本申請(qǐng)要求2014年6月23日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?2/015,981的利益，所述申請(qǐng)整體通過(guò)參考并入本文。

技術(shù)領(lǐng)域

本公開(kāi)的主題內(nèi)容涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體來(lái)說(shuō)，本公開(kāi)的主題內(nèi)容涉及用作DNA疫苗的核酸和使用它們治療患有花生過(guò)敏反應(yīng)或?qū)ㄉ^(guò)敏反應(yīng)易感的受試者的方法。

背景技術(shù)：

當(dāng)免疫系統(tǒng)對(duì)被稱為過(guò)敏原的無(wú)害外來(lái)物質(zhì)做出反應(yīng)時(shí)，發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)。由于過(guò)敏性反應(yīng)這種潛在致死的系統(tǒng)性休克的高風(fēng)險(xiǎn)，食物過(guò)敏是重要的公共健康問(wèn)題(Sampson等，(1992)N.Engl.J.Med.327:380-384；Bock等，(2001)J.Allergy Clin.Immunol.107:191-193)。幼兒具有比公眾更高的發(fā)生食物過(guò)敏的風(fēng)險(xiǎn)(Lack等，(2003)N.Engl.J.Med 348:977-985；Zimmerman等，(1989)J.Allergy Clin.Immunol.83:764-770；Green等，(2007)Pediatrics 120:1304-1310)。在生命的前三年中，6-8％的兒童經(jīng)歷由食物引起的過(guò)敏反應(yīng)(Bock(1987)Allergy 45:587-596；Burks和Sampson(1993)Curr.Prob.Pediatr.23:230-252；Jansen等，(1994)J.Allergy Clin.Immunol.93；2:446-456；Sampson(1999)J.Allergy Clin.Immunol.103；5:717-728)。奶、蛋和花生是三種最常見(jiàn)的食物過(guò)敏原(Sampson(1988)J.Allergy Clin.Immunol.81:635-645)，并且到5歲為止，80-85％的具有奶或蛋過(guò)敏的兒童將長(zhǎng)大而不再發(fā)生過(guò)敏(Host等，(1997)J.Allergy Clin.Immunol.99:S490)。相反，只有20％的嬰兒發(fā)展出對(duì)花生的耐受(Skolnick等，(2001)J.Allergy Clin.Immunol.107；2:367-374)。

由暴露于食物過(guò)敏原、特別是花生而引起的過(guò)敏性反應(yīng)，引起以組胺的過(guò)量生產(chǎn)為特征的嚴(yán)重免疫反應(yīng)，并造成每年美國(guó)過(guò)敏性反應(yīng)急診的一半。在美國(guó)，這些對(duì)花生的極端反應(yīng)每年引起超過(guò)30,000例過(guò)敏性反應(yīng)事件和100–200例死亡。痕量的花生通常存在于數(shù)千種各種品牌但未標(biāo)注的包裝食品類(lèi)別中。超過(guò)150萬(wàn)美國(guó)人苦于花生過(guò)敏的癥狀，并且癥狀通常持續(xù)終生。許多人在痕量暴露后經(jīng)歷危險(xiǎn)的反應(yīng)。

沒(méi)有用于緩解花生過(guò)敏癥狀的治療方法；患有花生過(guò)敏的個(gè)人和諸如小學(xué)的機(jī)構(gòu)必須采取嚴(yán)格措施來(lái)避免暴露或攝入和潛在致命的過(guò)敏性反應(yīng)發(fā)作的風(fēng)險(xiǎn)。花生過(guò)敏的診斷要求維持恒定的飲食警覺(jué)以避免過(guò)敏性反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)(Yunginger等，(1988)JAMA 260:1450-1452)。在兒童的情況下，這種警覺(jué)也必須由父母親、學(xué)校和看護(hù)者實(shí)行。在過(guò)去的十年中，花生過(guò)敏的患病率已經(jīng)加倍，影響2％的成年美國(guó)人(Sampson(1999)J.Allergy Clin.Immunol.103；5:717-728；Sicherer等，(2003)J.Allergy Clin.Immunol.112:1203-1207)。盡管許多其他過(guò)敏癥如枯草熱和短豚草花粉的癥狀不危及生命，但對(duì)于花生過(guò)敏的個(gè)體來(lái)說(shuō)，攝入少至1/1000的花生可以引起過(guò)敏性休克和死亡(Taylor等，(2002)J.Allergy Clin.Immunol.109(1):24-30；Wensing等，(2002)J.Allergy Clin.Immunol.110(6):915-920)。所有食物誘導(dǎo)的過(guò)敏性休克中的三分之二已與花生的意外攝入相關(guān)聯(lián)(Bock等，(2001)J.Allergy Clin.Immunol.107:191-193)。在意外攝入引發(fā)過(guò)敏性反應(yīng)的情形中，使用腎上腺素注射來(lái)打開(kāi)氣道通道(Stark和Sullivan(1986)J.Allergy Clin.Immunol.78:76-83；Sampson(2003)Pediatrics 111(6):1601-1608)。

當(dāng)個(gè)體未能發(fā)展出口腔耐受而是相反變得對(duì)隨后的過(guò)敏原暴露敏感時(shí)，則發(fā)生食物過(guò)敏(Till等，(2004)J.Allergy Clin.Immunol.113(6):1025-1034)。在過(guò)敏患者中，過(guò)敏原傾向性地激活2型輔助性CD4+T淋巴細(xì)胞(Th2)，所述細(xì)胞產(chǎn)生促過(guò)敏細(xì)胞因子白介素IL-4、IL-5和IL-13，其幫助協(xié)調(diào)地產(chǎn)生作為大多數(shù)過(guò)敏癥狀的基礎(chǔ)的炎癥(Woodfolk(2007)J.Allergy Clin.Immunol.118(2):260-294)。IL-4指導(dǎo)產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞分泌過(guò)敏原特異性免疫球蛋白(Ig)E(Del Prete等，(1988)J.Immunol.140:4193-4198；Swain等，(1990)J.Immunol.145:3796-3806)。與中和性IgG不同，IgE結(jié)合于其被肥大細(xì)胞和嗜曙紅細(xì)胞表達(dá)的高親和性受體Fc--εRI(Blank等，(1989)Nature 337:187-190；Benhamou等，(1990)J.Immunol.144:3071-3077)，由此使這些細(xì)胞敏感。在隨后的暴露后，IgE結(jié)合引起麻煩的過(guò)敏原，交聯(lián)，并轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)以指導(dǎo)肥大細(xì)胞脫粒并釋放出引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)。

免疫療法，即給藥逐漸增加劑量的過(guò)敏原以引起耐受，是過(guò)敏性疾病的標(biāo)準(zhǔn)治療，但由于頻繁的過(guò)敏性反應(yīng)，尚未被批準(zhǔn)用于治療花生過(guò)敏(Nelson等，(1997)J.Allergy Clin.Immunol 99；6:744-751；Oppenheimer等，(1992)J.Allergy Clin.Immunol 90:256-262)。此外，免疫療法的應(yīng)用受到治療長(zhǎng)度的限制，其需要長(zhǎng)達(dá)36個(gè)月的每周或兩周一次的注射，并且成功和依從的程度變化不定(Bousquet等，(1998)J.Allergy Clin.Immunol 102:558-562；Rank和Li(2007)Mayo Clin.Proc.82(9):1119-1123；Ciprandi等，(2007)Allergy Asthma Proc.28:40-43)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

一方面，本文提供了一種分離或純化的核酸，其按順序排列包含：編碼信號(hào)序列的序列；編碼細(xì)胞器內(nèi)穩(wěn)定化/運(yùn)輸結(jié)構(gòu)域的序列；編碼花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域的序列，其中所述花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域包含至少一種花生過(guò)敏原，所述至少一種花生過(guò)敏原不包括所述花生過(guò)敏原的天然存在的信號(hào)序列；編碼跨膜結(jié)構(gòu)域的序列；和編碼內(nèi)吞體/溶酶體靶向結(jié)構(gòu)域的序列。在某些實(shí)施方式中，所述至少一種花生過(guò)敏原是Ara H1，Ara H2，Ara H3，AraH3del，Ara H1、Ara H2或Ara H3的具有至少一個(gè)花生過(guò)敏表位的部分，或其任何組合。

另一方面提供了一種藥物組合物，其包含一種或多種分離或純化的核酸，所述核酸按順序排列包含：編碼信號(hào)序列的序列；編碼細(xì)胞器內(nèi)穩(wěn)定化/運(yùn)輸結(jié)構(gòu)域的序列；編碼花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域的序列，其中所述花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域包含至少一種花生過(guò)敏原，所述至少一種花生過(guò)敏原不包括所述花生過(guò)敏原的天然存在的信號(hào)序列；編碼跨膜結(jié)構(gòu)域的序列；和編碼內(nèi)吞體/溶酶體靶向結(jié)構(gòu)域的序列。在某些實(shí)施方式中，所述至少一種花生過(guò)敏原是Ara H1，Ara H2，Ara H3，AraH3del，Ara H1、Ara H2或Ara H3的具有至少一個(gè)花生過(guò)敏表位的部分，或其任何組合。

另一方面，提供了在受試者中減輕、消除或阻止過(guò)敏反應(yīng)的方法，所述方法包括以足以減少或消除過(guò)敏原特異性IgE應(yīng)答的產(chǎn)生的量向所述受試者給藥本文公開(kāi)的DNA疫苗。

本公開(kāi)的主題內(nèi)容的某些方面已在上文中陳述，其完全或部分由本公開(kāi)的主題內(nèi)容應(yīng)對(duì)，當(dāng)結(jié)合隨附的實(shí)施例和圖進(jìn)行描述時(shí)，其他方面將變得明顯，正如在下文中最好地描述的。

附圖說(shuō)明

圖1是過(guò)敏原-LAMP1蛋白的示意圖。

圖2示出了在過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域中包括三種花生過(guò)敏原(AraHl、AraH2和AraH3，全都缺少它們本源或天然存在的信號(hào)序列)的核酸的載體圖譜。

圖3示出了由圖2的核酸編碼的蛋白質(zhì)的示意圖。

圖4示出了Western印跡，其顯示了花生過(guò)敏原Ara H1、H2和H3從本公開(kāi)的構(gòu)建物的共表達(dá)。

圖5示出了在通過(guò)真皮內(nèi)(ID)或肌內(nèi)(IM)注射用Ara H1-LAMP、Ara H2-LAMP和Ara-H3del-LAMP質(zhì)粒的組合或單個(gè)多價(jià)-Ara H1/H2/H3-LAMP質(zhì)粒(H1-3多價(jià)質(zhì)粒)免疫接種后，小鼠中的IgG1抗體水平；每組三個(gè)條代表如下：左邊的條，免疫接種后第49天；中間的條，第70天；右邊的條，第84天。

圖 6A-6B示出了在用Ara H1-LAMP、Ara H2-LAMP和Ara-H3del-LAMP質(zhì)粒的組合或單個(gè)多價(jià)Ara H1/H2/H3-LAMP質(zhì)粒免疫接種中，小鼠中的IgG2a抗體水平：A)真皮內(nèi)(ID)注射；每組三個(gè)條代表如下：左邊的條，免疫接種后第21天；中間的條，第35天；右邊的條，第49天；以及B)真皮內(nèi)(ID)或肌內(nèi)(IM)注射；藍(lán)色的條，免疫接種后第49天；紅色的條第70天，綠色的條，第84天。

圖7示出了用于本文中示出的預(yù)防性研究的方案的代表性實(shí)施方式。

圖8示出了在用ARA-LAMP-vax(被定義為Ara H1、Ara H2和Ara H3del質(zhì)粒的組合)免疫接種后，小鼠中的IgG1和IgG2a抗體水平。免疫接種方案：將5周齡雌性C3H/HeJ小鼠(N＝10只小鼠/組)在第0、7和14天用Ara-LAMP DNA疫苗免疫接種(周-3、-2、-1)。對(duì)照組接受僅含LAMP的載體。CPE被定義為花生粗提物。

圖9示出了在用ARA-LAMP-vax免疫接種并致敏后第58天，小鼠中的IgG1和IgG2a抗體水平。致敏方案：首先在第0周(W)三次然后每周一次直至W5將小鼠用10mg花生醬(PN)+20ug霍亂毒素(CT)胃內(nèi)(i.g.)致敏，隨后在W6和W8用50mg PN+20ug CT兩次加強(qiáng)。

圖10示出了在用ARA-LAMP-vax免疫接種并致敏后第92天，小鼠中的IgG1和IgG2a抗體水平。在5輪PN-CT致敏之后PN激惹之前——第92天的抗體滴度。致敏方案繼續(xù)。

圖11示出了在用ARA-LAMP-vax免疫接種、致敏和過(guò)敏性反應(yīng)激惹后，小鼠中的IgG1和IgG2a抗體水平。過(guò)敏性反應(yīng)激惹：然后在W12將小鼠用200mg花生醬(PN)i.g.激惹。

圖12示出了在免疫接種、致敏和過(guò)敏性反應(yīng)激惹后小鼠中的IgE抗體水平，支持了ARA-LAMP-vax的預(yù)防機(jī)制；每組兩個(gè)條代表如下：左邊的條，對(duì)照載體；右邊的條，Ara H-LAMP疫苗；最左邊的與其他組的條分開(kāi)單獨(dú)設(shè)置的條代表取血前。

圖13示出了圖9至12中示出的數(shù)據(jù)的概述。

圖14示出了圖9至12中示出的數(shù)據(jù)的另一個(gè)概述；下圖示出了兩條表示數(shù)據(jù)點(diǎn)的線，頂部的線表示對(duì)照載體，底部的線表示ARA-LAMP vax。

圖15示出了用于本文中示出的預(yù)防研究的代表性方案。

圖16示出了當(dāng)經(jīng)Bioject B2000無(wú)針裝置通過(guò)真皮內(nèi)注射(ID)遞送時(shí)，對(duì)ARA-LAMP-vax或單個(gè)多價(jià)Ara H1/H2/H3-LAMP質(zhì)粒的IgG1(圖A)、IgG2a(圖B)和IgE(圖C)應(yīng)答。在x-軸上描繪了第28、57、92、108、140和171天時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)示出了3個(gè)條，其代表如下：對(duì)照載體(左邊的條)，3個(gè)質(zhì)粒的組合(中間的條)和單個(gè)多過(guò)敏原質(zhì)粒(右邊的條)。

圖17示出了用于本文中示出的治療研究的方案的代表性實(shí)施方式。

圖18示出了在用ARA-LAMP-vax疫苗治療之前，小鼠中的血清花生特異性IgE抗體水平。

圖19示出了在用ARA-LAMP-vax疫苗治療之前和之后小鼠中的血清花生特異性IgE抗體水平。

圖20示出了在使用ARA-LAMP-vax和治療方案的第15周，小鼠中的過(guò)敏性反應(yīng)激惹結(jié)果(癥狀分值，圖A；體溫,圖B)。

圖21示出了在使用ARA-LAMP-vax和治療方案的第15周，口服激惹后小鼠中的血漿組胺水平。

圖22示出了在使用ARA-LAMP-vax和治療方案的第15周，小鼠中的IL-4細(xì)胞因子水平。

圖23示出了在使用ARA-LAMP-vax和治療方案的第15周，小鼠中的IFN-γ水平。

示例性實(shí)施方式的詳細(xì)描述

現(xiàn)在將詳細(xì)參考本公開(kāi)的各個(gè)示例性實(shí)施方式。應(yīng)該理解，下面示例性實(shí)施方式的討論不打算作為對(duì)本發(fā)明的限制，正如在本文中廣泛公開(kāi)的。相反，提供下面的討論是為了給讀者提供本發(fā)明的某些方面和特點(diǎn)的更詳細(xì)的理解。除非另有指明，否則本發(fā)明的實(shí)踐利用在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技巧范圍之內(nèi)的常規(guī)分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中充分解釋?zhuān)瑢?duì)于這些領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的，因此不需在本文中詳述。同樣地，本發(fā)明的用于醫(yī)學(xué)治療的實(shí)踐遵照本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)流程，并且那些流程不需在本文中詳述。

在詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施方式之前，應(yīng)該理解，本文中使用的術(shù)語(yǔ)僅僅用于描述特定實(shí)施方式的目的，不打算是限制性的。此外，當(dāng)提供值的范圍時(shí)，應(yīng)該理解，除非上下文另有明確陳述，否則在該范圍的上限與下限之間的精確到所述下限的單位的十分之一的每個(gè)中間值，也被具體地公開(kāi)。在陳述的范圍內(nèi)任何陳述的值或中間值之間的每個(gè)較小范圍以及該陳述的范圍內(nèi)的任何其他陳述的值或中間值，均被涵蓋在本發(fā)明之內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可以被獨(dú)立地包含或不包含在所述范圍內(nèi)，并且所述較小范圍中的包括了任一、兩個(gè)或不包括任一限度的每個(gè)范圍，也被涵蓋在本發(fā)明之內(nèi)，除了在所述陳述的范圍中任何被具體排除的限度之外。當(dāng)所述陳述的范圍包括一個(gè)或兩個(gè)所述限度時(shí)，排除了任一或兩個(gè)這些被包括的限度的范圍，也被包括在本發(fā)明之中。因此應(yīng)該理解，當(dāng)陳述值的范圍時(shí)，該范圍內(nèi)的每個(gè)值以及落于該范圍之內(nèi)的每個(gè)范圍也被固有地?cái)⑹?，并且避免每一個(gè)值和每一個(gè)可能的值的范圍的具體敘述，不是省略了這些值和范圍，而是為了方便讀者和本公開(kāi)的簡(jiǎn)潔。

除非另有定義，否則在本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與該術(shù)語(yǔ)所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的意義。盡管與本文中所描述的相似或等同的任何方法和材料可用于本發(fā)明的實(shí)踐或試驗(yàn)，但現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法和材料。本文中提到的所有出版物通過(guò)參考并入本文，以與所述出版物被引用的內(nèi)容相結(jié)合公開(kāi)并描述所述方法和/或材料。當(dāng)本公開(kāi)與任何并入的出版物沖突時(shí)，以本公開(kāi)為準(zhǔn)。

當(dāng)在本文和隨附的權(quán)利要求書(shū)中使用時(shí)，除非上下文另有明確敘述，否則單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)指稱物。因此，例如，對(duì)“過(guò)敏原”的指稱包括多個(gè)這種過(guò)敏原，并且對(duì)“樣品”的指稱包括對(duì)一個(gè)或多個(gè)樣品及其本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的等同物的指稱，等等。此外，可以使用等同術(shù)語(yǔ)來(lái)描述的術(shù)語(yǔ)的使用，包括那些等同的術(shù)語(yǔ)的使用。因此，例如，術(shù)語(yǔ)“受試者”的使用應(yīng)該被理解為包括術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”、“人”和在本領(lǐng)域中用于指示經(jīng)歷醫(yī)學(xué)治療的個(gè)體的其他術(shù)語(yǔ)。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“包含”打算意味著所述構(gòu)建物、組合物和方法包括所敘述的要素和/或步驟，但是不排除其他要素和/或步驟。當(dāng)用于定義構(gòu)建物、組合物和方法時(shí)，“基本上由……構(gòu)成”意味著排除了對(duì)于所敘述的構(gòu)建物、組合物和方法來(lái)說(shuō)具有本質(zhì)上的重要性的其他要素和步驟。因此，基本上由本文中所定義的要素構(gòu)成的組合物將不排除來(lái)自于分離和純化方法的痕量污染物和可藥用載體，例如磷酸鹽緩沖鹽水、防腐劑等?！坝伞瓨?gòu)成”意味著排除了其他成分的超過(guò)痕量的要素和用于給藥本發(fā)明的組合物的實(shí)質(zhì)性方法步驟。由每個(gè)這些過(guò)渡性術(shù)語(yǔ)定義的實(shí)施方式都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

“嵌合DNA”是較大DNA分子內(nèi)可辨別的DNA區(qū)段，其在自然界中不與所述較大分子相關(guān)聯(lián)出現(xiàn)。因此，當(dāng)嵌合DNA編碼蛋白質(zhì)區(qū)段時(shí)，所述區(qū)段編碼序列將在側(cè)翼帶有不在任何天然存在的基因組中位于所述編碼序列側(cè)翼的DNA。在側(cè)翼DNA編碼多肽序列的情形中，所述被編碼的蛋白質(zhì)被稱為“嵌合蛋白”(即具有融合在一起的非天然存在的氨基酸序列的蛋白)。基因等位變異或天然存在的突變事件不產(chǎn)生本文中所定義的嵌合DNA或嵌合蛋白。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”和“核酸分子”可互換使用，是指任何長(zhǎng)度的核苷酸的聚合形式。多核苷酸可以含有脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它們的類(lèi)似物。核苷酸可以具有任何三維結(jié)構(gòu)，并且可以執(zhí)行任何已知或未知的功能。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”包括例如單鏈、雙鏈和三螺旋分子、基因或基因片段、外顯子、內(nèi)含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、反義分子、cDNA、重組多核苷酸、支鏈多核苷酸、適體、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離的DNA、任何序列的分離的RNA、核酸探針和引物。核酸分子也可以包含修飾的核酸分子(例如包含修飾的堿基、糖和/或核苷酸間連接物)。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“肽”是指兩個(gè)或更多個(gè)子單元氨基酸、氨基酸類(lèi)似物或肽模擬物的化合物。所述子單元可以通過(guò)肽鍵或通過(guò)其他鍵(例如酯、醚等)相連。術(shù)語(yǔ)“肽”在本文中被用于一般性地指稱肽(即2至約20個(gè)殘基的聚氨基酸)、多肽(即約20個(gè)殘基至約100個(gè)殘基的肽)和蛋白質(zhì)(即具有約100或更多個(gè)殘基的肽)。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D或L兩種光學(xué)異構(gòu)體以及氨基酸類(lèi)似物和肽模擬物。3或更多個(gè)氨基酸的肽通常被稱為寡肽，如果所述肽鏈短的話。盡管術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”涵蓋了術(shù)語(yǔ)“多肽”，但“多肽”可以是少于全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)。

術(shù)語(yǔ)“過(guò)敏原”是指已被報(bào)道在重復(fù)地暴露于個(gè)體后誘導(dǎo)過(guò)敏性、即IgE介導(dǎo)的反應(yīng)的任何天然存在的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)混合物。過(guò)敏原是能夠喚起過(guò)敏反應(yīng)的任何化合物、物質(zhì)或材料。過(guò)敏原通常被理解為是抗原的亞類(lèi)，抗原是能夠喚起免疫應(yīng)答的化合物、物質(zhì)或材料。為了執(zhí)行本發(fā)明，過(guò)敏原可以選自天然或本源過(guò)敏原、修飾的天然過(guò)敏原、合成的過(guò)敏原、重組的過(guò)敏原、類(lèi)過(guò)敏原及其混合物或組合等。特別感興趣的是花生過(guò)敏原，尤其是能夠引起IgE介導(dǎo)的速發(fā)型超敏反應(yīng)的花生過(guò)敏原。根據(jù)它們的化學(xué)或生物化學(xué)本質(zhì)，過(guò)敏原可以表示本源或重組的蛋白質(zhì)或肽、本源或重組的蛋白質(zhì)或肽的片段或截短的版本、融合蛋白、合成的化合物(化學(xué)過(guò)敏原)、模擬過(guò)敏原的合成的化合物或化學(xué)或物理改變的過(guò)敏原，例如通過(guò)熱變性改性的過(guò)敏原。

“表位”是被免疫系統(tǒng)的組分特異性識(shí)別或特異性結(jié)合的結(jié)構(gòu)，通常由短的肽序列或寡糖構(gòu)成。T細(xì)胞表位通常被顯示是線性寡肽。兩個(gè)表位如果可以被同一抗體特異性結(jié)合，則它們彼此對(duì)應(yīng)。兩個(gè)表位如果都能結(jié)合于同一B細(xì)胞受體或同一T細(xì)胞受體，并且一個(gè)抗體與其表位的結(jié)合顯著阻止了被另一個(gè)表位結(jié)合(例如少于約30％，優(yōu)選地少于約20％，更優(yōu)選地少于約10％、5％、1％或約0.1％的另一個(gè)表位結(jié)合)，則它們彼此對(duì)應(yīng)。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，如果兩個(gè)核酸編碼序列或它們的互補(bǔ)序列編碼相同氨基酸序列，則這兩個(gè)序列彼此“對(duì)應(yīng)”。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，與另一個(gè)序列具有一定百分率(例如至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約99％)的“序列同一性”的多核苷酸或多核苷酸區(qū)域(或多肽或多肽區(qū)域)，意味著當(dāng)手動(dòng)或使用本領(lǐng)域中常規(guī)的軟件程序進(jìn)行最大比對(duì)時(shí)，在所述兩個(gè)序列中該百分率的堿基(或氨基酸)是相同的。

兩個(gè)核苷酸序列，當(dāng)在DNA序列的確定長(zhǎng)度內(nèi)至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約75％、優(yōu)選地至少約80％、最優(yōu)選地至少約90或95％的核苷酸匹配時(shí)，是“基本上同源的”或“基本上相似的”。同樣地，兩個(gè)多肽序列，當(dāng)在多肽序列的確定長(zhǎng)度內(nèi)多肽的至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約66％、至少約70％、至少約75％、優(yōu)選地至少約80％、最優(yōu)選地至少約90或95％或98％的氨基酸殘基匹配時(shí)，是“基本上同源的”或“基本上相似的”?；旧贤吹男蛄锌梢酝ㄟ^(guò)使用在序列數(shù)據(jù)庫(kù)中可用的標(biāo)準(zhǔn)軟件對(duì)所述序列進(jìn)行比較來(lái)鑒定?；旧贤吹暮怂嵝蛄幸部梢栽赟outhern雜交實(shí)驗(yàn)中，在例如為該特定系統(tǒng)所確定的嚴(yán)緊條件下鑒定。適合的雜交條件的確定在本領(lǐng)域技術(shù)的范圍之內(nèi)。例如，嚴(yán)緊條件可以是：在5xSSC和50％>甲酰胺下在42℃雜交，并在0.l x SSC和0.1％十二烷基硫酸鈉下在60℃清洗。

也可以提供結(jié)構(gòu)域序列的“保守修飾的變體”。對(duì)于特定核酸序列來(lái)說(shuō)，術(shù)語(yǔ)保守修飾的變體是指那些編碼一致或基本上一致的氨基酸序列的核酸，或者在所述核酸不編碼氨基酸序列的情況下，是指基本上一致的序列。具體來(lái)說(shuō)，可以通過(guò)產(chǎn)生其中一個(gè)或多個(gè)所選(或所有)密碼子的第三位被混合堿基和/或脫氧次黃苷殘基替換的序列，來(lái)實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)并密碼子替換(Batzer等，(1991)Nucleic Acid Res.19:508；Ohtsuka等，(1985)J.Biol.Chem.260:2605-2608；Rossolini等，(1994)Mol.Cell.Probes 8:91-98)。

術(shù)語(yǔ)野生型蛋白質(zhì)的“生物活性片段”、“生物活性形式”、“生物活性等同物”和“功能衍生物”，是指當(dāng)使用適合于檢測(cè)野生型蛋白質(zhì)的生物活性的測(cè)定法測(cè)量時(shí)，具有的生物活性至少基本上等于(例如不顯著不同于)所述野生型蛋白質(zhì)的生物活性的物質(zhì)。例如，包含運(yùn)輸結(jié)構(gòu)域的生物活性片段是可以與包含所述運(yùn)輸結(jié)構(gòu)域的全長(zhǎng)多肽共定位到同一區(qū)室的片段。

當(dāng)外源或異源核酸被導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)時(shí)，所述細(xì)胞已被這些核酸“轉(zhuǎn)化”、“轉(zhuǎn)導(dǎo)”或“轉(zhuǎn)染”。

轉(zhuǎn)化的DNA可以與構(gòu)成細(xì)胞基因組的染色體DNA整合(共價(jià)連接)，或者可以不與其整合。例如，在原核生物、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化的DNA可以維持在游離元件例如質(zhì)粒上。在真核細(xì)胞中，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是其中轉(zhuǎn)化的DNA已變得整合在染色體中，使得它通過(guò)染色體復(fù)制被子代細(xì)胞繼承的細(xì)胞。這種穩(wěn)定性通過(guò)所述真核細(xì)胞建立細(xì)胞系或包含大量含有所述轉(zhuǎn)化的DNA的子代細(xì)胞的克隆的能力來(lái)證實(shí)?！翱寺　笔菑膯我患?xì)胞或共同祖先通過(guò)有絲分裂產(chǎn)生的一群細(xì)胞?！凹?xì)胞系”是能夠在體外穩(wěn)定生長(zhǎng)許多代(例如至少約10代)的原代細(xì)胞的克隆。

