專利名稱：一種抗人神經(jīng)絲中分子量亞單位單克隆抗體及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種抗人神經(jīng)絲中分子量亞單位單克隆抗體及其制備方法與應用，以及分泌產生該單克隆抗體的雜交瘤細胞株，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
神經(jīng)絲(Neurofilament, NF)是存在于神經(jīng)細胞胞體和軸突中的一種特化的中間絲，外徑約為IOnm的纖維狀結構，由高分子量(NF-H)、中分子量(NF-M)以及低分子量(NF-L)三個亞單位組成，其在哺乳動物體內分子量分別約為200KD，160KD和68KD。NF的生理功能與神經(jīng)細胞內的物質運輸和維持軸突形態(tài)、直徑和延伸有關。NF與多種原因引起的神經(jīng)性疾病有關。脊髓側索硬化征(ALS)、早老性癡呆 (Alizheimers disease, AD)和帕金森綜合征(Parkinson，s disease, PD)等疾病與 NF 有關；腦外傷和腦出血病人也引起NF變化；一些中毒性神經(jīng)病如一氧化碳、鉛、汞、正己烷、氯丙烯、二硫化碳、I-溴丙烷、有機磷等均可引起NF的改變。NF作為神經(jīng)損傷的生物標志物，具有較好的特異性，且可從血清中檢測到，而NF-M又是三個亞單位中檢測神經(jīng)損傷最為敏感的亞單位。因此，對NF-M進行定量檢測，對神經(jīng)系統(tǒng)損傷的診斷和觀察預后具有十分重要的意義。神經(jīng)絲中分子量亞單位的檢測主要是免疫學方法，包括Western blot、免疫組織化學以及免疫熒光標記技術。這些技術不僅需要靈敏度高，特異性強的抗體，還需要人體組織標本，因此不方便檢查診斷。目前國際上還沒有NF-M檢測試劑盒，國內尚沒有抗NF-M抗體，更缺乏靈敏度高、特異性強的抗NF-M McAb0因此，制備抗人神經(jīng)絲中分子量亞單位單克隆抗體，建立具有我國自主知識產權的靈敏度高、特異性強的血清中NF-M檢測方法，提高臨床診斷技術和治療水平，有重要的使用價值。

發(fā)明內容
針對上述現(xiàn)有技術，本發(fā)明利用人工合成的人神經(jīng)絲中分子量亞單位多肽為半抗原，與匙孔槭血藍蛋白(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶聯(lián)后免疫小鼠,用細胞融合的方法制備了 I株分泌抗神經(jīng)絲單克隆抗體的雜交瘤細胞2C1，其分泌產生的抗體靈敏度高，特異性強，與小鼠、大鼠NF有交叉反應，可用于人、大鼠和小鼠神經(jīng)絲中分子量亞單位檢測試劑盒的研制。本發(fā)明的技術方案如下一種抗人神經(jīng)絲中分子量亞單位單克隆抗體，該單克隆抗體對SEQ ID NO. I所示氨基酸序列的多肽具有特異性，所述單克隆抗體由保藏編號為CGMCC No. 6064的細胞株分泌產生。一株產生上述單克隆抗體的雜交瘤細胞株2C1，命名為小鼠雜交瘤細胞，已于2012年04月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCC No. 6064。所述單克隆抗體在定量檢測人、小鼠或大鼠神經(jīng)絲中分子量單位中的應用。一種定量檢測人、小鼠或大鼠神經(jīng)絲中分子量單位的檢測試劑盒，所述檢測試劑盒中含有上述的單克隆抗體。本發(fā)明選擇人的NF-M N 端 GNPSAYRRVTETRSSFSRVSGSPSSGFRSQSWSRGSP-C(SEQ IDNO. I所示)氨基酸序列進行人工合成。合成的多肽采用Sulfo-SMCC方法與KLH蛋白進行偶聯(lián)，制備KLH-NF-M完全抗原，KLH-NF-M偶聯(lián)抗原免疫Balb/c小鼠獲得了較好的免疫應答。細胞融合后，經(jīng)ELISA方法篩選，并用間接競爭ELISA方法確證，從中選擇出分泌抗人NF-MMcAb的細胞株，經(jīng)3 4次亞克隆，達到3次100%陽性，建立了 I株能穩(wěn)定分泌抗NF-M單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為2CI，并對其進行了保藏。 本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種抗人神經(jīng)絲中分子量亞單位單克隆抗體，該抗體靈敏度高，特異性強，與小鼠、大鼠NF有交叉反應，可用于人、大鼠和小鼠神經(jīng)絲中分子量亞單位檢測試劑盒的研制。


