桃兒七中兩個(gè)異戊烯基化雙黃酮podoverine B和podoverine C的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種桃兒屯中兩個(gè)異戊締基化雙黃酬podoverineB 和podoverineC的制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤是一種嚴(yán)重威脅人類健康和生命的常見病、多發(fā)病?，F(xiàn)今，癌癥已成為全 世界首要的致死病因。前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤之一，在美國(guó)和歐洲成年男性的 惡性腫瘤中發(fā)病率最高。而隨著人們生活條件逐漸改善，人均壽命不斷延長(zhǎng)W及飲食結(jié)構(gòu) 發(fā)生的巨大變化，前列腺癌的發(fā)病率和死亡率在我國(guó)均有逐漸升高的趨勢(shì)，且發(fā)現(xiàn)時(shí)已多 屬中晚期，約有80 %的病人首先被發(fā)現(xiàn)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶，然后才確診為前列腺癌。對(duì)于轉(zhuǎn)移 性晚期前列腺癌主要治療方法是內(nèi)分泌治療，然而經(jīng)過幾個(gè)月的治療后，對(duì)內(nèi)分泌敏感的 前列腺癌常常轉(zhuǎn)變?yōu)榧に胤且蕾囆颓傲邢侔⑶覍?duì)常規(guī)治療方案都產(chǎn)生耐受性。中草藥 在抗腫瘤方面的應(yīng)用歷史悠久，為改變晚期前列腺癌治療的困境，從中草藥中尋找高效低 毒的抗前列腺癌活性物質(zhì)，研制選擇性強(qiáng)、毒副作用低的新型抗前列腺癌藥物是藥學(xué)科研 工作者迫切解決的首要問題。
[0003] 桃兒屯是小築科桃兒屯屬植物鬼白（Sinopodophyllumemodi(Wall.)Ying)的干 燥根及根莖。鬼白是一種具有悠久歷史的藥用植物，古代《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載：殺大 毒，療咳嗽喉疾，風(fēng)邪煩感，失魄妄見，不入湯。W后的歷代本草亦多有記載，主要用于活血 散結(jié)、桂風(fēng)除濕、蟲蛇咬傷、跌打、屯、胃痛、風(fēng)寒咳嗽、月經(jīng)不調(diào)、鐵棒鍵中毒、風(fēng)濕筋骨痛及 氣管炎等癥。鬼白分布比較廣泛，我國(guó)主要分布在四川、青海、西藏、甘肅、陜西。關(guān)于桃兒 屯的化學(xué)成分研究表明主要含有木脂素和簡(jiǎn)單取代的黃酬類化合物。雙黃酬類化合物首次 在該屬植物中被發(fā)現(xiàn)，該類成分具有重要而廣泛的生物活性如抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、 抗氧化、鎮(zhèn)痛、擴(kuò)張血管、抗凝血等。雙黃酬類化合物是由兩個(gè)黃酬單體經(jīng)過C-C鍵或C-0-C 鍵聚合而成，一般與其他類天然產(chǎn)物共存或在植物體內(nèi)含量較低，且具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，對(duì)于 該類成分的提取分離仍舊是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的工作。截止目前，異戊締基化雙黃酬類化合 物podoverineB和podoverineC僅僅從植物八角蓮（Podophyllumversipelle)的細(xì)胞 培養(yǎng)物中提取分離得到。具體的提取分離過程為，八角蓮的細(xì)胞培養(yǎng)物采用甲醇作為溶劑 連續(xù)回流提取，甲醇提取物采用XAD-2Amberlite大孔樹脂柱色譜劃分為Ξ個(gè)組分，含有目 標(biāo)成分的第二個(gè)組分經(jīng)過反相制備高效液相色譜進(jìn)行分離，得到的單體化合物最后再經(jīng)過 色譜柱純化。該提取分離方法設(shè)及到3次色譜操作，分離周期較長(zhǎng)，并且由于所用的吸附 劑對(duì)目標(biāo)成分的不可逆吸附，會(huì)導(dǎo)致樣品的回收率降低。高速逆流色譜是一種新型的無固 相載體的連續(xù)液液分配色譜技術(shù)，近年來廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、中醫(yī)藥、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域活 性成分的分離純化。