“復(fù)制子”是在體內(nèi)起到DNA復(fù)制的自主單元作用的任何遺傳元件(例如質(zhì)粒、染色體、病毒)。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，“病毒載體”是指包含待遞送到宿主細(xì)胞中的多核苷酸的病毒或病毒粒子，不論是在體內(nèi)、離體還是體外。病毒載體的實(shí)例包括但不限于腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體等。在基因轉(zhuǎn)移由腺病毒載體介導(dǎo)的情況下，載體構(gòu)建物是指與腺病毒衣殼蛋白一起還包含腺病毒基因組或其部分和所選的非腺病毒基因的多核苷酸。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，“核酸遞送載體”是可以將目標(biāo)多核苷酸運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)的核酸分子。優(yōu)選地，這種載體包含可操作地連接到表達(dá)控制序列的編碼序列。然而，目標(biāo)多核苷酸序列不必定包含編碼序列。例如，目標(biāo)多核苷酸序列可以是結(jié)合到靶分子的適體。在另一個(gè)實(shí)例中，目標(biāo)序列可以是調(diào)控序列的互補(bǔ)序列，其結(jié)合到調(diào)控序列以抑制所述調(diào)控序列的調(diào)控。在另一個(gè)實(shí)例中，目標(biāo)序列本身是調(diào)控序列(例如，用于找出細(xì)胞中的調(diào)控因子)。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，“核酸遞送介質(zhì)”被定義為能夠?qū)⒉迦氲亩嗪塑账釘y帶到宿主細(xì)胞中的任何分子或一組分子或大分子(例如基因或基因片段、反義分子、核酶、適體等)，并且所述遞送與如上所述的核酸遞送載體相結(jié)合發(fā)生。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，“核酸遞送”或“核酸轉(zhuǎn)移”是指將外源多核苷酸(例如轉(zhuǎn)基因)導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中，不論所述導(dǎo)入使用何種方法。導(dǎo)入的多核苷酸可以穩(wěn)定地或暫時(shí)地維持在所述宿主細(xì)胞中。穩(wěn)定的維持通常要求導(dǎo)入的多核苷酸含有與所述宿主細(xì)胞相容的復(fù)制原點(diǎn)，或者整合到宿主細(xì)胞的復(fù)制子例如染色體外復(fù)制子(例如質(zhì)粒)或核或線粒體染色體中。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，“表達(dá)”是指將多核苷酸轉(zhuǎn)錄成mRNA和/或翻譯成肽、多肽或蛋白質(zhì)的過(guò)程。如果所述多核苷酸源自于基因組DNA，表達(dá)可以包括從基因組DNA轉(zhuǎn)錄的mRNA的拼接。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，“在轉(zhuǎn)錄控制下”或“可操作地連接”是指多核苷酸序列的表達(dá)(例如轉(zhuǎn)錄或翻譯)通過(guò)表達(dá)控制元件和編碼序列的適合的并置來(lái)控制。在一種情況下，當(dāng)表達(dá)控制序列控制并調(diào)節(jié)DNA序列的轉(zhuǎn)錄時(shí)，該DNA序列“可操作地連接”到所述表達(dá)控制序列。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，“編碼序列”是當(dāng)置于適合的表達(dá)控制序列的控制之下時(shí)被轉(zhuǎn)錄并翻譯成多肽的序列。編碼序列的邊界由5’(氨基)端的起始密碼子和3’(羧基)端的翻譯終止密碼子確定。編碼序列可以包括但不限于原核序列、來(lái)自于真核mRNA的cDNA、來(lái)自于真核(例如哺乳動(dòng)物)DNA的基因組DNA序列和甚至合成的DNA序列。例如，這些合成的DNA序列可以包括為打算在其中表達(dá)所述序列的生物體進(jìn)行過(guò)密碼子優(yōu)化的序列。多腺苷化信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止序列通常位于編碼序列的3’。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，“遺傳修飾”是指細(xì)胞的正常核苷酸序列的任何添加或缺失或破壞。本領(lǐng)域公認(rèn)的方法包括病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，例如使用基于DNA病毒如腺病毒、腺相關(guān)病毒和皰疹病毒的載體以及基于反轉(zhuǎn)錄病毒的載體。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，“溶酶體/內(nèi)吞體區(qū)室”是指膜結(jié)合性酸性液泡，其含有膜中的LAMP分子、在抗原加工中起作用的水解酶類(lèi)和用于抗原識(shí)別和呈遞的II類(lèi)MHC分子。該區(qū)室起到通過(guò)各種不同機(jī)制包括胞吞作用、吞噬作用和胞飲作用從細(xì)胞表面內(nèi)化的外來(lái)材料和通過(guò)專(zhuān)門(mén)的自溶現(xiàn)象遞送到該區(qū)室的細(xì)胞內(nèi)材料的降解位點(diǎn)的作用(參見(jiàn)例如de Duve(1983)Eur.J.Biochem.137:391)。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“內(nèi)吞體”涵蓋了溶酶體。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，“溶酶體相關(guān)的細(xì)胞器”是指包含溶菌酶的任何細(xì)胞器，并包括但不限于MIIC、CUV、黑素體、分泌顆粒、裂解性顆粒、血小板致密顆粒、嗜堿顆粒、伯貝克顆粒、吞噬溶酶體、分泌溶酶體等。優(yōu)選地，這種細(xì)胞器缺少甘露糖6-磷酸受體并包含LAMP，但可以包含或可以不包含II類(lèi)MHC分子。對(duì)于綜述來(lái)說(shuō)，參見(jiàn)例如Blott和Griffiths(2002)Nature Reviews,Molecular Cell Biology；DellAngelica等，(2000)The FASEB Journal 14:1265-1278。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，“溶酶體相關(guān)膜蛋白”或“LAMP”是指包含存在于內(nèi)吞體/溶酶體區(qū)室或溶酶體相關(guān)的細(xì)胞器的膜中的結(jié)構(gòu)域并且還包含腔內(nèi)結(jié)構(gòu)域(luminal domain)的任何蛋白質(zhì)。示例性的LAMP包括但不限于LAMP-1、LAMP-2、CD63/LAMP-3(DC-LAMP)或其同源物、直向同源物、變體(例如等位基因變體)和修飾的形式(例如包含一個(gè)或多個(gè)天然存在的或工程化的突變)。在某些實(shí)施方式中，LAMP是哺乳動(dòng)物的溶酶體相關(guān)膜蛋白，例如人類(lèi)或小鼠的溶酶體相關(guān)膜蛋白。示例性的LAMP包括包含與SEQ ID NO：22、23、24、25或30具有至少約80％同一性、至少約81％同一性、至少約82％同一性、至少約83％同一性、至少約84％同一性、至少約85％同一性、至少約86％同一性、至少約87％同一性、至少約88％同一性、至少約89％同一性、至少約90％同一性、至少約91％同一性、至少約92％同一性、至少約93％同一性、至少約94％同一性、至少約95％同一性、至少約96％同一性、至少約97％同一性、至少約98％同一性、至少約99％同一性或100％同一性的氨基酸序列的肽?？捎糜诒竟_(kāi)的核酸分子的編碼LAMP肽的示例性核苷酸序列包括但不限于與SEQ ID NO：10、11、12、13或29具有至少約80％同一性、至少約81％同一性、至少約82％同一性、至少約83％同一性、至少約84％同一性、至少約85％同一性、至少約86％同一性、至少約87％同一性、至少約88％同一性、至少約89％同一性、至少約90％同一性、至少約91％同一性、至少約92％同一性、至少約93％同一性、至少約94％同一性、至少約95％同一性、至少約96％同一性、至少約97％同一性、至少約98％同一性、至少約99％同一性或100％同一性的任何序列。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定化結(jié)構(gòu)域”打算是指有助于保持蛋白質(zhì)有活性和/或處于其天然構(gòu)象下的結(jié)構(gòu)域。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“運(yùn)輸結(jié)構(gòu)域”打算是指有助于將蛋白質(zhì)靶向細(xì)胞的特定部位的結(jié)構(gòu)域。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，“靶向結(jié)構(gòu)域”是指將本發(fā)明的嵌合蛋白導(dǎo)向優(yōu)選位點(diǎn)例如細(xì)胞的細(xì)胞器或發(fā)生抗原加工和與MHC II結(jié)合的區(qū)室的多肽序列。因此，“靶向結(jié)構(gòu)域”是指向細(xì)胞區(qū)室/細(xì)胞器遞送所需的一系列氨基酸。優(yōu)選地，靶向結(jié)構(gòu)域是結(jié)合到接頭或AP蛋白(例如AP1、AP2或AP3蛋白)的序列。示例性的靶向結(jié)構(gòu)域序列描述在例如DellAngelica，2000中。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，“內(nèi)吞體/溶酶體靶向結(jié)構(gòu)域”是指向內(nèi)吞體/溶酶體區(qū)室或溶酶體相關(guān)的細(xì)胞器遞送所需的一系列氨基酸。例如，LAMP向溶酶體外膜的運(yùn)輸，由接頭蛋白與內(nèi)吞體/溶酶體靶向結(jié)構(gòu)域的結(jié)合所介導(dǎo)，所述靶向結(jié)構(gòu)域是羧基端細(xì)胞質(zhì)尾部中的酪氨酸識(shí)別序列(其中Y是酪氨酸殘基，X可以是任何氨基酸，并且是大的疏水殘基)。示例性的酪氨酸識(shí)別序列包括氨基酸序列YQTI、YQRI、YEQF和YHTL。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，體內(nèi)核酸遞送、核酸轉(zhuǎn)移、核酸療法等，是指將包含外源多核苷酸的載體直接導(dǎo)入到生物體例如人類(lèi)或非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的體內(nèi)，由此將所述外源多核苷酸體內(nèi)導(dǎo)入到該生物體的細(xì)胞中。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“原位”是指一種類(lèi)型的體內(nèi)核酸遞送，在其中將所述核酸帶到靶細(xì)胞附近(例如，所述核酸未被系統(tǒng)性給藥)。例如，原位遞送方法包括但不限于將核酸直接注射在位點(diǎn)處(例如注射到組織如腫瘤或心肌中)，將所述核酸通過(guò)開(kāi)放的手術(shù)野與細(xì)胞或組織相接觸，或使用醫(yī)學(xué)接入裝置例如導(dǎo)管將所述核酸遞送到位點(diǎn)。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“分離的”和“純化的”有時(shí)可互換使用，意味著與在天然情況下通常伴隨著所述多核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或其片段的細(xì)胞或其他方面的組成成分分離開(kāi)。例如，對(duì)于多核苷酸而言，分離的多核苷酸是與在染色體中通常與其相伴的5’和3’序列分離開(kāi)的多核苷酸。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，顯然非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或其片段不需“分離”以將其與其天然存在的對(duì)應(yīng)物區(qū)分開(kāi)。此外，術(shù)語(yǔ)“分離的”和“純化的”不暗示徹底分離和徹底純化。這些術(shù)語(yǔ)被用于指稱從天然與所述多核苷酸等相伴存在的一些或所有其他物質(zhì)中部分和徹底純化兩者。因此，這些術(shù)語(yǔ)可以意味著與一種天然相伴的物質(zhì)分離或純化(例如從RNA分離或純化DNA)，從同一分子總類(lèi)的其他物質(zhì)中分離或純化(例如與樣品中的所有蛋白質(zhì)相比顯示出20％純度的特定蛋白質(zhì))，或任何組合。分離和純化可以意味著從約1％至約100％的任何水平，包括100％。因此，“分離的”或“純化的”細(xì)胞群體基本上不含在天然條件下與其相伴的細(xì)胞和材料。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，所有特定值、包括值的分?jǐn)?shù)，被涵蓋在這些范圍之內(nèi)，而不需將每個(gè)特定值在本文中列出。出于簡(jiǎn)潔的目的沒(méi)有具體公開(kāi)每個(gè)值；然而，讀者應(yīng)該理解，每個(gè)和所有的特定值都固有地被本發(fā)明公開(kāi)并涵蓋。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，“靶細(xì)胞”或“受體細(xì)胞”是指?jìng)€(gè)體細(xì)胞或希望成為或已經(jīng)成為外源核酸分子、多核苷酸和/或蛋白質(zhì)的接受者的細(xì)胞。所述術(shù)語(yǔ)還打算包括單個(gè)細(xì)胞的后代，并且由于天然、偶然或故意的突變，所述后代可以不必與原始親代細(xì)胞完全一致(在形態(tài)或基因組或全套總DNA方面)。靶細(xì)胞可能與其他細(xì)胞相接觸(例如當(dāng)在組織中時(shí))，或者可能在生物體的身體內(nèi)循環(huán)存在。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“抗原呈遞細(xì)胞”或“APC”是指在表面上呈遞與主要組織相容性復(fù)合物分子或其一部分或者一個(gè)或多個(gè)非經(jīng)典MHC分子或其一部分相結(jié)合的抗原的任何細(xì)胞。適合的APC的實(shí)例在下面詳細(xì)討論，并且包括但不限于完整細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、B細(xì)胞、雜合APC和foster抗原呈遞細(xì)胞。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，“工程化的抗原呈遞細(xì)胞”是指在表面上具有非天然分子組成部分的抗原呈遞細(xì)胞。例如，這種細(xì)胞在其表面上可能不天然具有輔助刺激因子，或者除了天然的輔助刺激因子之外在其表面上可能具有其他人造的輔助刺激因子，或者可以在其表面上表達(dá)非天然的II類(lèi)分子。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“免疫效應(yīng)細(xì)胞”是指能夠結(jié)合抗原并介導(dǎo)免疫應(yīng)答的細(xì)胞。這些細(xì)胞包括但不限于T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)例如CTL株系、CTL克隆和來(lái)自于腫瘤、炎性或其他浸潤(rùn)液的CTL。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“受試者”和“患者”可互換使用，以指示本發(fā)明所針對(duì)的動(dòng)物。術(shù)語(yǔ)動(dòng)物應(yīng)該被理解為包括人類(lèi)和非人類(lèi)動(dòng)物；在希望區(qū)分這兩者的情況下，使用術(shù)語(yǔ)人類(lèi)和/或非人類(lèi)動(dòng)物。在某些實(shí)施方式中，受試者或患者是脊椎動(dòng)物，優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選為人。哺乳動(dòng)物包括但不限于鼠類(lèi)、猿類(lèi)、人類(lèi)、耕畜(例如牛、綿羊、豬)、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物(例如馬)和寵物(例如犬和貓)。

臨床過(guò)敏癥狀對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的，并且不需在本文中詳盡列出。非限制性實(shí)例包括鼻炎、結(jié)膜炎、哮喘、蕁麻疹、濕疹，其包括在皮膚、眼、鼻、上下氣道中的反應(yīng)，并伴有常見(jiàn)癥狀例如眼和鼻的發(fā)紅發(fā)癢、鼻癢和流涕、咳嗽、氣喘、呼吸短促、瘙癢和組織腫脹。

“體內(nèi)免疫試驗(yàn)”的實(shí)例包括皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)(SPT)、結(jié)膜激發(fā)試驗(yàn)(CPT)、使用過(guò)敏原的支氣管激惹(BCA)以及各種不同的在其中監(jiān)測(cè)一種或多種過(guò)敏癥狀的臨床試驗(yàn)。參見(jiàn)例如Haugaard等，J Allergy Clin Immunol,Vol.91,No.3,pp 709-722,March 1993。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“可藥用載體”涵蓋了本領(lǐng)域中已知的任何標(biāo)準(zhǔn)的制藥載體，例如磷酸鹽緩沖鹽水溶液、水和乳液，例如油/水或水/油乳液，以及各種不同類(lèi)型的潤(rùn)濕劑。組合物還可以包括穩(wěn)定劑和防腐劑。對(duì)于載體、穩(wěn)定劑和佐劑的實(shí)例，參見(jiàn)Martin Remington's Pharm.Sci.,15th Ed.(Mack Publ.Co.,Easton(1975))。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，“治療有效量”在本文中用于指稱足以阻止、校正異常生理反應(yīng)和/或使其正?；牧?。在一種情況下，“治療有效量”是足以使疾病的臨床顯著特點(diǎn)例如臨床過(guò)敏癥狀、抗體生產(chǎn)、細(xì)胞因子生產(chǎn)、發(fā)熱或白細(xì)胞計(jì)數(shù)或組胺水平降低至少約30％、更優(yōu)選地至少50％、最優(yōu)選地至少90％的量。

“抗體”是任何免疫球蛋白，包括抗體及其結(jié)合特定表位的片段。所述術(shù)語(yǔ)涵蓋了多克隆、單克隆和嵌合抗體(例如雙特異性抗體)?！翱贵w結(jié)合部位”是抗體分子的由重鏈和輕鏈可變和超變區(qū)構(gòu)成的特異性結(jié)合抗原的結(jié)構(gòu)部分。示例性的抗體分子是完整的免疫球蛋白分子、基本上完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的含有補(bǔ)位的部分，包括Fab、Fab'、F(ab')₂和F(v)部分，在本文描述的治療方法中優(yōu)選使用所述部分。

術(shù)語(yǔ)“口腔粘膜給藥”是指將劑型置于舌下或口腔中的其他地方以允許活性成分與患者的口腔或咽喉的粘膜發(fā)生接觸，以便獲得所述活性成分的局部或系統(tǒng)效應(yīng)的給藥途徑。口腔粘膜給藥途徑的實(shí)例是舌下給藥。術(shù)語(yǔ)“舌下給藥”是指將劑型置于舌下以便獲得活性成分的局部或系統(tǒng)效應(yīng)的給藥途徑。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“真皮內(nèi)遞送”意味著將疫苗遞送到皮膚中的真皮。然而，疫苗將不一定僅僅位于真皮中。真皮是皮膚中的一層，在人類(lèi)皮膚中位于距表面約1.0至約2.0mm之間，但是在個(gè)體之間以及身體的不同部分中存在一定量的可變性。一般來(lái)說(shuō)，通過(guò)進(jìn)入皮膚表面下方1.5mm，預(yù)期可以到達(dá)真皮。真皮位于表面處的角質(zhì)層和表皮與下方的皮下層之間，取決于遞送方式，疫苗最終可以僅僅或主要位于真皮內(nèi)，或者它最終可以分布在表皮和真皮內(nèi)。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，在過(guò)敏免疫療法、過(guò)敏治療或描述被設(shè)計(jì)用于過(guò)敏患者的干預(yù)的其他術(shù)語(yǔ)的背景中，術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”或“預(yù)防性的”意味著在所有患者中的至少20％的患者中阻止IgE應(yīng)答。術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”不要求在所有患者中完全阻止IgE介導(dǎo)的疾病的發(fā)生，并且對(duì)于通過(guò)減輕過(guò)敏癥狀的機(jī)制治療過(guò)敏來(lái)說(shuō)，這種定義在本發(fā)明的范圍之外，并且與該術(shù)語(yǔ)在本領(lǐng)域中的使用不一致。對(duì)于過(guò)敏免疫治療領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，眾所周知，過(guò)敏治療不是在100％的患者中100％有效的，因此在本發(fā)明的背景中，不使用“預(yù)防”的絕對(duì)定義。本發(fā)明考慮到了本領(lǐng)域公認(rèn)的預(yù)防概念。

廣義來(lái)說(shuō)，本公開(kāi)提供了多核酸、多氨基酸和治療需要所述多核酸和多氨基酸的受試者的方法。所述多核酸及其組合物可以被認(rèn)為是用于在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生花生過(guò)敏原序列(多氨基酸)，在給藥所述多核酸的受試者體內(nèi)引發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答的核酸(例如DNA、RNA)疫苗。所述多核酸在給藥時(shí)，傾向性地通過(guò)MHC-II途徑喚起細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，并通過(guò)激活花生過(guò)敏原特異性1型輔助性T細(xì)胞(Thl)細(xì)胞應(yīng)答來(lái)喚起IgG抗體的生產(chǎn)，并由APC、NK細(xì)胞和T細(xì)胞生產(chǎn)干擾素，而不是激活Th2類(lèi)型的應(yīng)答，其涉及IgE抗體、粒細(xì)胞(例如嗜曙紅細(xì)胞)和其他物質(zhì)的產(chǎn)生。在某種程度上，MHC-II和MHC-I應(yīng)答兩者都可以產(chǎn)生；然而，本發(fā)明提供了主要或基本上是MHC-II應(yīng)答的應(yīng)答。在某些實(shí)施方式中，免疫系統(tǒng)被重新平衡以有利于IgG/Th1應(yīng)答而不是過(guò)敏性IgE/Th2應(yīng)答。優(yōu)選地，所述核酸不編碼抗生素抗性基因。

具體來(lái)說(shuō)，本文提供了新的花生過(guò)敏DNA疫苗，其利用溶酶體相關(guān)膜蛋白(“LAMP”)嵌合構(gòu)建物將花生過(guò)敏原引入MHC II/內(nèi)吞體途徑中。本公開(kāi)的疫苗，包括本文中描述的核酸分子、載體和藥物組合物，為花生過(guò)敏患者提供了安全、低過(guò)敏原性且成本效益高的療法，顯著降低或消除對(duì)花生的敏感性。