一株產生上述單克隆抗體的雜交瘤細胞株2C1，命名為小鼠雜交瘤細胞，已于2012年04月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCC No. 6064，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，郵編:100101。圖I為NF-M多肽間接競爭抑制ELISA曲線。圖2為Western blot檢測2C1與小鼠、大鼠和人血清中的NF-M的反應性。圖3為免疫組化方法檢測2C1與大鼠石蠟切片中NF-M的反應性。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例I抗NF-M單克隆抗體的制備I.人NF-M多肽序列的選擇、合成及偶聯(lián)NF-M氨基酸序列在人、大鼠、小鼠高度同源，如何選擇抗原，對于能否激發(fā)BALB/c小鼠產生免疫反應至關重要。蛋白質的抗原決定簇多存在與C-端或N-端，在比較了人，大鼠，小鼠NF-M氨基酸序列差異性后，我們選擇了 NF-M氨基酸序列上N-端的一段氨基酸序列 GNPSAYRRVTETRSSFSRVSGSPSSGFRSQSWSRGSP-C，合成多肽，Sulfo-SMCC 方法與 KLH 偶聯(lián)后制備完全抗原NF-M-KLH，偶聯(lián)率為92. 37%。2.動物免疫NF-M-KLH偶聯(lián)物偶聯(lián)效率高，偶聯(lián)抗原穩(wěn)定，溶解性好，免疫原性強。將NF-M-KLH偶聯(lián)物配制成lmg/ml溶液，采用小劑量長周期的免疫方案，對6 8周齡的雌性Balb/c小鼠(體重18 20g)，首次免疫用IOOii g NF-M-KLH，加入等量完全福氏佐劑(Sigma公司產品)，腹腔注射。2周后，用IOOiig NF-M-KLH，加入等量不完全福氏佐劑(Sigma公司產品)，腹腔注射。再2周后，用IOOiig NF-M-KLH，加入等量不完全福氏佐劑，腹腔注射。2周后，強化免疫，50 iig NF-M-KLH溶液脾內免疫，4d后取脾細胞進行融合。
3.細胞融合將Sp2/0細胞與小鼠脾細胞按1:10混合于5011^無菌離心管中，10001'/111111離心IOmin,棄上清，輕彈管底使細胞充分散開，將離心管置37°C水浴中，緩慢加入37°C預溫的50%PEG0. 7mL, Imin內加完，于37°C靜置90s，緩慢加入20mL 1640培養(yǎng)液終止PEG的作用。800r/min離心lOmin，棄上清液，用含20%小牛血清的HAT選擇培養(yǎng)基懸浮沉淀的細胞，調整細胞濃度為2 X 106/mL,然后分別接種于加有飼養(yǎng)細胞的96孔培養(yǎng)板中，置37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在融合7 14d后改用HT培養(yǎng)液，逐日觀察細胞生長情況，待長至1/3 1/2視野，ELISA法檢測上清液中抗體。4.雜交瘤篩選及抗體檢測 以5iig/ml NF-M為包被抗原，用間接ELISA法篩選融合細胞上清中抗NF-M單克隆抗體，用NF-M多肽間接競爭抑制性ELISA法確證單克隆抗體的特異性。以免疫小鼠的血清為陽性對照，以Sp2/0細胞培養(yǎng)的上清液為空白對照，以融合細胞培養(yǎng)板中未長出克隆的細胞培養(yǎng)上清為陰性對照，陽性細胞孔判定標準為(Awi-AseV(Amw-Asew)S 2. I。結果NF_M多肽間接競爭抑制ELISA試驗測得NF-M多肽的競爭抑制曲線為y=_0.4127x+0.2691，相關系數(shù)r為0.9912，競爭抑制曲線見附圖I。5.雜交瘤細胞的克隆化ELISA及NF-M多肽間接競爭抑制性ELISA法檢測上清陽性的孔，有限稀釋法進行克隆化，至所有單克隆孔上清抗體陽性率為100%，將細胞擴大培養(yǎng)并建株，將雜交瘤細胞凍存于液氮罐中。同時送中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏。6.單克隆抗體的生產采用動物體內腹水誘生法(為常規(guī)的單克隆抗體的生產方法)。7.單克隆抗體的純化采用飽和硫酸銨法對腹水進行純化(為常規(guī)的單克隆抗體純化方法)。(二)抗NF-M單克隆抗體的鑒定I.抗體的免疫球蛋白類別及亞類鑒定采用抗體亞類測定試劑盒進行測定。2.抗體IgG含量的測定采用BCA蛋白測定試劑盒對辛酸-硫酸銨法純化后的腹水進行IgG含量測定。3.抗體分子量的測定采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法。4.抗體滴度測定以5 ii g/ml NF-M為包被抗原，將抗體進行倍比稀釋，以Sp2/0細胞腹水純化液為陰性對照，PBS為空白對照，用間接ELISA方法測定純化腹水中抗體滴度，以(A^i-Ase)/ (Aratt-Ase)彡2. I的最大稀釋倍數(shù)為抗體的滴定終點。A值約為I時抗體的稀釋度為參考工作稀釋度。5.抗體的特異性測定用間接競爭抑制性ELISA法進行測定。結果抗體的亞類、相對分子量、IgG含量、抗體滴度等見表I。 表I抗NF-M單克隆抗體的特性
雜交瘤抗體相對分子質IgG含量參考工作
細胞系亞類量(KD) (g/L) 饑件個皮稀釋度
2C1 IgGt1504. 51 I； 400000 I 32 OOO
(三)抗NF-M單克隆抗體的應用l.ffestern blot方法檢測正常小鼠、大鼠和人血清中的NF-M。利用所制備單克隆抗體2C1為一抗，HRP標記兔抗屬IgG為二抗，化學發(fā)光法檢測正常小鼠、大鼠和人血清中NF-M,結果顯示，該單克隆抗體與正常小鼠、大鼠和人血清中NF-M均有明顯的反應條帶，見圖2。2.免疫組化方法檢測正常大鼠大腦石蠟切片中NF-M。取正常大鼠大腦，常規(guī)制成 石蠟切片，以所制備單克隆抗體2C1為一抗，HRP標記兔抗屬IgG為二抗，DAB為顯色劑，檢測組織切片中NF-M，結果顯示，該單克隆抗體與正常大鼠大腦石蠟切片中NF-M有明顯的反應，見圖3。
權利要求
1.一種抗人神經(jīng)絲中分子量亞單位單克隆抗體，其特征在于所述單克隆抗體對SEQID NO. I所示氨基酸序列的多肽具有特異性，所述單克隆抗體由保藏編號為CGMCC No. 6064的細胞株分泌產生。
2.一株產生權利要求I所述的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其特征在于命名為2C1，已于2012年04月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為 CGMCC No. 6064。
3.權利要求I所述的單克隆抗體在定量檢測人、小鼠或大鼠神經(jīng)絲中分子量單位中的應用。
4.一種定量檢測人、小鼠或大鼠神經(jīng)絲中分子量單位的檢測試劑盒，其特征在于所述檢測試劑盒中含有權利要求I所述的單克隆抗體，能與單克隆抗體特異性結合的二抗，以及與二抗結合的標記物，所述標記物為酶標記物、突光標記物或放射性標記物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗人神經(jīng)絲中分子量亞單位單克隆抗體，該單克隆抗體對SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽具有特異性，所述單克隆抗體由保藏編號為CGMCC No.6064的細胞株分泌產生。本發(fā)明還提供了一株產生上述單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為2C1，已于2012年04月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCC No.6064。本發(fā)明的單克隆抗體靈敏度高，特異性強，與小鼠、大鼠NF有交叉反應，可用于人、大鼠和小鼠神經(jīng)絲中分子量亞單位檢測試劑盒的研制。
文檔編號C07K16/18GK102702354SQ20121018512
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月7日 優(yōu)先權日2012年6月7日
發(fā)明者楊曦偉, 董華, 謝克勤, 趙麗, 邵曉穎 申請人:山東大學