高速逆流色譜技術(shù)不需要任何固態(tài)載體，避免樣品與固相載體的作 用而產(chǎn)生樣品的變性、失活和不可逆吸附等，同時(shí)還具有高效、快速、樣品制備量大、回收率 高、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)有的異戊締基化雙黃酬類化合物的分離方法中，尚未見凝膠柱色譜法 和高速逆流色譜法相結(jié)合用于桃兒屯中異戊締基化雙黃酬單體分離的有關(guān)技術(shù)報(bào)道。據(jù) 文獻(xiàn)報(bào)道podoverineB和podoverineC具有抗炎活性，對(duì)化學(xué)發(fā)光抑制的1C日。值分別為 6. 4X106mol/L和8. 9Xl〇5mol/L。本發(fā)明所設(shè)及的podoverineB和podoverineC的逆 流色譜分離和抗腫瘤活性（前列腺癌），迄今為止未見有專利或文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種桃兒屯中兩個(gè) 異戊締基化雙黃酬類化合物podoverineB和podoverineC的制備方法，可有效解決快速 從桃兒屯中制備兩個(gè)異戊締基化雙黃酬類化合物的問題。
[0005] 本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，一種桃兒屯中分離的兩個(gè)異戊締基化雙黃酬類化合物 podoverineB和podoverineC的制備方法，其分子結(jié)構(gòu)式分別為：
[0006]
陽007] 制備方法是：
[0008] 1)、粗提取物的制備：將桃兒屯3-6kg粉碎成過40目篩的粗粉，用桃兒屯6-12倍 重量的體積濃度為95 %的乙醇90-95°C回流提取2-4次，得乙醇提取液，每次1. 5-2小時(shí)， 合并乙醇提取液，減壓濃縮至無醇味，得濃縮物，加濃縮物重量7-12倍的蒸饋水混懸，得混 懸液，加入混懸液等體積的乙酸乙醋萃取3次，合并乙酸乙醋萃取層，減壓回收溶劑，得到 乙酸乙醋萃取部位的浸膏，即為桃兒屯粗提取物；
[0009] 2)、凝膠柱色譜初步分離：對(duì)桃兒屯粗提取物經(jīng)凝膠柱色譜初步分離，分別采用體 積比為5 : 5、6 : 4的甲醇-水系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，流速為0. 6-1血/min1，每7-10血為1 個(gè)流份，共收集50-60個(gè)流份，各個(gè)流份經(jīng)硅膠薄層色譜檢測(cè)分析，采用GF254薄層板，W體 積比4-6 : 1的二氯甲燒-甲醇作為展開劑，W體積比10 : 90的硫酸-乙醇溶液作為顯 色劑，100-110°C加熱3-5min，根據(jù)薄層色譜檢測(cè)結(jié)果合并含有目標(biāo)成分podoverineB和 podoverineC的流份，45°C減壓回收溶劑，得到含有目標(biāo)成分的濃縮物；
[0010] 3)、高速逆流色譜純化：取體積比為3.5 : 5 : 3.5 : 5的正己燒：乙酸乙醋： 甲醇：水，置于分液漏斗中，充分振搖均勻，靜置10-14小時(shí)，分別取上部液相和下部液 相，取含有目標(biāo)成分的濃縮物各100-200mg，分別加入濃縮物20-50倍重量的上部液相和下 部液相中，超聲溶解，得到含有目標(biāo)成分的超聲溶液，用高速逆流色譜儀進(jìn)行純化，方法是： 另取上部液相為固定相、下部液相為流動(dòng)相，固定相W2mL/min1流速注滿高速逆流色譜儀 的螺旋管，然后轉(zhuǎn)速調(diào)為750-85化/min,同時(shí)流動(dòng)相W2mL/min1流速累入螺旋管，待兩相 在高速逆流色譜儀的色譜柱中達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥注入超聲溶液，開啟檢測(cè)器和記 錄儀進(jìn)行分離，超聲溶液分離的檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，溫度為25-27Γ，高速逆流色譜儀轉(zhuǎn)速 750-85化/min,流動(dòng)相流速2. 0-2. 2mL/min1，根據(jù)色譜圖分別收集目標(biāo)成分，減壓回收溶劑 至干，即得兩個(gè)異戊締基化雙黃酬類化合物podoverineB和podoverineC。