本公開(kāi)的核酸當(dāng)給藥到受試者時(shí)，將抗原隔離在抗原呈遞細(xì)胞的溶酶體區(qū)室中，并在過(guò)敏患者中實(shí)施Th2到Th1應(yīng)答的調(diào)節(jié)。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于本公開(kāi)的構(gòu)建物被設(shè)計(jì)用于防止意外的過(guò)敏原暴露。過(guò)敏原作為核酸被編碼，因此在給藥后沒(méi)有顯著量的過(guò)敏原被系統(tǒng)性暴露。它被編碼在LAMP內(nèi)，以備高保真度的溶酶體運(yùn)輸。在溶酶體中，所述過(guò)敏原經(jīng)歷蛋白水解，將過(guò)敏原性表位暴露于MHC-II并呈遞給輔助性T細(xì)胞。因此，接受本公開(kāi)的療法的受試者在不暴露于游離過(guò)敏原的情況下顯示出臨床反應(yīng)。

因此，在某些實(shí)施方式中提供了一種分離或純化的核酸分子，其按順序排列包含：編碼信號(hào)序列的核酸序列；編碼細(xì)胞器內(nèi)穩(wěn)定化/運(yùn)輸結(jié)構(gòu)域的核酸序列；編碼花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域的核酸序列，所述花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域可以包含單一花生過(guò)敏原或兩種或更多種花生過(guò)敏原，每種過(guò)敏原包含一個(gè)或多個(gè)花生過(guò)敏原性表位，并且其中所述至少一種花生過(guò)敏原不包括所述花生過(guò)敏原本源的信號(hào)序列；編碼跨膜結(jié)構(gòu)域的核酸序列；和編碼內(nèi)吞體/溶酶體靶向結(jié)構(gòu)域的核酸序列。

本文中提供的分離或純化的核酸分子包含信號(hào)序列。在某些實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列包含LAMP的信號(hào)序列。在某些實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)易位序列。示例性的LAMP信號(hào)序列包括但不限于LAMP-1、LAMP2、LAMP-3(DC-LAMP)、LIMP II或ENDOLYN的信號(hào)序列。示例性的LAMP信號(hào)序列包括的肽包含與SEQ ID NO：1的第1-27位氨基酸、SEQ ID NO：22的第1-27位氨基酸、SEQ ID NO：23的第1-28位氨基酸、SEQ ID NO：24的第5-27位氨基酸和SEQ ID NO：25的第1-24位氨基酸具有至少約80％同一性、至少約81％同一性、至少約82％同一性、至少約83％同一性、至少約84％同一性、至少約85％同一性、至少約86％同一性、至少約87％同一性、至少約88％同一性、至少約89％同一性、至少約90％同一性、至少約91％同一性、至少約92％同一性、至少約93％同一性、至少約94％同一性、至少約95％同一性、至少約96％同一性、至少約97％同一性、至少約98％同一性、至少約99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。可用于本公開(kāi)的核酸分子的編碼LAMP信號(hào)序列的示例性核苷酸序列包括但不限于與SEQ ID NO：18的第1-86位核苷酸、SEQ ID NO：19的第1-86位核苷酸、SEQ ID NO：20的第1-86位核苷酸、SEQ ID NO：21的第1-86位核苷酸、SEQ ID NO：10的第1-84位核苷酸、SEQ ID NO：11的第1-81位核苷酸、SEQ ID NO：12的第1-72位核苷酸和SEQ ID NO：13的第13-81位核苷酸具有至少約80％同一性、至少約81％同一性、至少約82％同一性、至少約83％同一性、至少約84％同一性、至少約85％同一性、至少約86％同一性、至少約87％同一性、至少約88％同一性、至少約89％同一性、至少約90％同一性、至少約91％同一性、至少約92％同一性、至少約93％同一性、至少約94％同一性、至少約95％同一性、至少約96％同一性、至少約97％同一性、至少約98％同一性、至少約99％同一性或100％同一性的任何序列。

本文中描述的分離或純化的核酸分子還包含編碼細(xì)胞器內(nèi)穩(wěn)定化/運(yùn)輸結(jié)構(gòu)域的序列，所述結(jié)構(gòu)域包含編碼溶酶體相關(guān)膜蛋白(LAMP)的序列。例如，所述細(xì)胞器內(nèi)穩(wěn)定化/運(yùn)輸結(jié)構(gòu)域可以包含LAMP的腔內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞器內(nèi)穩(wěn)定化/運(yùn)輸結(jié)構(gòu)域包含LAMP1、LAMP2、LAMP-3(DC-LAMP)、LIMP II或ENDOLYN的腔內(nèi)結(jié)構(gòu)域。示例性的細(xì)胞器內(nèi)穩(wěn)定化/運(yùn)輸結(jié)構(gòu)域包括但不限于與SEQ ID NO：1的第28至380位氨基酸、SEQ ID NO：22的第28-381位氨基酸、SEQ ID NO：23的第29-375位氨基酸、SEQ ID NO：24的第28-433位氨基酸或SEQ ID NO：25的第25-162位氨基酸具有至少約80％同一性、至少約81％同一性、至少約82％同一性、至少約83％同一性、至少約84％同一性、至少約85％同一性、至少約86％同一性、至少約87％同一性、至少約88％同一性、至少約89％同一性、至少約90％同一性、至少約91％同一性、至少約92％同一性、至少約93％同一性、至少約94％同一性、至少約95％同一性、至少約96％同一性、至少約97％同一性、至少約98％同一性、至少約99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。示例性的細(xì)胞器內(nèi)穩(wěn)定化/運(yùn)輸結(jié)構(gòu)域可以由與SEQ ID NO：18的第87-1146位核苷酸、SEQ ID NO：19的第87-1146位核苷酸、SEQ ID NO：20的第87-1146位核苷酸、SEQ ID NO：21的第87-1146位核苷酸、SEQ ID NO：10的第85-1125位核苷酸、SEQ ID NO：11的第82-1143位核苷酸、SEQ ID NO：12的第73-486位核苷酸或SEQ ID NO：13的第82-1299位核苷酸具有至少約80％同一性、至少約81％同一性、至少約82％同一性、至少約83％同一性、至少約84％同一性、至少約85％同一性、至少約86％同一性、至少約87％同一性、至少約88％同一性、至少約89％同一性、至少約90％同一性、至少約91％同一性、至少約92％同一性、至少約93％同一性、至少約94％同一性、至少約95％同一性、至少約96％同一性、至少約97％同一性、至少約98％同一性、至少約99％同一性或100％同一性的核苷酸序列編碼。

本文中描述的核酸分子還包含編碼花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域的序列。所述編碼花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域的序列包含編碼一種或多種花生過(guò)敏原蛋白、多肽或肽的核酸序列，所述蛋白、多肽或肽包含一個(gè)或多個(gè)過(guò)敏原性表位。所述花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地不包括來(lái)自于所述花生過(guò)敏原的天然存在的信號(hào)序列。當(dāng)使用小于全長(zhǎng)的花生過(guò)敏原性序列時(shí)，優(yōu)選地將所述全長(zhǎng)花生過(guò)敏原蛋白的一個(gè)或多個(gè)表位提供在所述過(guò)敏原性蛋白內(nèi)它們的天然位置的背景中。所述花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域可以包括兩種或更多種過(guò)敏原，其各自含有一個(gè)或多個(gè)過(guò)敏原性表位。在其他實(shí)施方式中，所述編碼花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域的序列包含編碼三種花生過(guò)敏原的序列。已知某些過(guò)敏原性蛋白含有兩個(gè)或更多個(gè)表位。在某些實(shí)施方式中，所述編碼花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域的序列包含花生過(guò)敏原性蛋白的整個(gè)過(guò)敏原性編碼區(qū)(即缺少信號(hào)序列的編碼區(qū))或其顯著部分。一些花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域包括處于其天然存在的關(guān)系的兩個(gè)或更多個(gè)表位。或者，可以將兩個(gè)或更多個(gè)已知的花生過(guò)敏原性表位融合在一個(gè)編碼區(qū)中。同樣地，在示例性實(shí)施方式中，在所述花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域中存在兩種或更多種花生過(guò)敏原性蛋白或其過(guò)敏原性區(qū)域。在將兩個(gè)或更多個(gè)表位工程化以存在于單一表位結(jié)構(gòu)域中的情況下，所述表位可以來(lái)自于同一抗原性蛋白。在某些實(shí)施方式中，所述分離或純化的核酸分子包含的核酸序列包含編碼兩個(gè)或更多個(gè)花生過(guò)敏原性表位的核酸序列。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述編碼花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域的核酸序列包含編碼兩種或更多種花生過(guò)敏原的核酸序列。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述編碼花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域的核酸序列包含編碼三種花生過(guò)敏原的核酸序列。在某些實(shí)施方式中，所述至少一種花生過(guò)敏原是Ara H1、Ara H2、Ara H3、AraH3del、其具有至少一個(gè)花生過(guò)敏原性表位的部分，或其任何組合。

在某些實(shí)施方式中，編碼所述至少一個(gè)花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域的核酸序列包含與SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：18的第1147-2943位核苷酸、SEQ ID NO 19的第1147-1600位核苷酸、SEQ ID NO：20的第1147-2623位核苷酸、SEQ ID NO：21的第1147-2949位核苷酸、SEQ ID NO：21的第2962-3414位核苷酸和/或SEQ ID NO：21的第3427-4902位核苷酸具有至少約80％同一性、至少約81％同一性、至少約82％同一性、至少約83％同一性、至少約84％同一性、至少約85％同一性、至少約86％同一性、至少約87％同一性、至少約88％同一性、至少約89％同一性、至少約90％同一性、至少約91％同一性、至少約92％同一性、至少約93％同一性、至少約94％同一性、至少約95％同一性、至少約96％同一性、至少約97％同一性、至少約98％同一性、至少約99％同一性或100％同一性的核苷酸序列。在某些實(shí)施方式中，所述Ara H花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域包含與SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：1的第383至983位氨基酸、SEQ ID NO：1的第988至1138位氨基酸、SEQ ID NO：1的第1143至1634位氨基酸和/或SEQ ID NO：1的第383至1634位氨基酸具有至少約80％同一性、至少約81％同一性、至少約82％同一性、至少約83％同一性、至少約84％同一性、至少約85％同一性、至少約86％同一性、至少約87％同一性、至少約88％同一性、至少約89％同一性、至少約90％同一性、至少約91％同一性、至少約92％同一性、至少約93％同一性、至少約94％同一性、至少約95％同一性、至少約96％同一性、至少約97％同一性、至少約98％同一性、至少約99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。

在某些實(shí)施方式中，所述花生過(guò)敏原性表位或花生過(guò)敏原被連接序列分隔開(kāi)。例如，所述連接序列可以包含氨基酸序列GGGG或GGGGS。

本文中提供的分離或純化的核酸分子還包含跨膜結(jié)構(gòu)域。跨膜結(jié)構(gòu)域是部分存在于生物膜兩側(cè)上的已被良好表征的蛋白質(zhì)的物理和功能元件。一般來(lái)說(shuō)，跨膜結(jié)構(gòu)域是線性氨基酸序列，其在本質(zhì)上是疏水或親脂的，并且起到將蛋白質(zhì)錨定在生物膜處的作用。這些序列的長(zhǎng)度通常為20-25個(gè)殘基。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚地知道這些序列，并且可以容易地獲得或工程化適合用于本發(fā)明的跨膜序列。在某些實(shí)施方式中，所述跨膜結(jié)構(gòu)域包含LAMP例如但不限于LAMP-1、LAMP2、LAMP-3(DC-LAMP)、LIMP II或ENDOLYN的跨膜結(jié)構(gòu)域。可用于本公開(kāi)的核酸分子的編碼跨膜結(jié)構(gòu)域的示例性核苷酸序列包括但不限于與SEQ ID NO：10的第1126-1188位核苷酸、SEQ ID NO：11的第1144-1212位核苷酸、SEQ ID NO：12的第487-555位核苷酸、SEQ ID NO：13的第1300-1395位核苷酸或SEQ ID NO：29的第1141-1212位核苷酸具有至少約80％同一性、至少約81％同一性、至少約82％同一性、至少約83％同一性、至少約84％同一性、至少約85％同一性、至少約86％同一性、至少約87％同一性、至少約88％同一性、至少約89％同一性、至少約90％同一性、至少約91％同一性、至少約92％同一性、至少約93％同一性、至少約94％同一性、至少約95％同一性、至少約96％同一性、至少約97％同一性、至少約98％同一性、至少約99％同一性或100％同一性的任何序列。示例性的LAMP跨膜結(jié)構(gòu)域包括與SEQ ID NO：23的第376-396位氨基酸、SEQ ID NO：22的第382-404位氨基酸、SEQ ID NO：24的第434-466位氨基酸、SEQ ID NO：25的第163-185位氨基酸或SEQ ID NO：30的第381-404位氨基酸具有至少約80％同一性、至少約81％同一性、至少約82％同一性、至少約83％同一性、至少約84％同一性、至少約85％同一性、至少約86％同一性、至少約87％同一性、至少約88％同一性、至少約89％同一性、至少約90％同一性、至少約91％同一性、至少約92％同一性、至少約93％同一性、至少約94％同一性、至少約95％同一性、至少約96％同一性、至少約97％同一性、至少約98％同一性、至少約99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。

所述核酸分子還包含編碼內(nèi)吞體/溶酶體靶向結(jié)構(gòu)域的核酸序列。在某些實(shí)施方式中，所述內(nèi)吞體/溶酶體靶向結(jié)構(gòu)域可以是羧基端細(xì)胞質(zhì)尾部中的酪氨酸識(shí)別序列(信號(hào))(其中Y是酪氨酸殘基，X可以是任何氨基酸，并且是大的疏水性殘基)。在某些實(shí)施方式中，所述酪氨酸識(shí)別序列(信號(hào))包含氨基酸序列YQTI、YQRI、YEQF或YHTL。所述編碼內(nèi)吞體/溶酶體靶向結(jié)構(gòu)域的核酸序列可以包含SEQ ID NO：21的第5005-5016位核苷酸、SEQ ID NO：10的第1213-1224位核苷酸、SEQ ID NO：11的第1237-1248位核苷酸或SEQ ID NO：12的第580-591位核苷酸。在某些實(shí)施方式中，所述編碼內(nèi)吞體/溶酶體靶向結(jié)構(gòu)域的核酸序列可以包含SEQ ID NO：13的第1420-1431位核苷酸。

在某些實(shí)施方式中，本公開(kāi)的核酸分子包含與SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：27具有至少約80％同一性、至少約81％同一性、至少約82％同一性、至少約83％同一性、至少約84％同一性、至少約85％同一性、至少約86％同一性、至少約87％同一性、至少約88％同一性、至少約89％同一性、至少約90％同一性、至少約91％同一性、至少約92％同一性、至少約93％同一性、至少約94％同一性、至少約95％同一性、至少約96％同一性、至少約97％同一性、至少約98％同一性、至少約99％同一性或100％同一性的核苷酸序列。本文中提供的本公開(kāi)的核酸分子可以包含與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：28具有至少約80％同一性、至少約81％同一性、至少約82％同一性、至少約83％同一性、至少約84％同一性、至少約85％同一性、至少約86％同一性、至少約87％同一性、至少約88％同一性、至少約89％同一性、至少約90％同一性、至少約91％同一性、至少約92％同一性、至少約93％同一性、至少約94％同一性、至少約95％同一性、至少約96％同一性、至少約97％同一性、至少約98％同一性、至少約99％同一性或100％同一性的氨基酸序列的編碼核酸序列。

本公開(kāi)的核酸分子可以包含脫氧核糖核酸(DNA)。

在某些實(shí)施方式中，所述分離或純化的核酸出現(xiàn)在單個(gè)嵌合或工程化的核酸上，所述分離或純化的核酸按順序排列包含：編碼信號(hào)序列的序列；編碼細(xì)胞器內(nèi)穩(wěn)定化/運(yùn)輸結(jié)構(gòu)域的序列；編碼花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域的序列，所述花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域可以包含單一花生過(guò)敏原或兩種或更多種花生過(guò)敏原，每種過(guò)敏原包含一個(gè)或多個(gè)花生過(guò)敏原性表位，并且其中所述至少一種花生過(guò)敏原不包括所述花生過(guò)敏原的天然存在的信號(hào)序列；編碼跨膜結(jié)構(gòu)域的序列；和編碼內(nèi)吞體/溶酶體靶向結(jié)構(gòu)域的序列。編碼本公開(kāi)的分離或純化的核酸的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域的序列，可以使用本領(lǐng)域中已知并廣泛使用的技術(shù)以任何順序組合。在某些實(shí)施方式中，將所述結(jié)構(gòu)域組合并排列以使它們包含編碼嵌合蛋白的單一開(kāi)放閱讀框，所述開(kāi)放閱讀框可操作地連接到足以用于所述嵌合蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)錄元件。因此，所述核酸可以包括表達(dá)載體例如質(zhì)粒、噬粒、病毒載體等。優(yōu)選地，所述核酸包含適用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如人類(lèi)細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄元件。

