 U I 的底物溶液(I-Step Turbo TMB-ELISA, Pierce Biotechnology),反應(yīng)顯色5分鐘，加入100 u I 2M硫酸終止反應(yīng)。使用ELISA讀數(shù)器測量450nm的OD值。如圖3所示，所得結(jié)合分子對于多種屬的血清白蛋白均具有顯著的靶向結(jié)合能力。實施例4 :功能分子為Exendin-4的融合蛋白的設(shè)計、制備和活性本實例描述了人源蛋白基結(jié)合分子的野生型模板(SEQ ID NO: I)與蛋白功能分子Exendin-4 (SEQ ID NO: 8)所生成的融合蛋白(SEQ ID NO: 9)。將融合蛋白(SEQ IDNO: 9)的核酸序列亞克隆到pET-32a(+)多克隆位點中，與Thioredoxin (Trx)共表達生成Trx-融合蛋白(SEQ ID NO: 10),以增加Exendin-4-野生型人源蛋白基結(jié)合分子的可溶表達。HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSG (SEQ ID NO: 8)HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGTGGSGGGSVDAFLGTWKLVDSKNFDDYMKSLGVGFATRQVASMTKPTTIIEKNGDILTLKTHSTFKNTEISFKLGVEFDETTADDRKVKSIVTLDGGKLVHLQKffDGQETTLVRELIDGKLILTLTHGTAVCTRTYEKE (SEQ ID NO: 9)MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFffAEffCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGTGGSGGGSVDAFLGTWKLVDSKNFDDYMKSLGVGFATRQVASMTKPTTIIEKNGDILTLKTHSTFKNTEISFKLGVEFDETTADDRKVKSIVTLDGGKLVHLQKffDGQETTLVRELIDGKLILTLTHGTAVCTRTYEKE (SEQ ID NO: 10)除了在細菌培養(yǎng)過程中使用氨芐西林替換實施例2中使用的卡那霉素外，Trx-Exendin-4-野生型人源蛋白基結(jié)合分子的表達和固定金屬離子親和色譜純化與實施例2相同。固定金屬離子親和色譜純化后的Trx-Exendin-4-野生型人源蛋白基結(jié)合分子，透析于透析緩沖液(20 mM Tris, 50 mM氯化鈉，pH8. 0)中。4 ° C透析過夜后，向Trx-Exendin-4-野生型人源蛋白基結(jié)合分子的透析緩沖液中添加入氯化I丐至終濃度2 mM。加入合適比例的重組腸激酶(Enterokinase, GenScript),室溫反應(yīng)8小時，融合蛋白被切割成Trx以及帶有純化標簽的Exendin-4-野生型人源蛋白基結(jié)合分子(SEQ ID NO: 9)兩部分。以10倍柱體積的透析緩沖液(20 mM Tris，50 mM氯化鈉，pH8. 0)預平衡預裝在一次性柱中的3 ml的Ni-NTA樹脂，將酶切后的蛋白溶液緩慢上柱結(jié)合，收集的流出液即所需的N端暴露的Exendin-4-野生型人源蛋白基結(jié)合分子融合蛋白(SEQ ID NO: 10)。圖4顯示了融合蛋白(SEQ ID NO: 10)經(jīng)過酶切以及兩步固定金屬離子親和色譜(IMAC)后的純化效果。通過如下實驗判斷融合蛋白所保留的功能分子活性(詳見以GLP-I受體為靶點的藥物篩選細胞模型的建立和應(yīng)用。環(huán)奕、申竹芳《藥學學報》2009，44(3):309-313)。實驗步驟簡述如下^fNIT-I細胞瞬時轉(zhuǎn)染報告基因質(zhì)粒Peakl2RIP-CRE6X GFP后，使用不同濃度(lXlO-'lXKT1。、1X10'1X10'I X10_7、1X10_6 M)的融合蛋白刺激。為避免由于細胞狀態(tài)、檢測加樣及讀數(shù)時間延誤造成的不同實驗批次造成的實驗誤差，引入內(nèi)參基因合并靶基因的雙報告基因檢測方法，熒光檢測結(jié)果為靶基因熒光讀數(shù)值/內(nèi)參基因熒光讀數(shù)值。