一種采用循環(huán)高速逆流色譜從麥冬須根中分離兩種高異黃酮的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于天然藥物技術領域，關于麥冬須根中化合物的分離純化方法，具體涉及利用循環(huán)高速逆流色譜從麥冬須根提取物中分離出甲基麥冬黃烷酮A和甲基麥冬黃烷酮B的方法。
【背景技術】
[0002]中藥麥冬(Oph1pogonis Radix)為百合科沿階草屬多年生常綠草本植物麥冬Oph1pogon japonicus (L.f) Ker-Gawl.的干燥塊根，為傳統(tǒng)常用中藥之一；具有養(yǎng)陰生津，潤肺清心的功效；主治肺燥干咳、陰虛癆咳、喉痹咽痛、津傷口渴、內熱消渴、心煩失眠、腸燥便秘等。本品主產于浙江省和四川省，分別被稱為浙麥冬和川麥冬。研究表明，高異黃酮是麥冬中一類重要的小分子活性成分，其母核骨架碳數(shù)為16個，比通常的異黃酮類化合物的B環(huán)和C環(huán)之間多了一個亞甲基；這類化合物具有抗腫瘤、抗炎、抑制磷酸化、抗雌激素、抗誘變、鎮(zhèn)咳、抗真菌、誘導血管舒張和肝細胞保護等多方面的生物活性和作用。
[0003]甲基麥冬黃烷酮A和甲基麥冬黃烷酮B (結構式見圖1)是麥冬中主要的高異黃酮類成分，但由于結構相似，在水、甲醇、乙腈等溶液中溶解度低。目前國內外所采用的硅膠柱層析、凝膠層析以及制備液相色譜等方法分離效果均不理想，通常無法在較短時間內使其得到有效分離，需進行多次純化及重復制備，操作繁瑣、費時費力。而且采用麥冬塊根藥材進行制備，成本高，還會大量消耗麥冬藥材資源。麥冬須根是麥冬傳統(tǒng)藥用部位塊根加工過程中的廢棄物，通常作為動物飼料或直接丟棄。
[0004]高速逆流色譜(HSCCC)—種基于液-液分配機理的新型色譜分離純化技術。它不用任何固態(tài)的支撐物或載體，而是利用兩相溶劑體系在高速旋轉的螺旋管內建立起一種特殊的單向性流體動力學平衡。當其中一相作為固定相，另一相作為流動相，在連續(xù)洗脫的過程中能保留大量固定相。由于不需要固體支撐體，物質的分離依據其在兩相中分配系數(shù)的不同而實現(xiàn)，從而避免了因不可逆吸附而引起的樣品損失、失活、變性等，特別適合于天然生物活性成分的分離。但是實驗發(fā)現(xiàn)單次常規(guī)的HSCCC分離甲基麥冬黃烷酮A和甲基麥冬黃烷酮B混合物效果也不理想。

【發(fā)明內容】

[0005]針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明的目的在于設計提供一種采用循環(huán)高速逆流色譜從麥冬須根中分離兩種高異黃酮的方法的技術方案，該方法具有高效、快速、可在不改變硬件的條件下顯著改善分離效果的優(yōu)勢。
[0006]發(fā)明人對麥冬化學成分研究發(fā)現(xiàn)，麥冬須根中甲基麥冬黃燒酮A和甲基麥冬黃燒酮B成分含量顯著高于塊根中含量，因而可以選擇麥冬須根為原料進行分離純化。
[0007]發(fā)明人試圖利用一次HSCCC對麥冬須根中甲基麥冬黃烷酮A和甲基麥冬黃烷酮B進行分離，但由于目標化合物性質極為接近，分離效果不理想。發(fā)明人通過實驗發(fā)現(xiàn)循環(huán)HSCCC可以顯著提高分離效果；不同的流動相均可應用，只是分離效果和循環(huán)的次數(shù)有所不同。循環(huán)高速逆流色譜硬件條件與常規(guī)高速逆流色譜一致，只是在進樣一定時間后將螺旋管出口與流動相栗的入口連接。因此在主機中經過一次分離后未完全分離的兩個組分能夠進入高速逆流色譜儀進行再分離，如此反復。當檢測器上的兩峰完全分離開之后，切斷螺旋管出口和栗入口的連接，并在前者處收集流出物即可得到具有滿意純度的兩種目標產物。