在某些實(shí)施方式中，本公開(kāi)將花生過(guò)敏原例如Ara H1、Ara H2、Ara H3和/或AraH3del提供在一個(gè)質(zhì)粒內(nèi)。作為代表性實(shí)例，本文公開(kāi)的單個(gè)多價(jià)Ara H1/H2/H3LAMP質(zhì)粒將主要的花生過(guò)敏原Ara H1、Ara H2和Ara H3包含在單個(gè)質(zhì)粒中。本文中還提供了單個(gè)多價(jià)AraH1/H2/H3del LAMP質(zhì)粒。質(zhì)粒也可以在單個(gè)質(zhì)粒中包含兩種花生過(guò)敏原例如Ara H1與Ara H2、Ara H2與Ara H3、或Ara H1與Ara H3的組合。

在某些實(shí)施方式中，本公開(kāi)提供了花生過(guò)敏原例如Ara H1、Ara H2、AraH3和/或Ara H3del，其各自在自身的質(zhì)粒上。作為代表性實(shí)例，ARA-LAMP vax組合物包含由分開(kāi)的質(zhì)粒編碼的主要花生過(guò)敏原Ara H1、Ara H2和Ara H3del。本文中還提供了包含由分開(kāi)的質(zhì)粒編碼的Ara H1、Ara H2和Ara H3的組合物。在這些情況下，組合物包含至少兩種DNA疫苗的混合物，其中每種疫苗包含一種花生過(guò)敏原的序列。所述疫苗構(gòu)建物可以以1:1、1:2、1:3、1:4、依次直至1:10(例如1:5、1:6、1:7、1:8和1:9)的比率混合在一起。優(yōu)選的比率是1:1。

在某些實(shí)施方式中，本公開(kāi)的核酸是在宿主中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的DNA疫苗。在某些實(shí)施方式中，所述DNA疫苗包含前面描述的分離或純化的核酸，所述核酸按順序排列包含：編碼信號(hào)序列的序列；編碼細(xì)胞器內(nèi)穩(wěn)定化/運(yùn)輸結(jié)構(gòu)域的序列；編碼花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域的序列，所述花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域可以包含單一花生過(guò)敏原或兩種或更多種花生過(guò)敏原，每種過(guò)敏原包含一個(gè)或多個(gè)花生過(guò)敏原性表位，并且其中所述至少一種花生過(guò)敏原不包括所述花生過(guò)敏原的天然存在的信號(hào)序列；編碼跨膜結(jié)構(gòu)域的序列；和編碼內(nèi)吞體/溶酶體靶向結(jié)構(gòu)域的序列。在某些實(shí)施方式中，所述DNA疫苗包含至少兩種分離或純化的核酸，所述核酸按順序排列包含：編碼信號(hào)序列的序列；編碼細(xì)胞器內(nèi)穩(wěn)定化/運(yùn)輸結(jié)構(gòu)域的序列；編碼花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域的序列，所述花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域可以包含單一花生過(guò)敏原或兩種或更多種花生過(guò)敏原，每種過(guò)敏原包含一個(gè)或多個(gè)花生過(guò)敏原性表位，并且其中所述至少一種花生過(guò)敏原不包括所述花生過(guò)敏原的天然存在的信號(hào)序列；編碼跨膜結(jié)構(gòu)域的序列；和編碼內(nèi)吞體/溶酶體靶向結(jié)構(gòu)域的序列。在某些實(shí)施方式中，所述DNA疫苗包含至少三種分離或純化的核酸，所述核酸按順序排列包含：編碼信號(hào)序列的序列；編碼細(xì)胞器內(nèi)穩(wěn)定化/運(yùn)輸結(jié)構(gòu)域的序列；編碼花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域的序列，所述花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域可以包含單一花生過(guò)敏原或兩種或更多種花生過(guò)敏原，每種過(guò)敏原包含一個(gè)或多個(gè)花生過(guò)敏原性表位，并且其中所述至少一種花生過(guò)敏原不包括所述花生過(guò)敏原的天然存在的信號(hào)序列；編碼跨膜結(jié)構(gòu)域的序列；和編碼內(nèi)吞體/溶酶體靶向結(jié)構(gòu)域的序列。

還提供了表達(dá)本文中提供的核酸或載體的宿主細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，所述宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，優(yōu)選為人類(lèi)細(xì)胞。

本文中還提供了多肽，所述多肽包含：信號(hào)序列；細(xì)胞器內(nèi)穩(wěn)定化/運(yùn)輸結(jié)構(gòu)域；花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域，其可以包含單一花生過(guò)敏原或兩種或更多種花生過(guò)敏原，每種過(guò)敏原包含一個(gè)或多個(gè)花生過(guò)敏原性表位，并且其中所述至少一種花生過(guò)敏原不包括所述花生過(guò)敏原的天然存在的信號(hào)序列；跨膜結(jié)構(gòu)域；和內(nèi)吞體/溶酶體靶向結(jié)構(gòu)域。

在本文提供的多肽的某些實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列包含LAMP的信號(hào)序列。在某些實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)易位序列。示例性的LAMP信號(hào)序列包括但不限于LAMP-1、LAMP2、LAMP-3(DC-LAMP)、LIMP II或ENDOLYN的信號(hào)序列。示例性的LAMP信號(hào)序列包括的肽包含與SEQ ID NO：1的第1-27位氨基酸、SEQ ID NO：22的第1-27位氨基酸、SEQ ID NO：23的第1-28位氨基酸、SEQ ID NO：24的第5-27位氨基酸和SEQ ID NO：25的第1-24位氨基酸具有至少約80％同一性、至少約81％同一性、至少約82％同一性、至少約83％同一性、至少約84％同一性、至少約85％同一性、至少約86％同一性、至少約87％同一性、至少約88％同一性、至少約89％同一性、至少約90％同一性、至少約91％同一性、至少約92％同一性、至少約93％同一性、至少約94％同一性、至少約95％同一性、至少約96％同一性、至少約97％同一性、至少約98％同一性、至少約99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。

所述多肽還包含細(xì)胞器內(nèi)穩(wěn)定化/運(yùn)輸結(jié)構(gòu)域。例如，所述細(xì)胞器內(nèi)穩(wěn)定化/運(yùn)輸結(jié)構(gòu)域可以包含LAMP的腔內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞器內(nèi)穩(wěn)定化/運(yùn)輸結(jié)構(gòu)域包含LAMP1、LAMP2、LAMP-3(DC-LAMP)、LIMP II或ENDOLYN的腔內(nèi)結(jié)構(gòu)域。示例性的細(xì)胞器內(nèi)穩(wěn)定化/運(yùn)輸結(jié)構(gòu)域包括但不限于與SEQ ID NO：1的第28至380位氨基酸、SEQ ID NO：22的第28-381位氨基酸、SEQ ID NO：23的第29-375位氨基酸、SEQ ID NO：24的第28-433位氨基酸或SEQ ID NO：25的第25-162位氨基酸具有至少約80％同一性、至少約81％同一性、至少約82％同一性、至少約83％同一性、至少約84％同一性、至少約85％同一性、至少約86％同一性、至少約87％同一性、至少約88％同一性、至少約89％同一性、至少約90％同一性、至少約91％同一性、至少約92％同一性、至少約93％同一性、至少約94％同一性、至少約95％同一性、至少約96％同一性、至少約97％同一性、至少約98％同一性、至少約99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。

本文中描述的多肽還包含花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域。所述花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域包含一種或多種花生過(guò)敏原蛋白、多肽或肽，其包含一個(gè)或多個(gè)過(guò)敏原性表位。所述花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地不包括來(lái)自于所述花生過(guò)敏原的天然存在的信號(hào)序列。當(dāng)使用小于全長(zhǎng)的花生過(guò)敏原性序列時(shí)，優(yōu)選地將所述全長(zhǎng)花生過(guò)敏原蛋白的一個(gè)或多個(gè)表位提供在所述過(guò)敏原性蛋白內(nèi)它們的天然位置的背景中。所述花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域可以包括兩種或更多種過(guò)敏原，其各自含有一個(gè)或多個(gè)過(guò)敏原性表位。在其他實(shí)施方式中，所述花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域包含三種花生過(guò)敏原。已知某些過(guò)敏原性蛋白含有兩個(gè)或更多個(gè)表位。一些花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域包括處于其天然存在的關(guān)系的兩個(gè)或更多個(gè)表位。在將兩個(gè)或更多個(gè)表位工程化以存在于單一表位結(jié)構(gòu)域中的情況下，所述表位可以來(lái)自于同一抗原性蛋白。在某些實(shí)施方式中，所述至少一種花生過(guò)敏原是Ara H1、Ara H2、Ara H3、AraH3del、其具有至少一個(gè)花生過(guò)敏原性表位的部分，或其任何組合。

在某些實(shí)施方式中，所述Ara H花生過(guò)敏原結(jié)構(gòu)域包含與SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：1的第383至983位氨基酸、SEQ ID NO：1的第988至1138位氨基酸、SEQ ID NO：1的第1143至1634位氨基酸和/或SEQ ID NO：1的第383至1634位氨基酸具有至少約80％同一性、至少約81％同一性、至少約82％同一性、至少約83％同一性、至少約84％同一性、至少約85％同一性、至少約86％同一性、至少約87％同一性、至少約88％同一性、至少約89％同一性、至少約90％同一性、至少約91％同一性、至少約92％同一性、至少約93％同一性、至少約94％同一性、至少約95％同一性、至少約96％同一性、至少約97％同一性、至少約98％同一性、至少約99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。

在某些實(shí)施方式中，所述花生過(guò)敏原性表位或花生過(guò)敏原被連接序列分隔開(kāi)。例如，所述連接序列可以包含氨基酸序列GGGG或GGGGS。

本文中提供的多肽還包含跨膜結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方式中，所述跨膜結(jié)構(gòu)域包含LAMP例如但不限于LAMP-1、LAMP2、LAMP-3(DC-LAMP)、LIMP II或ENDOLYN的跨膜結(jié)構(gòu)域。示例性的LAMP跨膜結(jié)構(gòu)域包括與SEQ ID NO：1的第1637至1660位氨基酸、SEQ ID NO：23的第376-396位氨基酸、SEQ ID NO：22的第382-404位氨基酸、SEQ ID NO：24的第434-466位氨基酸、SEQ ID NO：25的第163-185位氨基酸或SEQ ID NO：30的第381-404位氨基酸具有至少約80％同一性、至少約81％同一性、至少約82％同一性、至少約83％同一性、至少約84％同一性、至少約85％同一性、至少約86％同一性、至少約87％同一性、至少約88％同一性、至少約89％同一性、至少約90％同一性、至少約91％同一性、至少約92％同一性、至少約93％同一性、至少約94％同一性、至少約95％同一性、至少約96％同一性、至少約97％同一性、至少約98％同一性、至少約99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。

所描述的多肽還包含內(nèi)吞體/溶酶體靶向結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方式中，所述內(nèi)吞體/溶酶體靶向結(jié)構(gòu)域可以在羧基端細(xì)胞質(zhì)尾部中包含酪氨酸識(shí)別序列(信號(hào))(其中Y是酪氨酸殘基，X可以是任何氨基酸，并且是大的疏水殘基)。在某些實(shí)施方式中，所述酪氨酸識(shí)別序列(信號(hào))包含氨基酸序列YQTI、YQRI、YEQF或YHTL。在某些實(shí)施方式中，所述內(nèi)吞體/溶酶體靶向結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列LIRT。

在某些實(shí)施方式中，所描述的多肽包含與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：28具有至少約80％同一性、至少約81％同一性、至少約82％同一性、至少約83％同一性、至少約84％同一性、至少約85％同一性、至少約86％同一性、至少約87％同一性、至少約88％同一性、至少約89％同一性、至少約90％同一性、至少約91％同一性、至少約92％同一性、至少約93％同一性、至少約94％同一性、至少約95％同一性、至少約96％同一性、至少約97％同一性、至少約98％同一性、至少約99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。

在某些實(shí)施方式中提供了包含至少一種本公開(kāi)的核酸分子的藥物組合物。還提供了包含至少一種本公開(kāi)的載體的藥物組合物。在某些實(shí)施方式中，所述藥物組合物可以包含含有編碼SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：28的核酸的載體。例如，所述核酸可以由SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：18編碼。在某些實(shí)施方式中提供了包含至少兩種本公開(kāi)的核酸分子或載體的藥物組合物。在其他實(shí)施方式中提供了包含至少三種本公開(kāi)的核酸分子或載體的藥物組合物。例如，所述至少三種本公開(kāi)的核酸分子可以包含編碼SEQ ID NO：6的核酸分子、編碼SEQ ID NO：7的核酸分子和編碼SEQ ID NO：8的核酸分子。示例性的核酸序列包括SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：18。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述藥物組合物包含至少兩種載體，其各自包含本公開(kāi)的核酸分子。本文中還提供了包含第一、第二和第三載體的藥物組合物，其中所述第一載體包含編碼SEQ ID NO：6的核酸分子，第二載體包含編碼SEQ ID NO：7的核酸分子，第三載體包含編碼SEQ ID NO：8的核酸分子。示例性的核酸序列包括SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：18。

在某些實(shí)施方式中，本公開(kāi)的藥物組合物還包含可藥用載體。本公開(kāi)的核酸或載體可以作為純化或分離的分子提供。所述核酸或載體也可以被提供為組合物的一部分。所述組合物可以基本上由所述核酸或載體構(gòu)成，意味著所述核酸或載體是所述組合物中適合于編碼序列表達(dá)的僅有的核酸或載體?；蛘撸鼋M合物可以包含本文中所公開(kāi)的核酸或載體。在示例性實(shí)施方式中，所述組合物是藥物組合物，其包含本文中所公開(kāi)的核酸或載體以及一種或多種可藥用物質(zhì)或載體例如鹽水。在某些實(shí)施方式中，所述組合物包含促進(jìn)核酸被細(xì)胞攝入的物質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，所述組合物包含有助于將核酸遞送到特定細(xì)胞類(lèi)型例如免疫細(xì)胞(例如APC或抗原呈遞細(xì)胞)的靶向分子。在其他實(shí)施方式中，所述核酸是用于將核酸遞送到細(xì)胞或組織的遞送介質(zhì)或遞送載體的一部分。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本公開(kāi)的配方包含在例如鹽水中的裸露DNA。在其他優(yōu)選實(shí)施方式中，所述DNA疫苗通過(guò)肌內(nèi)(IM)或真皮內(nèi)(ID)注射來(lái)遞送。

本公開(kāi)還提供了使用本公開(kāi)的核酸分子、載體和藥物組合物的方法。在某些實(shí)施方式中，本公開(kāi)提供了在需要的受試者中預(yù)防或治療花生過(guò)敏反應(yīng)的方法，所述方法包括向所述受試者給藥治療有效量的本公開(kāi)的核酸分子、載體或藥物組合物。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物以足以減少I(mǎi)gE應(yīng)答的產(chǎn)生的量給藥。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物以足以降低血漿組氨酸水平的量給藥。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物以足以減少I(mǎi)L-4的生產(chǎn)的量給藥。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物以足以提高IFN-γ水平的量給藥。在某些實(shí)施方式中，所述方法減輕、消除或阻止至少一種臨床過(guò)敏癥狀。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物通過(guò)肌內(nèi)(IM)注射給藥到所述受試者。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物通過(guò)真皮內(nèi)(ID)注射給藥到所述受試者。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物以足以誘導(dǎo)或增加過(guò)敏原特異性IgG應(yīng)答的產(chǎn)生的量給藥。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物以足以減弱IgE應(yīng)答的量給藥。在某些實(shí)施方式中，所述受試者是人類(lèi)。

在某些實(shí)施方式中，本公開(kāi)提供了一種在需要的受試者中預(yù)防或治療花生過(guò)敏反應(yīng)的方法，所述方法包括向所述受試者給藥治療有效量的本公開(kāi)的核酸分子、載體或藥物組合物，其中所述受試者在所述給藥之前暴露于花生過(guò)敏原。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物以足以減少I(mǎi)gE應(yīng)答的產(chǎn)生的量給藥。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物以足以降低血漿組氨酸水平的量給藥。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物以足以減少I(mǎi)L-4的生產(chǎn)的量給藥。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物以足以提高IFN-γ水平的量給藥。在某些實(shí)施方式中，所述方法減輕、消除或阻止至少一種臨床過(guò)敏癥狀。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物通過(guò)肌內(nèi)(IM)注射給藥到所述受試者。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物通過(guò)真皮內(nèi)(ID)注射給藥到所述受試者。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物以足以誘導(dǎo)或增加過(guò)敏原特異性IgG應(yīng)答的產(chǎn)生的量給藥。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物以足以減弱IgE應(yīng)答的量給藥。在某些實(shí)施方式中，所述受試者是人類(lèi)。