陽性藥對照為艾賽納肽注射液(禮來公司)?；钚詸z測結(jié)果如圖5所示 結(jié)果顯示，融合蛋白樣品活性隨濃度增加而增強，具有顯著的量效關(guān)系。其中一個指標為半數(shù)有效濃度(EC50)，另一個指標為在激動劑達到I. 5倍激活效能時對應(yīng)的濃度(EC1.5)。以上結(jié)果顯示，融合蛋白樣品與陽性藥的量效曲線接近平行，活性相仿，證明人源蛋白基結(jié)合分子模板與功能分子(Exendin-4)融合后，沒有對功能分子的原有活性造成顯著降低。該實施例的結(jié)果揭示了兩條具有可操作性的工藝路線，用以得到具有理想靶向性或半衰期的、具備足夠生物學活性的融合蛋白藥物前體(1)將該人源蛋白基結(jié)合分子模板單獨設(shè)計和篩選后，再與Exendin-4形成融合蛋白，或者(2 )將人源蛋白基結(jié)合分子模板與Exendin-4首先融合，再對融合蛋白整個進行重新設(shè)計和篩選。實施例5 :具有靶向PSMA抗腫瘤活性的融合蛋白PSMA (前列腺特異性膜抗原)是近年得到廣泛研究和臨床驗證的前列腺癌重要藥物靶點之一。PSMA是一個跨膜蛋白，其氨基端位于細胞膜內(nèi)，胞內(nèi)段含有19個氨基酸，跨膜段含有24個氨基酸，胞外段含有707個氨基酸。PSMA特異性地表達于前列腺上皮細胞表面，而在大多數(shù)組織中不表達。PSMA在前列腺癌組織中的表達量大約為正常前列腺組織中的10倍以上，大腦組織中的100倍，肝和腎組織中的500-1000倍。其表達強度在前列腺癌細胞、特別是晚期及轉(zhuǎn)移性前列腺癌中明顯升高。結(jié)合PSMA靶點本身不會引起癌癥細胞死亡。當前一般采用抗體藥物偶聯(lián)技術(shù)，將強毒素與靶向結(jié)合PSMA的單抗偶聯(lián)，借助PSMA的內(nèi)化將所攜帶的強毒素進一步聚集到細胞核周圍，實現(xiàn)靶向殺傷?？贵w偶聯(lián)物的生產(chǎn)工藝是世界性難題。在本實施例中，我們提供了兩個具有PSMA靶向結(jié)合能力的兩個人源蛋白基結(jié)合分子，替代單克隆抗體的靶向作用VDAFLGTWKLVDSKNSTLVPHTRSMTKPTTIIEKNGDILTLKTHSTFKNTEISFKLGVEFDETTADDRKVKSIVTLDGGKLVHLQKWDGQETTLVRELIDGKLILTLTHGTAVCTRTYEKE (SEQ ID NO: 11)VDAFLGTffKLVDSKNSQKHHNYLSMTKPTTIIEKNGDILTLKTHSTFKNTEISFKLGVEFDETTADDRKVKSIVTLDGGKLVHLQKWDGQETTLVRELIDGKLILTLTHGTAVCTRTYEKE (SEQ ID NO: 12)將以上蛋白序列與蛋白標簽(第一劃線處)、連接肽和裂解肽(第二劃線處)融合，得到如下兩個融合蛋白
MGHHHHHHHHHHSSDYKDDDDKGENLYFQGSVDAFLGTffKLVDSKNSTLVPHTRSMTKPTTIIEKNGDILTLKTHSTFKNTEISFKLGVEFDETTADDRKVKSIVTLDGGKLVHLQKWDGQETTLVRELIDGKLILTLTHGTAVCTRTYEKEKPISLTASGGKLAKLAKKLAKLAKHHHHH (SEQ ID NO: 13)MGHHHHHHHHHHSSDYKDDDDKGENLYFQGSVDAFLGTffKLVDSKNSQKHHNYLSMTKPTTIIEKNGDILTLKTHSTFKNTEISFKLGVEFDETTADDRKVKSIVTLDGGKLVHLQKWDGQETTLVRELIDGKLILTLTHGTAVCTRTYEKEKPLSLISSGGKLAKLAKKLAKLAKHHHHH (SEQ ID NO: 14)將上述兩個蛋白序列在大腸桿菌中表達、純化，在高表達PSMA的LNCaP細胞株和低表達PSMA的PC3細胞株中進行細胞毒性試驗，以驗證其PSMA靶向性。方法簡述如下收集對數(shù)期的LNCaP (高表達PSMA蛋白)、PC3細胞(低表達PSMA蛋白)，調(diào)整細胞懸液濃度， 每孔加入lOOul，鋪板使待測細胞調(diào)密度1000- 10000 /孔。在5%C02，37°C條件下孵育，至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)。分別加入5微摩、15微摩的待測藥物Hl (SEQ ID NO:
13)、H2 (SEQ ID NO 14)，以及陽性對照(10mg/ml、15mg/ml 的順鉬)，每孔 lOOul，設(shè) 3-5個復孔。5%C02，37°C孵育24或72小時。每孔加入IOul MTT溶液(5mg/ml，即0. 5%MTT),繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入IOOul 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD 490nm處測量各孔的吸光值，并得到與對照孔(細胞、PBS、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)的吸光值相比的比值。由圖6可見，在24小時后，兩個藥物對于兩種細胞株的殺傷效率(5微摩、15微摩)類似順鉬，其PSMA靶向值(0. 29-0. 58)也與順鉬(0. 39-0. 44)類似，未體現(xiàn)出PSMA靶向性殺傷效果。在72小時后，兩個藥物對于兩種細胞株的殺傷效率體現(xiàn)出明顯區(qū)別在5微摩的濃度下，其PSMA靶向性為I. 61-1. 73，在15微摩的濃度下，其PSMA靶向值為3. 51-8. 08，均顯著高于順鉬(I. 05-1. 13)。特別地，在15微摩的濃度下，兩個藥物對于LNCaP的殺傷率為64%-68%，接近順鉬殺傷率(76-83%)，而對于PC3的殺傷率僅為8_20%，遠低于順鉬殺傷率(67%-79%)，體現(xiàn)出遠優(yōu)于化療藥物的安全性。
權(quán)利要求
1.包含野生型序列SEQID NO: I的至少70%序列的蛋白，其對應(yīng)于SEQ ID NO: I的12-38區(qū)域的部分，有至少ー個氨基酸與SEQ ID NO: I不同，以產(chǎn)生與特定靶標相結(jié)合的結(jié)合分子。
2.權(quán)利要求I的結(jié)合分子，其中非來源于SEQID NO: I序列的部分包含抗體或T細胞受體的互補決定區(qū)(CDR)或非線性多肽的全部或部分。
3.權(quán)利要求I的結(jié)合分子，其中特定靶標是血清白蛋白。
4.權(quán)利要求I的結(jié)合分子，其中特定靶標是前列腺特異性膜受體(PSMA)。
5.前述權(quán)利要求中任一項的結(jié)合分子，包含與SEQID NO: I相比至少ー個修飾的氨基酸殘基，用來連接功能分子。
6.權(quán)利要求5中的結(jié)合分子，其中修飾的氨基酸殘基包括半胱氨酸或非天然氨基酸殘 基的添加或取代。
7.前述權(quán)利要求中任一項的結(jié)合分子與另一分子的融合蛋白或蛋白偶聯(lián)物。
8.組合物，包含前述權(quán)利要求中任一項的結(jié)合分子、融合蛋白、蛋白偶聯(lián)物及載體。
9.多祥化核酸文庫，其編碼要求前述任一項的結(jié)合分子、融合蛋白、蛋白偶聯(lián)物及載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新型的蛋白模板用于生成非抗體類靶向結(jié)合分子。所述蛋白模板及其衍生的靶向結(jié)合分子可與多肽、蛋白或化學功能分子形成融合蛋白或蛋白偶聯(lián)物。由此，后者可具備可調(diào)節(jié)的靶向性或半衰期性質(zhì)，同時保留結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能分子原有的活性，在制藥及分子診斷領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用前景。
文檔編號C07K14/47GK102775487SQ20121018648
公開日2012年11月14日 申請日期2012年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月7日
發(fā)明者盧水秀, 史孟君, 吳昕, 張偉, 王瑞, 黃金 申請人:北京華金瑞清生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司