[0008]本發(fā)明具體通過以下方法實現(xiàn):
所述的一種采用循環(huán)高速逆流色譜從麥冬須根中分離兩種高異黃酮的方法，其特征在于包括以下工藝步驟:
1)以麥冬須根為原料，經乙醇提取、乙酸乙酯萃取和硅膠柱層析獲得僅含有甲基麥冬黃烷酮A和甲基麥冬黃烷酮B混合物；
2)步驟1)得到的甲基麥冬黃烷酮A和甲基麥冬黃烷酮B混合物應用高速逆流儀器進行分離純化，高速逆流儀器條件為將甲基麥冬黃烷酮A和甲基麥冬黃烷酮B混合物溶于上相中，以10?20mL/min的速度向高速逆流色譜儀中栗入下相，待管路完全充滿固定相后以600?lOOOrpm轉動主機，同時以1?3mL/min的速度栗入流動相，運行一定時間后將螺旋管出口與流動相栗的入口連接，根據HSCCC分離情況，循環(huán)3?8次后，切斷出口和入口的連接，從出口處收集流出物；
3)步驟2)得到的流出液用HPLC進行檢測，分別將甲基麥冬黃烷酮A和甲基麥冬黃烷酮B純度大于98%的收集液合并，用旋轉蒸發(fā)儀回收溶劑，得到單體化合物。
[0009]所述的一種采用循環(huán)高速逆流色譜從麥冬須根中分離兩種高異黃酮的方法，其特征在于所述的步驟1)中麥冬須根為浙麥冬須根和川麥冬須根。
[0010]所述的一種采用循環(huán)高速逆流色譜從麥冬須根中分離兩種高異黃酮的方法，其特征在于所述的步驟1)中硅膠柱層析條件:以石油醚和乙酸乙酯體積比為100:0、50:1、20:1,10:1,5:1分別洗脫，洗脫液根據HPLC檢識合并。
[0011]所述的一種采用循環(huán)高速逆流色譜從麥冬須根中分離兩種高異黃酮的方法，其特征在于所述的步驟2)中高速逆流色譜兩相溶劑體系正己烷:乙酸乙酯:乙醇:乙腈:水體積比為2:1?3:1?4:0?1.5:0.5?2，或正己烷:乙酸乙酯:甲醇:乙腈:水體積比為2:1?3:1?4:0?1.5:0.5?2，上相為固定相，下相為流動相。
[0012]本發(fā)明能夠高效、快速地將麥冬須根中的甲基麥冬黃烷酮A和B混合物有效分離，并且本發(fā)明與常規(guī)多次HSCCC制備相比，具有節(jié)省流動相，減少樣品回收負擔、節(jié)約時間等優(yōu)勢。
【附圖說明】
[0013]圖1為甲基麥冬黃烷酮A和甲基麥冬黃烷酮B結構式；
圖2為甲基麥冬黃烷酮A和甲基麥冬黃烷酮B的混合物樣品的HPLC譜圖；
圖3為甲基麥冬黃烷酮A和甲基麥冬黃烷酮B的循環(huán)HSCCC譜圖；
圖4為甲基麥冬黃烷酮A的HPLC色譜圖；
圖5為甲基麥冬黃烷酮B的HPLC色譜圖。
【具體實施方式】
[0014]以下結合實施例來進一步說明本發(fā)明。
[0015]實施例1
(1)甲基麥冬黃烷酮A和甲基麥冬黃烷酮B混合物樣品制備取浙麥冬的干燥須根6 kg，粉碎后用30 L 80%的乙醇超聲輔助提取2次，每次lh，過濾并合并濾液后，用旋轉蒸發(fā)儀上回收提取溶劑。所得浸膏用水稀釋后以乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯浸膏(46.97 g)過娃膠柱色譜，以石油醚:乙酸乙酯(100:0、50:1、20:1、10:1、5:1)分別洗脫2000mL洗脫液根據HPLC檢識合并，HPLC分析條件如下:色譜柱為Thermo C18(250 mmX4.6 mm, 5 μ m)，柱溫為30 °C，流動相采用水-乙腈(35:65);檢測波長為285nm ;流速設置為lmL/min。最終得到只含有甲基麥冬黃烷酮A和甲基麥冬黃烷酮B混合物1.50g，HPLC檢測色譜圖見圖2所示。
[0016](2)循環(huán)高速逆流色譜分離制備
應用TBE-300A型高速逆流儀器(上海同田生物技術有限公司)將以上制得甲基麥冬黃烷酮A