[0011] 所述方法制備的桃兒屯中兩個(gè)異戊締基化雙黃酬類化合物podoverineB和 podoverineC在制備抗前列腺癌藥物中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明方法穩(wěn)定可靠，效率高，時(shí)間短，產(chǎn)率高，可快速?gòu)奶覂和椭蟹蛛x得到兩個(gè) 異戊締基化雙黃酬類化合物，且純度高，并經(jīng)活性試驗(yàn)表明對(duì)前列腺癌細(xì)胞PC-3具有細(xì)胞 毒活性，有效用于制備治療前列腺癌的藥物，經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益顯著。
【具體實(shí)施方式】
[0013] W下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0014] 實(shí)施例1
[0015] 桃兒屯中分離的兩個(gè)異戊締基化雙黃酬類化合物podoverineB和podoverineC 的制備方法，由W下方法實(shí)現(xiàn)：
[0016] 1)、粗提取物的制備：將桃兒屯3kg粉碎成過40目篩的粗粉，用桃兒屯12倍重量 的體積濃度為95%的乙醇90°C回流提取3次，得乙醇提取液，每次1. 5小時(shí)，合并乙醇提取 液，減壓濃縮至無醇味，得濃縮物，加濃縮物重量12倍的蒸饋水混懸，得混懸液，加入混懸 液等體積的乙酸乙醋萃取3次，合并乙酸乙醋萃取層，減壓回收溶劑，得到乙酸乙醋萃取部 位的浸膏，即為桃兒屯粗提取物；
[0017] 2)、凝膠柱色譜初步分離：對(duì)桃兒屯粗提取物經(jīng)凝膠柱色譜初步分離，分別采用體 積比為5 : 5、6 : 4的甲醇-水系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，流速為1血/mini,每7血為1個(gè)流份， 共收集55個(gè)流份，各個(gè)流份經(jīng)硅膠薄層色譜檢測(cè)分析，采用GF254薄層板，W體積比5 : 1 的二氯甲燒-甲醇作為展開劑，W體積比10 : 90的硫酸-乙醇溶液作為顯色劑，105°C加 熱3min，根據(jù)薄層色譜檢測(cè)結(jié)果合并含有目標(biāo)成分podoverineB和podoverineC的流份， 45°C減壓濃縮回收溶劑，得到含有目標(biāo)成分的濃縮物；
[0018] 3)、高速逆流色譜純化：取體積比為3. 5 : 5 : 3. 5 : 5的正己燒：乙酸乙醋： 甲醇：水，置于分液漏斗中，充分振搖均勻，靜置12小時(shí)，分別取上部液相和下部液相，取 含有目標(biāo)成分的濃縮物各lOOmg，分別加入濃縮物50倍重量的上部液相和下部液相中，超 聲溶解，得到含有目標(biāo)成分的超聲溶液，用高速逆流色譜儀進(jìn)行純化，方法是：另取上部液 相為固定相、下部液相為流動(dòng)相，固定相W2mL/min1流速注滿高速逆流色譜儀的螺旋管， 然后轉(zhuǎn)速調(diào)為85化/min,同時(shí)流動(dòng)相W2mL/min1流速累入螺旋管，待兩相在高速逆流色譜 儀的色譜柱中達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥注入超聲溶液，開啟檢測(cè)器和記錄儀進(jìn)行分離，超 聲溶液分離的檢測(cè)波長(zhǎng)為254皿，溫度為25°C，高速逆流色譜儀轉(zhuǎn)速85化/min,流動(dòng)相流速 2mL/min1，根據(jù)色譜圖分別收集目標(biāo)成分，減壓回收溶劑至干，即得兩個(gè)異戊締基化雙黃酬 類化合物podoverineB和podoverineC。
[0019] 實(shí)施例2
[0020] 桃兒屯中分離的兩個(gè)異戊締基化雙黃酬類化合物podoverineB和podoverineC 的制備方法，由W下方法實(shí)現(xiàn)：
[0021] 1)、粗提取物的制備：將桃兒屯5kg粉碎成過40目篩的粗粉，用桃兒屯10倍重量 的體積濃度為95 %的乙醇95°C回流提取2次，得乙醇提取液，每次2小時(shí)，合并乙醇提取 液，減壓濃縮至無醇味，得濃縮物，加濃縮物重量10倍的蒸饋水混懸，得混懸液，加入混懸 液等體積的乙酸乙醋萃取3次，合并乙酸乙醋萃取層，減壓回收溶劑，得到乙酸乙醋萃取部 位的浸膏