在某些實(shí)施方式中，本公開(kāi)提供了一種在需要的受試者中預(yù)防或治療花生過(guò)敏反應(yīng)的方法，所述方法包括向所述受試者給藥治療有效量的本公開(kāi)的核酸分子、載體或藥物組合物，其中所述受試者是人類(lèi)。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物以足以減少I(mǎi)gE應(yīng)答的產(chǎn)生的量給藥。在其他實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物以足以降低血漿組氨酸水平的量給藥。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物以足以減少I(mǎi)L-4的生產(chǎn)的量給藥。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物以足以提高IFN-γ水平的量給藥。在某些實(shí)施方式中，所述方法減輕、消除或阻止至少一種臨床過(guò)敏癥狀。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物通過(guò)肌內(nèi)(IM)注射給藥到所述受試者。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物通過(guò)真皮內(nèi)(ID)注射給藥到所述受試者。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物以足以誘導(dǎo)或提高過(guò)敏原特異性IgG應(yīng)答的生產(chǎn)的量給藥。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物以足以減弱IgE應(yīng)答的量給藥。在某些實(shí)施方式中，所述受試者是人類(lèi)。

在某些實(shí)施方式中，本公開(kāi)提供了一種在需要的受試者中預(yù)防或治療花生過(guò)敏反應(yīng)的方法，所述方法包括向所述受試者給藥治療有效量的本公開(kāi)的核酸分子、載體或藥物組合物，其中所述受試者在所述給藥之前暴露于花生過(guò)敏原，其中所述受試者是人類(lèi)。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物以足以減少I(mǎi)gE應(yīng)答的產(chǎn)生的量給藥。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物以足以降低血漿組氨酸水平的量給藥。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物以足以減少I(mǎi)L-4的生產(chǎn)的量給藥。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物以足以提高IFN-γ水平的量給藥。在某些實(shí)施方式中，所述方法減輕、消除或阻止至少一種臨床過(guò)敏癥狀。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物通過(guò)肌內(nèi)(IM)注射給藥到所述受試者。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物通過(guò)真皮內(nèi)(ID)注射給藥到所述受試者。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物以足以誘導(dǎo)或提高過(guò)敏原特異性IgG應(yīng)答的生產(chǎn)的量給藥。在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子、載體或藥物組合物以足以減弱IgE應(yīng)答的量給藥。在某些實(shí)施方式中，所述受試者是人類(lèi)。

在其他實(shí)施方式中，所述方法包括以足以誘導(dǎo)或提高過(guò)敏原特異性IgG應(yīng)答的生產(chǎn)的量向所述受試者給藥本公開(kāi)的核酸、載體、藥物組合物或DNA疫苗。在其他實(shí)施方式中，所述方法預(yù)防花生過(guò)敏反應(yīng)。在其他實(shí)施方式中，所述方法減輕、消除或阻止至少一種臨床過(guò)敏癥狀。在其他實(shí)施方式中，將所述DNA疫苗預(yù)防性給藥到所述受試者以防止花生過(guò)敏反應(yīng)。在其他實(shí)施方式中，將所述DNA疫苗治療性給藥到所述受試者以治療花生過(guò)敏反應(yīng)。

本公開(kāi)還提供了使用本公開(kāi)的疫苗治療需要的受試者的方法。在某些實(shí)施方式中，所述方法是預(yù)防性治療或治療性治療具有發(fā)生對(duì)一種或多種花生過(guò)敏原的過(guò)敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)的受試者或患有所述過(guò)敏反應(yīng)的受試者的方法。在其他實(shí)施方式中，所述方法包括以足以引起符合本發(fā)明的DNA疫苗被APC攝入和表達(dá)的量向所述受試者給藥所述DNA疫苗。不將本發(fā)明限制到特定作用機(jī)制，所述DNA疫苗的表達(dá)引起編碼的過(guò)敏原性表位在APC上的呈遞和IgG免疫應(yīng)答的發(fā)生。

在本發(fā)明的特定情況下，將編碼SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：28的核酸序列、這些序列中的至少一者的一部分和/或另一種花生過(guò)敏原編碼序列給藥到細(xì)胞。在本發(fā)明的另一種特定情況下，將存在于分開(kāi)的DNA構(gòu)建物上的至少兩種花生過(guò)敏原組合給藥到細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞例如樹(shù)突狀細(xì)胞。優(yōu)選地，所述樹(shù)突狀細(xì)胞是人類(lèi)樹(shù)突狀細(xì)胞。本發(fā)明可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知是用于核酸疫苗的有效遞送方法的方法，包括肌內(nèi)注射、真皮內(nèi)注射、皮下注射、電穿孔、基因槍疫苗接種或脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移來(lái)給藥。

本發(fā)明提供了當(dāng)給藥到細(xì)胞時(shí)引起特定抗體應(yīng)答提高的配方。對(duì)花生過(guò)敏原的抗體應(yīng)答的提高對(duì)治療IgE介導(dǎo)的過(guò)敏疾病有用。IgE具有與其細(xì)胞限制和結(jié)合同源過(guò)敏原后得到的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的某些性質(zhì)。當(dāng)B細(xì)胞接受由Th2細(xì)胞分泌的IL-4時(shí)，產(chǎn)生針對(duì)花生過(guò)敏原的IgE。這幫助指導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生IgE類(lèi)抗體。在被B細(xì)胞分泌后，IgE結(jié)合到它的由肥大細(xì)胞和嗜曙紅細(xì)胞表達(dá)的高親和性受體Fc-eRI，導(dǎo)致這些細(xì)胞和所述動(dòng)物變得對(duì)將來(lái)的過(guò)敏原暴露敏感。因此，在攝入、吸入花生過(guò)敏原或與花生過(guò)敏原粘膜接觸后，可以引發(fā)過(guò)敏的癥狀。由于抗體的結(jié)合性質(zhì)，已提出減輕花生過(guò)敏癥狀的一種方式是通過(guò)與其他抗體類(lèi)別的競(jìng)爭(zhēng)來(lái)螯合可用于被IgE結(jié)合的游離過(guò)敏原。具體來(lái)說(shuō)，已提出增加IgG的過(guò)敏配方是減輕過(guò)敏疾病的途徑。本文描述的發(fā)明引起IgG生產(chǎn)增加，由此以臨床上顯著的方式造成IgE與IgG比率的降低。

實(shí)施例

現(xiàn)在將參考本發(fā)明的示例性實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述。下面的實(shí)施例旨在給讀者提供對(duì)本發(fā)明構(gòu)建物的構(gòu)建和活性的更好的理解，并且不應(yīng)被解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。

實(shí)施例1：通用材料和方法

將編碼花生過(guò)敏原Ara H1、Ara H2和Ara H3的遺傳序列作為本源序列(對(duì)照質(zhì)粒)和作為與人類(lèi)LAMP-1的嵌合體(實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒)制備，其中所述每個(gè)序列被插入在LAMP的腔內(nèi)結(jié)構(gòu)域與跨膜結(jié)構(gòu)域之間。以前的研究顯示，抗原性序列必須被優(yōu)化成用于人類(lèi)使用，因此將所有非必需或有害的元件(隱蔽剪接位點(diǎn)、二級(jí)RNA/DNA結(jié)構(gòu)、二級(jí)ORF)去除，以便最大化RNA穩(wěn)定性和蛋白表達(dá)。AraH1-LAMP包含SEQ ID NO：15。AraH2-LAMP包含SEQ ID NO：12。最終優(yōu)化的序列被化學(xué)合成并插入到無(wú)抗生素的pDNA-VACC-ultra載體(Nature Pharmaceuticals,Lincoln,NE)的LAMP開(kāi)放閱讀框(ORF)中。通過(guò)轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞并隨后進(jìn)行Western印跡分析，確定每個(gè)質(zhì)粒的嵌合蛋白表達(dá)。向溶酶體的細(xì)胞運(yùn)輸通過(guò)共聚焦顯微術(shù)并通過(guò)對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行免疫印跡分析來(lái)確認(rèn)。

使用GeneArt/Invitrogen在線基因設(shè)計(jì)軟件，對(duì)AraH3del基因進(jìn)行用于人類(lèi)使用的密碼子優(yōu)化。合成的基因由GeneArt/Invitrogen(Life Technologies,Grand Island,NY)制造。將所述合成的基因插入到N LAMP-C LAMP基因中，以產(chǎn)生N LAMP-AraH3del-C LAMP(SEQ ID NO：27)，然后將其插入到表達(dá)載體中。在本源AraH3蛋白被蛋白水解加工成酸性和堿性亞基的基礎(chǔ)上產(chǎn)生所述缺失。所述酸性亞基作為單一質(zhì)粒被產(chǎn)生并使用。

通過(guò)合成插入到LAMP-vax免疫接種載體中的編碼每種顯性花生過(guò)敏原(Ara H1、Ara H2、Ara H3)的DNA來(lái)制備單一多價(jià)構(gòu)建物(包含SEQ ID NO：21的AraH1/H2/H3-LAMP)(圖2和3)。在該單一多價(jià)花生構(gòu)建物中，將5個(gè)氨基酸的連接序列(GGGGS)插入到Ara H1與Ara H2之間和Ara H2與Ara H3之間。Western印跡分析顯示出花生過(guò)敏原Ara H1、H2和H3從Ara-LAMP-vax單一多價(jià)構(gòu)建物共表達(dá)(圖4)。ARA-LAMP vax組合物包含三個(gè)質(zhì)粒，其各自在pDNAVACC-ultra載體(Nature Technology Corp.,Lincoln,NE)中的LAMP的腔內(nèi)結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域內(nèi)包含插入到LAMP-vax免疫接種載體中的編碼單一花生過(guò)敏原(Ara H1、H2或H3del)的DNA(即SEQ ID NO：18、19和20)。Ara-LAMP-vax在本文中也被稱為Ara-H-LAMP。已確定，每個(gè)質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)嵌合的Ara/LAMP蛋白，并且小鼠作為治療的結(jié)果產(chǎn)生過(guò)敏原特異性抗體。每個(gè)載體的表達(dá)在單個(gè)和組合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中進(jìn)行評(píng)估。

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物福利辦公室動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)(animal ethics committee of the Office of Laboratory Animal Welfare(OLAW))批準(zhǔn)的設(shè)施來(lái)進(jìn)行。將BALB/c小鼠用Ara-LAMP-vax單一多價(jià)構(gòu)建物或Ara-LAMP-vax三質(zhì)粒組合物，通過(guò)肌內(nèi)(IM)或真皮內(nèi)(ID)注射進(jìn)行免疫接種，并對(duì)免疫應(yīng)答進(jìn)行表征。對(duì)照小鼠用相同濃度下的空白載體(即不含Ara-LAMP構(gòu)建物的pDNAVACC-ultra載體；“對(duì)照載體”)進(jìn)行免疫接種。在抗原激惹的前一天，按照以前的描述準(zhǔn)備用于被動(dòng)皮膚過(guò)敏性反應(yīng)(PCA)試驗(yàn)的小鼠(Saloga等，(1993)J.Clin.Invest.91(1):133-40；Li等，(1999)J.Immunol.162:5624-5630)。

為了確定治療效能，使未接觸過(guò)抗原的小鼠對(duì)花生致敏，然后在兩周后用Ara-LAMP-vax配方(每只動(dòng)物50μg單一多價(jià)Ara-LAMP-vax質(zhì)粒/200μL PBS或每只動(dòng)物AraH1-LAMP-vax質(zhì)粒、AraH2-LAMP-vax質(zhì)粒和AraH3-LAMP-vax質(zhì)粒各50μg/200μL PBS)以兩周的間隔免疫接種三次。在免疫接種后，通過(guò)使用球形末端小鼠進(jìn)樣針每周一次共8周給藥10mg花生醬(PN)和20μg霍亂毒素(CT)來(lái)實(shí)驗(yàn)性誘導(dǎo)食物過(guò)敏，對(duì)小鼠進(jìn)行激惹，并對(duì)過(guò)敏癥狀進(jìn)行評(píng)分。

為了確定預(yù)防效率，在第0天、第14天和第28天將未接觸過(guò)花生的BALB/c小鼠用Ara-LAMP-vax(每只動(dòng)物50μg單一多價(jià)Ara-LAMP-vax質(zhì)粒/200μL PBS或每只動(dòng)物AraH1-LAMP-vax質(zhì)粒、AraH2-LAMP-vax質(zhì)粒和AraH3-LAMP-vax質(zhì)粒各50μg/200μL PBS的配方)免疫接種三次，然后用花生提取物和霍亂毒素致敏(圖7)。在每個(gè)疫苗接種日期并隨后每周一次收集血清樣品，直至第42天。

在抗原激惹后，由不知情的獨(dú)立調(diào)查人員按照0-5的量表對(duì)過(guò)敏癥狀進(jìn)行評(píng)分，其中0表示沒(méi)有癥狀，5表示死亡(Li等，(2001)J.Allergy Clin.Immunol.108:639-646)。為了確定組胺水平，在激惹后30-40分鐘收集血清并進(jìn)行測(cè)定。使用光學(xué)顯微鏡對(duì)耳樣品進(jìn)行組織學(xué)研究，以確定作為系統(tǒng)性過(guò)敏性反應(yīng)結(jié)果的肥大細(xì)胞脫粒的程度。

將小鼠每周取血并將血清儲(chǔ)存在-80℃。將小鼠處死，測(cè)定由每種疫苗配方產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，并測(cè)量IgG亞型、IgE的抗體水平和細(xì)胞因子。T細(xì)胞和B-細(xì)胞的免疫學(xué)應(yīng)答利用ELISPOT、ELISA、細(xì)胞增殖測(cè)定法和細(xì)胞因子測(cè)定法來(lái)評(píng)估。為了確定任何疫苗配方是否引起過(guò)敏原泄漏，通過(guò)夾心ELISA測(cè)定血清樣品的花生過(guò)敏原。

對(duì)于細(xì)胞因子測(cè)定法來(lái)說(shuō)，通過(guò)ELISA測(cè)定上清液中IFN-γ和IL-4的存在。將匹配的抗體對(duì)用于IFN-γ和IL-4，并按照制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。使用小鼠重組IFN-γ和IL-4產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。所有抗體和細(xì)胞因子購(gòu)自Invitrogen,Carlsbad,CA。IFN-γ和IL-4測(cè)定法的檢測(cè)極限分別為20和10pg/ml。

實(shí)施例2：ARA-LAMP預(yù)防研究

在小鼠模型中試驗(yàn)包含花生過(guò)敏原Ara H1、Ara H2和/或Ara H3的DNA構(gòu)建物的預(yù)防有效性。將編碼花生過(guò)敏原Ara H1、Ara H2和Ara H3的多價(jià)LAMP質(zhì)粒(按照實(shí)施例1產(chǎn)生的AraH1/H2/H3-LAMP)與每個(gè)質(zhì)粒編碼單一花生過(guò)敏原的三質(zhì)?；旌衔?按照實(shí)施例1制備的AraH1-LAMP、AraH2-LAMP和ARAH3del-LAMP)進(jìn)行比較。將BALB/c小鼠每周一次共三周用50μg單一多價(jià)花生質(zhì)粒或50μg每種單獨(dú)質(zhì)粒通過(guò)真皮內(nèi)(ID)或肌內(nèi)(IM)注射進(jìn)行免疫接種。在最后一次免疫接種后5周，通過(guò)ELISA測(cè)定IgG1和IgG2a抗體滴度。發(fā)現(xiàn)多價(jià)質(zhì)粒具有過(guò)敏原性，但抗體應(yīng)答的量級(jí)低于在多個(gè)質(zhì)粒中的單次過(guò)敏原遞送(圖5和6)。不希望受到任一特定理論限制，據(jù)信抗原競(jìng)爭(zhēng)例如表位通往MHC-II呈遞的途徑，可能限制對(duì)所有抗原的免疫應(yīng)答。免疫接種后最強(qiáng)的應(yīng)答是使用通過(guò)真皮內(nèi)(ID)注射遞送的多個(gè)質(zhì)粒的情況。

