專利名稱：應(yīng)用高速逆流色譜法從大葉白麻中純化三種黃酮苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然植物的分離制備，具體涉及應(yīng)用高速逆流色譜法從大葉白麻中純化三種黃酮苷的方法。
背景技術(shù)：
大葉白麻(Poacynum hendersonii),夾竹桃科(Apocynaceae)白麻屬(PoacynumL)的ー種直立半灌木，常與羅布麻屬的羅布紅麻(Pocynum venetum)、白麻屬的白麻(Pocynum pictum ) 一起被人們統(tǒng)稱為羅布麻。羅布麻，作為茶飲和藥用具有悠久歷史，多部典籍對(duì)此進(jìn)行了記載。據(jù)《中華本草》記載，其藥用部位為葉，味甘，微苦，性涼，有清熱平肝，利水消腫之功效，主治高血壓，眩暈，頭痛，心悸，失眠，水腫尿少等癥。《中國(guó)藥典》也對(duì)羅布麻有記載“清熱利水，平肝安神，用于高血壓、頭暈、心悸、失眠等”。現(xiàn)代研究表明，羅布麻具有降壓降脂、保肝、抗抑郁、鎮(zhèn)靜、延緩衰老及增強(qiáng)免疫力等功效。另外，目前羅布麻 葉已被開發(fā)成保健茶飲，有止渴、清熱解毒、降低血壓等強(qiáng)身健體之功效。目前三種“羅布麻”中應(yīng)用較多的為羅布紅麻，大葉白麻多作為其替代品應(yīng)用。為了推進(jìn)大葉白麻的開發(fā)利用，有關(guān)其化學(xué)成分的研究已經(jīng)展開雷振環(huán)、臺(tái)寶山、田瑞華等從大葉白麻中分離得到兩個(gè)木質(zhì)素成分(-)-丁香脂素和( + )-松脂素-4-0-β葡萄糖苷。堵年生、張?jiān)品?、馬成等從大葉白麻中分離得到11種化學(xué)成分，井根據(jù)各種化合物的含量指定羅布麻甲素和丁香樹脂醇-雙-O-β -D-葡萄糖苷作為大葉白麻的標(biāo)識(shí)化合物及相關(guān)產(chǎn)品的功能指標(biāo)成分(中國(guó)專利，申請(qǐng)?zhí)?00410079914. 8)。魏錦屏、李青山也對(duì)大葉白麻進(jìn)行了研究，并從中分離得到15個(gè)化學(xué)成分。在上述研究中，研究者都采用常規(guī)柱色譜、重結(jié)晶等傳統(tǒng)分離方法來分離大葉白麻中的単體化合物，不僅耗時(shí)耗力、污染嚴(yán)重，而且實(shí)驗(yàn)過程中存在不可逆吸附及實(shí)驗(yàn)者分離水平的高低不同的現(xiàn)象，大大制約了操作的重復(fù)性和単體化合物的制備。因此，單純由研究者采用傳統(tǒng)方法分離得到的単體化合物很難滿足大葉白麻進(jìn)ー步研究和產(chǎn)品開發(fā)的需求。高速逆流色譜是近年來發(fā)展起來的一種連續(xù)的無需固定相的高效、快速的液液分配色譜技術(shù)，具有分離量大、樣品無損失、回收率高、分離溶劑選擇靈活等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥、環(huán)保、化工等領(lǐng)域內(nèi)化學(xué)成分的分離制備和純化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種應(yīng)用高速逆流色譜法從大葉白麻中純化三種黃酮苷的方法，以能快速、高效制備槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷-6”-0-丙ニ酸酯三種黃酮苷單體，優(yōu)化所需要的溶劑體系和高速逆流色譜的相關(guān)參數(shù)，從而使得從大葉白麻中經(jīng)ー步純化即可得到純度在95%以上三種單體得以實(shí)現(xiàn)。應(yīng)用高速逆流色譜法從大葉白麻中純化三種黃酮苷單體的方法，采取的技術(shù)方案是一種應(yīng)用高速逆流色譜儀從大葉白麻葉中快速分離制備三種黃酮苷的方法是以大葉白麻葉為原料，經(jīng)過下列步驟處理(1)粗提物浸膏的制備；(2)高速逆流色譜純化，得到槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷_6”-O-丙ニ酸酯三種黃酮苷，其純度均高于96%。
(3)利用液相色譜技術(shù)對(duì)樣品純度進(jìn)行檢驗(yàn)