將圖7中示出的代表性方案用于進(jìn)一步的預(yù)防研究。將小鼠在第0、7和14天用單一多價(jià)Ara H-LAMP DNA疫苗免疫接種(第-3、-2、-1周)。在免疫接種后測(cè)量IgG1和IgG2a抗體水平，并且發(fā)現(xiàn)與對(duì)照載體相比，使用單一多價(jià)疫苗時(shí)IgG2a水平明顯更高(圖8)。然后將小鼠首先在第0周用花生醬(PN)和霍亂毒素(CT)致敏三次，隨后每周一次直至第5周，然后在第6和8周進(jìn)行兩次加強(qiáng)。與對(duì)照載體相比，使用多價(jià)疫苗時(shí)第58天(第5周)的IgG2a抗體水平明顯更高(圖9)。在兩次加強(qiáng)后，與對(duì)照載體相比，使用單一多價(jià)疫苗時(shí)第92天的IgG2a抗體水平也明顯更高(圖10)。在第12周用花生醬激惹后，這種IgG2a抗體水平的顯著差異繼續(xù)存在(圖11)。在使用單一多價(jià)疫苗時(shí)，始終觀察到IgE應(yīng)答的減弱(圖12)，這支持了所述多價(jià)疫苗的預(yù)防機(jī)制。圖13和14示出了所述預(yù)防研究的概述。

有趣的是，使用單一多價(jià)質(zhì)粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)染顯示，所有Ara h過(guò)敏原都以與編碼單一過(guò)敏原的質(zhì)粒相近的量產(chǎn)生融合蛋白。因此，修改連接序列的同一性長(zhǎng)度可能提高對(duì)所有過(guò)敏原的免疫原性。這些結(jié)果說(shuō)明可以成功地設(shè)計(jì)具有出色的體外表達(dá)和廣泛的免疫原性的多價(jià)過(guò)敏質(zhì)粒。這些結(jié)果進(jìn)一步顯示，本公開(kāi)的DNA疫苗可用于預(yù)防性治療花生過(guò)敏受試者。

按照?qǐng)D15中示出的代表性方案進(jìn)行了進(jìn)一步的預(yù)防研究，以對(duì)使用Bioject ID遞送的AraH1-LAMP、AraH2-LAMP和AraH3del-LAMP質(zhì)粒的組合與單一多價(jià)AraH1/H2/H3-LAMP質(zhì)粒進(jìn)行比較。在第0、7和14天(wk-3、-2、-1)，將5周齡雌性C3H/HeJ小鼠(N＝10只小鼠/組)用Ara H1-LAMP、Ara H2-LAMP和Ara H3del-LAMP質(zhì)粒的組合(各50ug)或單一多價(jià)AraH1/H2/H3 LAMP DNA質(zhì)粒(50ug)免疫接種。然后將小鼠首先在第0周用10mg花生醬(PN)+20ug CT胃內(nèi)(i.g.)致敏三次，然后每周一次直至W5，隨后在W6和W8用50mg PN+20ug CT進(jìn)行兩次i.g.加強(qiáng)。包含接受對(duì)照載體(50ug)的小鼠作為對(duì)照。然后在W12、W16和W20用200mg PN i.g.激惹小鼠。測(cè)定免疫學(xué)應(yīng)答。

圖16中的結(jié)果顯示，AraH1-LAMP-vax、AraH2-LAMP-vax和Ara-H3del-LAMP-vax質(zhì)粒的組合和單一多價(jià)Ara H1/H2/H3-LAMP質(zhì)粒兩者，當(dāng)經(jīng)Bioject B2000無(wú)針裝置通過(guò)真皮內(nèi)注射(ID)遞送時(shí)，都誘導(dǎo)強(qiáng)烈的IgG2a應(yīng)答。然而，所述單一多價(jià)Ara H1/H2/H3 LAMP質(zhì)粒總的來(lái)說(shuō)誘導(dǎo)更強(qiáng)的抗體應(yīng)答，并且也抑制花生特異性IgE。

實(shí)施例3：ARA-LAMP治療性研究

還進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)以確定本公開(kāi)的DNA疫苗提供治療性治療的能力。代表性的方案示出在圖17中，其中將小鼠首先用花生醬和霍亂毒素致敏，然后用本公開(kāi)的ARA-LAMP-vax三質(zhì)粒(按照實(shí)施例1制備的AraH1-LAMP、AraH2-LAMP和Ara-H3del-LAMP)組合物治療。圖18示出了在使用每種質(zhì)粒編碼單一花生過(guò)敏原的三質(zhì)粒混合物ARA-LAMP-vax的疫苗治療之前的數(shù)周中的IgE抗體水平。

當(dāng)使用多價(jià)DNA疫苗時(shí)，在疫苗治療后，第15周的IgE抗體水平降低(圖19)。第15周的過(guò)敏性反應(yīng)激惹結(jié)果(癥狀分值，圖20，圖A；體溫，圖20，圖B；圖21)顯示，與對(duì)照載體相比，ARA-LAMP-vax三質(zhì)粒組合物的給藥引起嚴(yán)重性較低的癥狀和較低的血漿組胺水平。此外發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于對(duì)照載體，使用ARA-LAMP-vax三質(zhì)粒組合物給藥時(shí)促過(guò)敏細(xì)胞因子IL-4更少(圖22)，而IFN-γ的水平升高(圖23)。這些結(jié)果顯示本公開(kāi)的DNA疫苗可用于治療性治療。

參考文獻(xiàn)

在本說(shuō)明書(shū)中提到的所有出版物、專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利和其他參考文獻(xiàn)指示了本公開(kāi)的主題內(nèi)容所屬領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員的水平。所有出版物、專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利和其他參考文獻(xiàn)通過(guò)參考并入本文，其程度等同于每個(gè)單獨(dú)的出版物、專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利和其他參考文獻(xiàn)被具體且單獨(dú)地指明通過(guò)參考并入。應(yīng)該理解，盡管在本文中參考了大量專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利和其他參考文獻(xiàn)，但這種參考并不構(gòu)成對(duì)這些文獻(xiàn)中的任一者形成了本領(lǐng)域常識(shí)的一部分的承認(rèn)。

盡管出于清晰理解的目的已通過(guò)圖示和實(shí)例對(duì)上述主題內(nèi)容進(jìn)行了一定細(xì)節(jié)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，可以在隨附的權(quán)利要求書(shū)的范圍之內(nèi)實(shí)施某些改變和修改。

序列表

SEQ ID NO：1-AraH-LAMP(或AraH1-H2-H3-LAMP)

Ara HI/H2/H3多蛋白嵌合構(gòu)建物的編碼區(qū)的氨基酸序列如下：

信號(hào)：(1)..(27)

N-LAMP：(28)..(380)

AraH1：(383)..(983)

AraH2：(988)..(1138)

AraH3：(1143)..(1634)

TM/CYTO：(1637)..(1672)

SEQ ID NO：2-Ara H1

不帶信號(hào)序列的Ara H1蛋白的編碼區(qū)的氨基酸序列(在Ara H1/H2/H3多蛋白嵌合構(gòu)建物AraH-LAMP中，以及在單獨(dú)的Ara H1構(gòu)建物AraH1-LAMP中)如下：

KSSPYQKKTENPCAQRCLQSCQQEPDDLKQKACESRCTKLEYDPRCVYDPRGHTGTTNQRSPPGERTRGRQPGDYDDDRRQPRREEGGRWGPAGPREREREEDWRQPREDWRRPSHQQPRKIRPEGREGEQEWGTPGSHVREETSRNNPFYFPSRRFSTRYGNQNGRIRVLQRFDQRSRQFQNLQNHRIVQIEAKPNTLVLPKHADADNILVIQQGQATVTVANGNNRKSFNLDEGHALRIPSGFISYILNRHDNQNLRVAKISMPVNTPGQFEDFFPASSRDQSSYLQGFSRNTLEAAFNAEFNEIRRVLLEENAGGEQEERGQRRWSTRSSENNEGVIVKVSKEHVEELTKHAKSVSKKGSEEEGDITNPINLREGEPDLSNNFGKLFEVKPDKKNPQLQDLDMMLTCVEIKEGALMLPHFNSKAMVIVVVNKGTGNLELVAVRKEQQQRGRREEEEDEDEEEEGSNREVRRYTARLKEGDVFIMPAAHPVAINASSELHLLGFGINAENNHRIFLAGDKDNVIDQIEKQAKDLAFPGSGEQVEKLIKNQKESHFVSARPQSQSQSPSSPEKESPEKEDQEEENQGGKGPLLSILKAFN

SEQ ID NO：3-Ara H2

不帶本源信號(hào)序列的Ara H2蛋白的編碼區(qū)的氨基酸序列(在Ara H1/H2/H3多蛋白嵌合構(gòu)建物AraH-LAMP中，以及在單獨(dú)的Ara H2構(gòu)建物AraH2-LAMP中)如下：

RQQWELQGDRRCQSQLERANLRPCEQHLMQKIQRDEDSYGRDPYSPSQDPYSPSQDPDRRDPYSPSPYDRRGAGSSQHQERCCNELNEFENNQRCMCEALQQIMENQSDRLQGRQQEQQFKRELRNLPQQCGLRAPQRCDLEVESGGRDRY

SEQ ID NO：4-多蛋白嵌合構(gòu)建物AraH-LAMP(或AraH1-H2-H3-LAMP)中的Ara H3

Ara H1/H2/H3多蛋白嵌合構(gòu)建物中不帶本源信號(hào)序列的Ara H3蛋白的編碼區(qū)的氨基酸序列如下：

VTFRQGGEENECQFQRLNAQRPDNRIESEGGYIETWNPNNQEFQCAGVALSRTVLRRNALRRPFYSNAPLEIYVQQGSGYFGLIFPGCPSTYEEPAQEGRRYQSQKPSRRFQVGQDDPSQQQQDSHQKVHRFDEGDLIAVPTGVAFWMYNDEDTDVVTVTLSDTSSIHNQLDQFPRRFYLAGNQEQEFLRYQQQQGSRPHYRQISPRVRGDEQENEGSNIFSGFAQEFLQHAFQVDRQTVENLRGENEREEQGAIVTVKGGLRILSPDEEDESSRSPPNRREEFDEDRSRPQQRGKYDENRRGYKNGIEETICSASVKKNLGRSSNPDIYNPQAGSLRSVNELDLPILGWLGLSAQHGTIYRNAMFVPHYTLNAHTIVVALNGRAHVQVVDSNGNRVYDEELQEGHVLVVPQNFAVAAKAQSENYEYLAFKTDSRPSIANQAGENSIIDNLPEEVVANSYRLPREQARQLKNNNPFKFFVPPFDHQSMREVA

SEQ ID NO：5-單獨(dú)的Ara H3del構(gòu)建物AraH3del LAMP中的Ara H3del

Ara H3del單獨(dú)構(gòu)建物中Ara H3del蛋白(被設(shè)計(jì)用于避開(kāi)剪接位點(diǎn)的截短的版本；le＝Xho，ef＝EcoRI)的編碼區(qū)的氨基酸序列如下：

VTFRQGGEENECQFQRLNAQRPDNRIESEGGYIETWNPNNQEFQCAGVALSRTVLRRNALRRPFYSNAPLEIYVQQGSGYFGLIFPGCPSTYEEPAQEGRRYQSQKPSRRFQVGQDDPSQQQQDSHQKVHRFDEGDLIAVPTGVAFWMYNDEDTDVVTVTLSDTSSIHNQLDQFPRRFYLAGNQEQEFLRYQQQQGSRPHYRQISPRVRGDEQENEGSNIFSGFAQEFLQHAFQVDRQTVENLRGENEREEQGAIVTVKGGLRILSPDEEDESSRSPPNRREEFDEDRSRPQQRGKYDENRRGYKN

SEQ ID NO：6-AraH3del LAMP

Ara H3 LAMP融合蛋白的編碼區(qū)的氨基酸序列(LAMP為粗體；側(cè)翼XhoI(LE)和EcoRI(EF)位點(diǎn)為大寫(xiě)字母并下劃線)如下：

SEQ ID NO：7–AraH2LAMP

Ara H2 LAMP融合蛋白的編碼區(qū)的氨基酸序列(LAMP為粗體；側(cè)翼XhoI(LE)和EcoRI(EF)位點(diǎn)為大寫(xiě)字母并下劃線)如下：

SEQ ID NO：8–AraH1LAMP

Ara H1 LAMP融合蛋白的編碼區(qū)的氨基酸序列(LAMP為粗體；側(cè)翼XhoI(LE)和EcoRI(EF)位點(diǎn)為大寫(xiě)字母并下劃線)如下：

SEQ ID NO：9–缺失的Ara H3區(qū)域

未包含在單獨(dú)Ara H3del構(gòu)建物中的Ara H3的氨基酸序列如下：

GIEETICSASVKKNLGRSSNPDIYNPQAGSLRSVNELDLPILGWLGLSAQHGTIYRNAMFVPHYTLNAHTIVVALNGRAHVQVVDSNGNRVYDEELQEGHVLVVPQNFAVAAKAQSENYEYLAFKTDSRPSIANQAGENSIIDNLPEEVVANSYRLPREQARQLKNNNPFKFFVPPFDHQSMREVA

SEQ ID NO：10-LAMP2核苷酸序列

信號(hào)：(1)..(84)

穩(wěn)定化：(85)..(1125)

TM/CYTO：(1126)..(1227)

atggtgtgcttccgcctcttcccggttccgggctcagggctcgttctggtctgcctagtcctgggagctgtgcggtcttatgcattggaacttaatttgacagattcagaaaatgccacttgcctttatgcaaaatggcagatgaatttcacagttcgctatgaaactacaaataaaacttataaaactgtaaccatttcagaccatggcactgtgacatataatggaagcatttgtggggatgatcagaatggtcccaaaatagcagtgcagttcggacctggcttttcctggattgcgaattttaccaaggcagcatctacttattcaattgacagcgtctcattttcctacaacactggtgataacacaacatttcctgatgctgaagataaaggaattcttactgttgatgaacttttggccatcagaattccattgaatgacctttttagatgcaatagtttatcaactttggaaaagaatgatgttgtccaacactactgggatgttcttgtacaagcttttgtccaaaatggcacagtgagcacaaatgagttcctgtgtgataaagacaaaacttcaacagtggcacccaccatacacaccactgtgccatctcctactacaacacctactccaaaggaaaaaccagaagctggaacctattcagttaataatggcaatgatacttgtctgctggctaccatggggctgcagctgaacatcactcaggataaggttgcttcagttattaacatcaaccccaatacaactcactccacaggcagctgccgttctcacactgctctacttagactcaatagcagcaccattaagtatctagactttgtctttgctgtgaaaaatgaaaaccgattttatctgaaggaagtgaacatcagcatgtatttggttaatggctccgttttcagcattgcaaataacaatctcagctactggatgcccccaagttcttatatgtgcaacaaagagcagactgtttcagtgtctggagcatttcagataaatacctttgatctaagggttcagcctttcaatgtgacacaaggaaagtattctacagctcaagactgcagtgcagatgacgacaacttccttgtgcccatagcggtgggagctgccttggcaggagtacttattctagtgttgctggcttattttattggtctcaagcaccatcatgctggatatgagcaattttag

SEQ ID NO：11–LAMP-3(DC-LAMP)核苷酸序列

信號(hào)：(1)..(81)

穩(wěn)定化：(82)..(1143)

TM/CYTO：(1144)..(1248)

atgccccggcagctcagcgcggcggccgcgctcttcgcgtccctggccgtaattttgcacgatggcagtcaaatgagagcaaaagcatttccagaaaccagagattattctcaacctactgcagcagcaacagtacaggacataaaaaaacctgtccagcaaccagctaagcaagcacctcaccaaactttagcagcaagattcatggatggtcatatcacctttcaaacagcggccacagtaaaaattccaacaactaccccagcgactacaaaaaacactgcaaccaccagcccaattacctacaccctggtcacaacccaggccacacccaacaactcacacacagctcctccagttactgaagttacagtcggccctagcttagccccttattcactgccacccaccatcaccccaccagctcatacaactggaaccagttcatcaaccgtcagccacacaactgggaacaccactcaacccagtaaccagaccacccttccagcaactttatcgatagcactgcacaaaagcacaaccggtcagaagcctgttcaacccacccatgccccaggaacaacggcagctgcccacaataccacccgcacagctgcacctgcctccacggttcctgggcccacccttgcacctcagccatcgtcagtcaagactggaatttatcaggttctaaacggaagcagactctgtataaaagcagagatggggatacagctgattgttcaagacaaggagtcggttttttcacctcggagatacttcaacatcgaccccaacgcaacgcaagcctctgggaactgtggcacccgaaaatccaaccttctgttgaattttcagggcggatttgtgaatctcacatttaccaaggatgaagaatcatattatatcagtgaagtgggagcctatttgaccgtctcagatccagagacaatttaccaaggaatcaaacatgcggtggtgatgttccagacagcagtcgggcattccttcaagtgcgtgagtgaacagagcctccagttgtcagcccacctgcaggtgaaaacaaccgatgtccaacttcaagcctttgattttgaagatgaccactttggaaatgtggatgagtgctcgtctgactacacaattgtgcttcctgtgattggggccatcgtggttggtctctgccttatgggtatgggtgtctataaaatccgcctaaggtgtcaatcatctggataccagagaatc