所述步驟(I)大葉白麻粗提物浸膏的制備a將已粉碎好的大葉白麻，加入5-30倍的40%-90%的こ醇溶液，回流提取30-240 min,分離殘?jiān)吞崛∫?。b再于殘?jiān)鼉?nèi)加入40%_90%的酒精5-20倍，重復(fù)回流提取2-3次，分離殘?jiān)吞崛∫?。c合并上述回流所得提取液，減壓回收合并液，得大葉白麻提取物浸膏。所述步驟(2)高速逆流色譜純化a將溶劑系統(tǒng)正丁醇-石油醚-O. 5%醋酸水溶液按照體積比5:3:5配制于分液漏斗中，充分搖動(dòng)后靜置分層，以上相為固定相，下相為流動(dòng)相，取50-300 mg浸膏，溶于5mL上相和5mL下相的混合溶液中，作上樣溶液使用；b使高速逆流色譜儀以5. 0-20 mL/min的素的充滿上相溶液，然后轉(zhuǎn)動(dòng)主機(jī)，同時(shí)將流動(dòng)相泵入，待達(dá)到平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，于254 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)器譜圖收集目標(biāo)成分。
所述步驟(3)利用液相色譜技術(shù)檢驗(yàn)樣品樣品純度，色譜條件為C18柱(250mm X 4. 6mm),填料直徑i. d.，5 μ m,流動(dòng)相A-甲醇，B-水；梯度洗脫程序0-20 min,A: B= (20-70) to A:B (80-30)，流速I. O mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為 254 nm。所述的步驟(2)中高速逆流色譜主機(jī)的轉(zhuǎn)速為500-900轉(zhuǎn)/分鐘，流動(dòng)相流速
O.8-3. O mL/min ο步驟(2)中大葉白麻浸膏量為50-300 mg，即可以取50 — 300mg數(shù)值區(qū)間的任一
重量大葉白麻浸膏。上述方法在制取三種單體物質(zhì)的過程中，時(shí)間控制方式分別是異槲皮苷的保留時(shí)間為25-50 min，槲皮素-3-0-槐糖苷的保留時(shí)間為150-220 min，異槲皮苷_6”-0_丙ニ酸酯的出峰時(shí)間為230-300 min。該方法以大葉白麻為原料，經(jīng)過粗提物浸膏的制備、高速逆流色譜純化、HPLC純度檢驗(yàn)等步驟處理，所得三種單體含量均高于95%，符合ー類植物新藥和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品要求。該方法具有處理簡(jiǎn)單，樣品損失少，制備量大，制備單品純度高及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，適用于從各種含有槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷-6”-0-丙ニ酸酯的天然產(chǎn)物中獲取其高純度單體。


圖I是實(shí)施例I中大葉白麻浸膏的高效液相色譜圖。圖2是實(shí)施例I按照為本發(fā)明步驟，利用高速逆流色譜分離得到槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷_6”-O-丙ニ酸酯等三種黃酮苷的色譜圖。圖3為實(shí)施例I中分離得到的三種黃酮苷槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷-6”-0-丙ニ酸酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖。圖4為實(shí)施例I分離純化得到的異槲皮苷的色譜圖。圖5為實(shí)施例I分離純化得到的槲皮素-3-0-槐糖苷的色譜圖。圖6為實(shí)施例I分離純化得到的異槲皮苷_6” -O-丙ニ酸酯的色譜圖。
具體實(shí)施例方式以下是
具體實(shí)施例方式將大葉白麻葉于40-90%的こ醇溶液中回流提取，真空懸干得浸膏，然后采用正丁醇-石油醚-O. 5%醋酸水溶液(5:3:5)構(gòu)成的混合溶液作為溶劑體系，經(jīng)制備型高速逆流色譜儀進(jìn)行分離純化，即得槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷_6” -O-丙ニ酸酷。優(yōu)化得出的高速逆流色譜分離純化大葉白麻中三種黃酮的具體步驟
I、大葉白麻粗提物浸膏的制備①將已粉碎好的大葉白麻，加入5-30倍的40%-90%的こ醇溶液，回流提取30-240 min,分離殘?jiān)吞崛∫?。②再于殘?jiān)鼉?nèi)加入40%_90%的酒精5-20倍，重復(fù)回流提取2-3次，分離殘?jiān)吞崛∫骸＂酆喜⑸鲜龌亓魉锰崛∫?，減壓回收合并液，得大葉白麻提取物浸膏。
2、高速逆流色譜純化①將溶劑系統(tǒng)正丁醇-石油醚-O. 5%醋酸水溶液按照體積比5:3:5配制于分液漏斗中，充分搖動(dòng)后靜置分層，以上相為固定相，下相為流動(dòng)相，在50-300 mg數(shù)值區(qū)間取任一重量的浸膏，溶于5ml上相和5ml下相的混合物中，得上樣溶液；②以5-24 mL/min的速度將固定相快速注入高速逆流色譜儀，使之充滿固定相溶液，然后以650-900 rpm/min轉(zhuǎn)速，轉(zhuǎn)動(dòng)高速逆流色譜主機(jī)。同時(shí)將流動(dòng)相以O(shè). 8-3. O mL/min速度泵入，待達(dá)到平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，于254 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)器譜圖收集目標(biāo)成分。3.利用高效液相色譜對(duì)制的樣品的純度檢驗(yàn)色譜條件為C18柱(250mmX4. 6 mm),填料直徑i. d.，5 μ m,流動(dòng)相A-甲醇；B-水；梯度洗脫程序0-20 min,A: B= (20-70) to A:B (80-30)，流速I. O mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為 254 nm。上述方法在制取三種單體物質(zhì)的過程中，時(shí)間控制是異槲皮苷的保留時(shí)間為25-50 min，槲皮素-3-0-槐糖苷的保留時(shí)間為150-220 min，異槲皮苷_6”-0_丙ニ酸酯的出峰時(shí)間為230-300 min。即25-50 min時(shí)間段內(nèi)制得的是異槲皮苷，150-220 min時(shí)間段內(nèi)制得的是懈皮素-3-0-槐糖苷,230-300 min時(shí)間段內(nèi)制得的是懈皮素-3_0_槐糖苷。實(shí)施例I:
將已粉碎好的大葉白麻粉末100 g，加入IL 60%的こ醇溶液，回流提取100 min，分離殘?jiān)吞崛∫?；將殘?jiān)鼉?nèi)再加入60 %的酒精1L，重復(fù)回流提取2-3次，分離殘?jiān)吞崛∫海缓喜⑸鲜龌亓魉锰崛∫?，減壓回收合并液，得大葉白麻提取物浸膏。高速逆流色譜純化采用正丁醇-石油醚-O. 5%醋酸水(5:3:5，v/v/v)溶液所組成的溶劑體系分離純化大葉白麻浸膏，上相為固定相，下相為流動(dòng)相。根據(jù)色譜圖收集相應(yīng)的組分，回收溶液即得化合物。經(jīng)1H-NMR、13C-NMR鑒定，所得化合物為槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷-6”-0-丙ニ酸酷。采用面積歸ー化計(jì)算，槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷_6” -O-丙ニ酸酯的純度分別為96. 8%，98. 2%，99. 5%。實(shí)施例2:
將已粉碎好的大葉白麻粉末100 8，加入0.8 L 70%的こ醇溶液，回流提取100 min，分離殘?jiān)吞崛∫?；將殘?jiān)鼉?nèi)再加入70 %的酒精O. 8 L，重復(fù)回流提取2-3次，分離殘?jiān)吞崛∫?；合并上述回流所得提取液，減壓回收合并液，得大葉白麻提取物浸膏。高速逆流色譜純化采用正丁醇-石油醚-O. 5%醋酸水(5:3:5，v/v/v)溶液所組成的溶劑體系分離純化大葉白麻浸膏，上相為固定相，下相為流動(dòng)相。根據(jù)色譜圖收集相應(yīng)的組分，回收溶液即得化合物。經(jīng)1H-NMR、13C-NMR鑒定，所得化合物為槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷-6”-0-丙ニ酸酷。采用面積歸ー化計(jì)算，槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷-6” -O-丙ニ酸酯的純度分別為97. 2%，98. 5%，98. 0%。實(shí)施例3:
將已粉碎好的大葉白麻粉末100 8，加入1.2 L 80%的こ醇溶液，回流提取100 min，分離殘?jiān)吞崛∫?；將殘?jiān)鼉?nèi)再加入80 %的酒精I(xiàn). 2 L，重復(fù)回流提取2-3次，分離殘?jiān)吞崛∫?；合并上述回流所得提取液，減壓回收合并液，得大葉白麻提取物浸膏。高速逆流色譜純化采用正丁醇-石油醚-O. 5%醋酸水(5:3:5，v/v/v)溶液所組成的溶劑體系分離純化大葉白麻浸膏，上相為固定相，下相為流動(dòng)相。根據(jù)色譜圖收集相應(yīng)的組分，回收溶液即得化合物。經(jīng)1H-NMR、13C-NMR鑒定，所得化合物為槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷-6”-0-丙ニ酸酷。采用面積歸ー化計(jì)算，槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷_6”-O-丙ニ酸酯的純度分別為98. 1%，96. 5%, 99. 3%。實(shí)施例4:
將已粉碎好的大葉白麻粉末100 8，加入1.5 L 85%的こ醇溶液，回流提取100 min，分離殘?jiān)吞崛∫海粚堅(jiān)鼉?nèi)再加入85 %的酒精I(xiàn). 5 L，重復(fù)回流提取2-3次，分離殘?jiān)吞崛∫?；合并上述回流所得提取液，減壓回收合并液，得大葉白麻提取物浸膏。高速逆流色譜純化采用正丁醇-石油醚-O. 5%醋酸水(5:3:5，v/v/v)溶液所組成的溶劑體系分離純化大葉白麻浸膏，上相為固定相，下相為流動(dòng)相。根據(jù)色譜圖收集相應(yīng)的組分，回收溶液即得化合物。經(jīng)1H-NMR、13C-NMR鑒定，所得化合物為槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷-6”-0-丙ニ酸酷。采用面積歸ー化計(jì)算，槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷_6” -O-丙ニ酸酯的純度分別為96. 8 %，97. 9%，98. 6%。實(shí)施例5:
將已粉碎好的大葉白麻粉末100 8，加入0.6 L 50%的こ醇溶液，回流提取100 min，分離殘?jiān)吞崛∫?；將殘?jiān)鼉?nèi)再加入50 %的酒精O. 6 L，重復(fù)回流提取2-3次，分離殘?jiān)吞崛∫海缓喜⑸鲜龌亓魉锰崛∫?，減壓回收合并液，得大葉白麻提取物浸膏。高速逆流色譜純化采用正丁醇-石油醚-O. 5%醋酸水(5:3:5，v/v/v)溶液所組成的溶劑體系分離純化大葉白麻浸膏，上相為固定相，下相為流動(dòng)相。根據(jù)色譜圖收集相應(yīng)的組分，回收溶液即得化合物。經(jīng)1H-NMR、13C-NMR鑒定，所得化合物為槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷-6”-0-丙ニ酸酷。采用面積歸ー化計(jì)算，槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷_6”-O-丙ニ酸酯的純度分別為95. 8 %，96. 9%, 97. 7%。
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用高速逆流色譜法從大葉白麻中純化三種黃酮苷的方法，其特征是以大葉白麻葉為原料，經(jīng)過下列步驟處理(1)粗提物浸膏的制備；(2)高速逆流色譜純化，得到槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷_6”-O-丙ニ酸酯三種黃酮苷，其純度均高于96% ；(3)利用液相色譜技術(shù)對(duì)樣品純度進(jìn)行檢驗(yàn)； 所述步驟(I)大葉白麻粗提物浸膏的制備a將已粉碎好的大葉白麻，加入5-30倍的.40%-90%的こ醇溶液，回流提取30-240 min,分離殘?jiān)吞崛∫?；b再于殘?jiān)鼉?nèi)加入40%_90%的酒精5-20倍，重復(fù)回流提取2-3次，分離殘?jiān)吞崛∫海籧合并上述回流所得提取液，減壓回收合并液，得大葉白麻提取物浸膏； 所述步驟(2)高速逆流色譜純化a將溶劑系統(tǒng)正丁醇-石油醚-O. 5%醋酸水溶液按照體積比5:3:5配制于分液漏斗中，充分搖動(dòng)后靜置分層，以上相為固定相，下相為流動(dòng)相，取50-300 mg浸膏，溶于5mL上相和5mL下相的混合溶液中，作上樣溶液使用；b使高速逆流色譜儀以5. 0-20 mL/min的素的充滿上相溶液，然后轉(zhuǎn)動(dòng)主機(jī)，同時(shí)將流動(dòng)相泵入，待達(dá)到平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，于254 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)器譜圖收集目標(biāo)成分； 所述步驟(3)利用液相色譜技術(shù)檢驗(yàn)樣品樣品純度，色譜條件為C18柱(250mm X 4. 6mm),填料直徑i. d.，5 μ m,流動(dòng)相A-甲醇，B-水；梯度洗脫程序0-20 min,A: B= (20-70) to A:B (80-30)，流速I. O mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為 254 nm。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的步驟(2)，其特征在于高速逆流色譜所采用的溶劑系統(tǒng)為正丁醇-石油醚-O. 5%醋酸水溶液，體積比為5:3: 5。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的步驟(2)，其特征在于高速逆流色譜主機(jī)的轉(zhuǎn)速為650-900轉(zhuǎn)/分鐘，流動(dòng)相流速O. 8-3. O mL/min。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述步驟(2)中大葉白麻浸膏量為50— 300mg，是指數(shù)值區(qū)間的任一重量大葉白麻浸膏。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用高速逆流色譜法從大葉白麻中純化三種黃酮苷的方法，其特征在于異槲皮苷的保留時(shí)間為25-50 min，槲皮素-3-0-槐糖苷的保留時(shí)間為150-220min，異槲皮苷-6”-O-丙ニ酸酯的出峰時(shí)間為230-300 min。
全文摘要
一種應(yīng)用高速逆流色譜法從大葉白麻中純化三種黃酮苷的方法，其特征是以大葉白麻葉為原料，經(jīng)過下列步驟處理(1)粗提物浸膏的制備；(2)高速逆流色譜純化，得到槲皮素-3-O-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷-6”-O-丙二酸酯三種黃酮苷，其純度均高于96%；(3)利用液相色譜技術(shù)對(duì)樣品純度進(jìn)行檢驗(yàn)。所得三種單體含量均高于95%，符合一類植物新藥和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品要求。該方法具有處理簡(jiǎn)單，樣品損失少，制備量大，制備單品純度高及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，適用于從各種含有槲皮素-3-O-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷-6”-O-丙二酸酯的天然產(chǎn)物中獲取其高純度單體。
文檔編號(hào)C07H17/07GK102702289SQ20121018247
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月5日
發(fā)明者史俊友, 景年華, 江帆 申請(qǐng)人:曲靖師范學(xué)院