SEQ ID NO：12-ENDOLYN核苷酸序列

信號(hào)：(1)..(72)

穩(wěn)定化：(73)..(486)

TM/CYTO：(487)..(594)

atgtcgcggctctcccgctcactgctttgggccgccacctgcctgggcgtgctctgcgtgctgtccgcggacaagaacacgacccagcacccgaacgtgacgactttagcgcccatctccaacgtaacctcggcgccggtgacgtccctcccgctggtcaccactccggcaccagaaacctgtgaaggtcgaaacagctgcgtttcctgttttaatgttagcgttgttaatactacctgcttttggatagaatgtaaagatgagagctattgttcacataactcaacagttagtgattgtcaagtggggaacacgacagacttctgttccgtttccacggccactccagtgccaacagccaattctacagctaaacccacagttcagccctccccttctacaacttccaagacagttactacatcaggtacaacaaataacactgtgactccaacctcacaacctgtgcgaaagtctacctttgatgcagccagtttcattggaggaattgtcctggtcttgggtgtgcaggctgtaattttctttctttataaattctgcaaatctaaagaacgaaattaccacactctgtaa

SEQ ID NO：13-LIMP II核苷酸序列

信號(hào)：(13)..(81)

穩(wěn)定化：(82)..(1299)

TM/CYTO：(1300)..(1434)

atgggccgatgctgcttctacacggcggggacgttgtccctgctcctgctggtgaccagcgtcacgctgctggtggcccgggtcttccagaaggctgtagaccagagtatcgagaagaaaattgtgttaaggaatggtactgaggcatttgactcctgggagaagccccctctgcctgtgtatactcagttctatttcttcaatgtcaccaatccagaggagatcctcagaggggagacccctcgggtggaagaagtggggccatacacctacagggaactcagaaacaaagcaaatattcaatttggagataatggaacaacaatatctgctgttagcaacaaggcctatgtttttgaacgagaccaatctgttggagaccctaaaattgacttaattagaacattaaatattcctgtattgactgtcatagagtggtcccaggtgcacttcctcagggagatcatcgaggccatgttgaaagcctatcagcagaagctctttgtgactcacacagttgacgaattgctctggggctacaaagatgaaatcttgtcccttatccatgttttcaggcccgatatctctccctattttggcctattctatgagaaaaatgggactaatgatggagactatgtttttctaactggagaagacagttaccttaactttacaaaaattgtggaatggaatgggaaaacgtcacttgactggtggataacagacaagtgcaatatgattaatggaacagatggagattcttttcacccactaataaccaaagatgaggtcctttatgtcttcccatctgacttttgcaggtcagtgtatattactttcagtgactatgagagtgtacagggactgcctgcctttcggtataaagttcctgcagaaatattagccaatacgtcagacaatgccggcttctgtatacctgagggaaactgcctgggctcaggagttctgaatgtcagcatctgcaagaatggtgcacccatcattatgtctttcccacacttttaccaagcagatgagaggtttgtttctgccatagaaggcatgcacccaaatcaggaagaccatgagacatttgtggacattaatcctttgactggaataatcctaaaagcagccaagaggttccaaatcaacatttatgtcaaaaaattagatgactttgttgaaacgggagacattagaaccatggttttcccagtgatgtacctcaatgagagtgttcacattgataaagagacggcgagtcgactgaagtctatgattaacactactttgatcatcaccaacataccctacatcatcatggcgctgggtgtgttctttggtttggtttttacctggcttgcatgcaaaggacagggatccatggatgagggaacagcggatgaaagagcacccctcattcgaacctag

SEQ ID NO：14-AraH1-AraH2-AraH3核苷酸序列

AraH1：(1)..(1803)

連接序列：(1804)..(1815)

AraH2：(1816)..(2268)

連接序列：(2269)..(2280)

AraH3：(2281)..(3756)

aagtccagcccctaccagaagaaaaccgagaacccctgcgcccagcggtgcctgcagtcttgtcagcaggaacccgacgacctgaagcagaaggcctgcgagagccggtgcaccaagctggaatacgaccccagatgcgtgtacgaccctagaggccacaccggcaccaccaaccagagaagccctccaggcgagcggaccagaggcagacagcctggcgactacgacgacgacagacggcagcccagaagagaagagggcggcagatggggacctgccggccctagagagagagaacgcgaggaagattggagacagcccagagaggactggcggaggccttctcaccagcagccccggaagatcagacccgagggcagagaaggcgagcaggaatggggcacacctggctctcacgtgcgcgaggaaaccagccggaacaaccccttctacttcccctcccggcggttcagcaccagatacggcaaccagaacggccggatcagagtgctgcagagattcgaccagcggagccggcagttccagaacctgcagaaccaccggatcgtgcagatcgaggccaagcccaacaccctggtgctgcccaaacacgccgacgccgacaacatcctcgtgatccagcagggccaggccaccgtgacagtggccaacggcaacaacagaaagagcttcaacctggacgagggccacgccctgagaatccccagcggcttcatcagctacatcctgaacagacacgacaatcagaacctgagggtggccaagatcagcatgcccgtgaacacccctggccagttcgaggacttcttccccgcatcctcccgggaccagagcagctacctgcagggcttcagccggaataccctggaagccgccttcaacgccgagttcaacgagatcagacgggtgctgctggaagagaacgctggcggagagcaggaagaacggggccagagaagatggtccaccagaagcagcgagaacaacgagggcgtgatcgtgaaggtgtccaaagaacacgtggaagaactgaccaagcacgccaagagcgtgtccaagaagggctccgaggaagagggggacatcaccaaccccatcaatctgagagagggcgagcccgacctgagcaacaacttcggcaagctgttcgaagtgaagcccgacaagaagaacccccagctgcaggacctggacatgatgctgacctgcgtggaaatcaaagagggggccctgatgctgccacacttcaactccaaagccatggtcatcgtggtcgtgaacaagggcaccggcaacctggaactggtggccgtgcggaaagagcagcagcagagaggccgcagagaggaagaagaggacgaggacgaagaagaagagggatccaaccgggaagtgcggcggtacaccgccagactgaaagaaggcgacgtgttcatcatgcctgccgcccaccccgtggccatcaatgcctctagcgagctgcatctgctgggcttcggcattaacgccgagaacaatcaccggatctttctggccggcgacaaagacaacgtgatcgaccagatcgagaagcaggccaaggacctggcctttcccggctctggcgaacaagtggaaaagctgatcaagaaccagaaagaaagccacttcgtgtccgccagaccccagagccagtctcagagccctagctcccccgagaaagagtctcctgagaaagaggaccaggaagaggaaaaccagggcggcaagggccctctgctgagcatcctgaaggccttcaatggcggcggaggcaggcagcagtgggaactgcagggcgacagaagatgccagtcccagctggaacgggccaacctgaggccttgcgagcagcacctgatgcagaaaatccagcgcgacgaggacagctacggccgggatccttacagccccagccaggacccttactcccctagccaggatcccgacagaagggacccctacagccctagcccctacgatagaagaggcgccggaagcagccagcaccaggaaagatgctgcaacgagctgaacgagtttgagaacaaccagcgctgcatgtgcgaggccctgcagcagatcatggaaaatcagagcgaccggctgcagggacggcagcaggaacagcagttcaagagagagctgcggaacctgccccagcagtgtggactgagagccccccagagatgcgacctggaagtggaaagcggcggcagagataggtacggcggagggggcgtgaccttcagacagggcggagaagagaatgagtgccagtttcagcggctgaacgcccagaggcccgacaacagaatcgagagcgagggcggctacatcgagacatggaaccccaacaaccaggaatttcagtgcgctggggtggccctgagcaggaccgtgctgagaagaaatgccctgaggcggcccttctacagcaacgcccccctggaaatctacgtgcagcagggcagcggctacttcggcctgatctttcccggatgcccctccacctatgaggaacccgctcaggaaggcagacggtatcagagccagaagcctagcagacggttccaagtgggccaggacgatcccagccaacagcagcaggactctcaccagaaggtgcaccgcttcgacgagggcgacctgatcgctgtgccaaccggcgtggccttctggatgtacaacgacgaggataccgacgtcgtgaccgtgaccctgagcgacaccagctccatccacaaccagctggaccagttccccaggcggttttacctggccggcaatcaggaacaggaatttctgagataccagcagcagcagggctccagaccccactacagacagatcagccctagagtgcggggcgacgaacaggaaaatgagggcagcaacatcttctccggctttgcccaggaatttctgcagcacgccttccaggtggaccggcagaccgtggaaaacctgagaggcgagaacgagagagaggaacagggcgccatcgtgactgtgaagggcggcctgaggatcctgagccccgacgaagaggatgagtcctctagaagcccccccaaccgccgggaagagttcgatgaggaccgcagcagacctcagcagcgggggaagtacgacgagaacaggcggggctacaagaacggcatcgaggaaacaatctgcagcgccagcgtgaagaagaatctgggccggtccagcaaccccgacatctacaatccacaggccggcagcctgcggagcgtgaacgaactggatctgcccatcctgggatggctgggcctgtctgcccagcacggcaccatctaccggaacgccatgttcgtgcctcactacaccctgaatgcccacaccatcgtggtggctctgaacggccgcgcccacgtccaagtggtggacagcaacggcaatcgggtgtacgatgaagaactgcaggaaggacacgtcctggtggtgccccagaattttgccgtggccgccaaggcccagtccgagaactatgagtatctggccttcaagaccgacagccggccctctatcgccaatcaagccggcgagaacagcatcatcgacaacctgcccgaggaagtggtggccaacagctaccggctgcctagagagcaggcccggcagctgaagaacaacaaccctttcaagttcttcgtgcccccattcgaccaccagagcatgagagaggtggcc

SEQ ID NO：15-AraH1核苷酸序列

aagtccagcccctaccagaagaaaaccgagaacccctgcgcccagcggtgcctgcagtcttgtcagcaggaacccgacgacctgaagcagaaggcctgcgagagccggtgcaccaagctggaatacgaccccagatgcgtgtacgaccctagaggccacaccggcaccaccaaccagagaagccctccaggcgagcggaccagaggcagacagcctggcgactacgacgacgacagacggcagcccagaagagaagagggcggcagatggggacctgccggccctagagagagagaacgcgaggaagattggagacagcccagagaggactggcggaggccttctcaccagcagccccggaagatcagacccgagggcagagaaggcgagcaggaatggggcacacctggctctcacgtgcgcgaggaaaccagccggaacaaccccttctacttcccctcccggcggttcagcaccagatacggcaaccagaacggccggatcagagtgctgcagagattcgaccagcggagccggcagttccagaacctgcagaaccaccggatcgtgcagatcgaggccaagcccaacaccctggtgctgcccaaacacgccgacgccgacaacatcctcgtgatccagcagggccaggccaccgtgacagtggccaacggcaacaacagaaagagcttcaacctggacgagggccacgccctgagaatccccagcggcttcatcagctacatcctgaacagacacgacaatcagaacctgagggtggccaagatcagcatgcccgtgaacacccctggccagttcgaggacttcttccccgcatcctcccgggaccagagcagctacctgcagggcttcagccggaataccctggaagccgccttcaacgccgagttcaacgagatcagacgggtgctgctggaagagaacgctggcggagagcaggaagaacggggccagagaagatggtccaccagaagcagcgagaacaacgagggcgtgatcgtgaaggtgtccaaagaacacgtggaagaactgaccaagcacgccaagagcgtgtccaagaagggctccgaggaagagggggacatcaccaaccccatcaatctgagagagggcgagcccgacctgagcaacaacttcggcaagctgttcgaagtgaagcccgacaagaagaacccccagctgcaggacctggacatgatgctgacctgcgtggaaatcaaagagggggccctgatgctgccacacttcaactccaaagccatggtcatcgtggtcgtgaacaagggcaccggcaacctggaactggtggccgtgcggaaagagcagcagcagagaggccgcagagaggaagaagaggacgaggacgaagaagaagagggatccaaccgggaagtgcggcggtacaccgccagactgaaagaaggcgacgtgttcatcatgcctgccgcccaccccgtggccatcaatgcctctagcgagctgcatctgctgggcttcggcattaacgccgagaacaatcaccggatctttctggccggcgacaaagacaacgtgatcgaccagatcgagaagcaggccaaggacctggcctttcccggctctggcgaacaagtggaaaagctgatcaagaaccagaaagaaagccacttcgtgtccgccagaccccagagccagtctcagagccctagctcccccgagaaagagtctcctgagaaagaggaccaggaagaggaaaaccagggcggcaagggccctctgctgagcatcctgaaggccttcaat

SEQ ID NO：16-AraH2核苷酸序列

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SEQ ID NO：17-AraH3核苷酸序列

gtgaccttcagacagggcggagaagagaatgagtgccagtttcagcggctgaacgcccagaggcccgacaacagaatcgagagcgagggcggctacatcgagacatggaaccccaacaaccaggaatttcagtgcgctggggtggccctgagcaggaccgtgctgagaagaaatgccctgaggcggcccttctacagcaacgcccccctggaaatctacgtgcagcagggcagcggctacttcggcctgatctttcccggatgcccctccacctatgaggaacccgctcaggaaggcagacggtatcagagccagaagcctagcagacggttccaagtgggccaggacgatcccagccaacagcagcaggactctcaccagaaggtgcaccgcttcgacgagggcgacctgatcgctgtgccaaccggcgtggccttctggatgtacaacgacgaggataccgacgtcgtgaccgtgaccctgagcgacaccagctccatccacaaccagctggaccagttccccaggcggttttacctggccggcaatcaggaacaggaatttctgagataccagcagcagcagggctccagaccccactacagacagatcagccctagagtgcggggcgacgaacaggaaaatgagggcagcaacatcttctccggctttgcccaggaatttctgcagcacgccttccaggtggaccggcagaccgtggaaaacctgagaggcgagaacgagagagaggaacagggcgccatcgtgactgtgaagggcggcctgaggatcctgagccccgacgaagaggatgagtcctctagaagcccccccaaccgccgggaagagttcgatgaggaccgcagcagacctcagcagcgggggaagtacgacgagaacaggcggggctacaagaacggcatcgaggaaacaatctgcagcgccagcgtgaagaagaatctgggccggtccagcaaccccgacatctacaatccacaggccggcagcctgcggagcgtgaacgaactggatctgcccatcctgggatggctgggcctgtctgcccagcacggcaccatctaccggaacgccatgttcgtgcctcactacaccctgaatgcccacaccatcgtggtggctctgaacggccgcgcccacgtccaagtggtggacagcaacggcaatcgggtgtacgatgaagaactgcaggaaggacacgtcctggtggtgccccagaattttgccgtggccgccaaggcccagtccgagaactatgagtatctggccttcaagaccgacagccggccctctatcgccaatcaagccggcgagaacagcatcatcgacaacctgcccgaggaagtggtggccaacagctaccggctgcctagagagcaggcccggcagctgaagaacaacaaccctttcaagttcttcgtgcccccattcgaccaccagagcatgagagaggtggcc

SEQ ID NO：18-AraH1-LAMP核苷酸序列

信號(hào)：(1)..(86)

穩(wěn)定化：(87)..(1146)

AraH1：(1147)..(2943)

TM/CYTO：(2943)..(3066)

atggcgccccgcagcgcccggcgacccctgctgctgctactgctgttgctgctgctcggcctcatgcattgtgcgtcagcagcaatgtttatggtgaaaaatggcaacgggaccgcgtgcataatggccaacttctctgctgccttctcagtgaactacgacaccaagagtggccctaagaacatgacccttgacctgccatcagatgccacagtggtgctcaaccgcagctcctgtggaaaagagaacacttctgaccccagtctcgtgattgcttttggaagaggacatacactcactctcaatttcacgagaaatgcaacacgttacagcgttcagctcatgagttttgtttataacttgtcagacacacaccttttccccaatgcgagctccaaagaaatcaagactgtggaatctataactgacatcagggcagatatagataaaaaatacagatgtgttagtggcacccaggtccacatgaacaacgtgaccgtaacgctccatgatgccaccatccaggcgtacctttccaacagcagcttcagcaggggagagacacgctgtgaacaagacaggccttccccaaccacagcgccccctgcgccacccagcccctcgccctcacccgtgcccaagagcccctctgtggacaagtacaacgtgagcggcaccaacgggacctgcctgctggccagcatggggctgcagctgaacctcacctatgagaggaaggacaacacgacggtgacaaggcttctcaacatcaaccccaacaagacctcggccagcgggagctgcggcgcccacctggtgactctggagctgcacagcgagggcaccaccgtcctgctcttccagttcgggatgaatgcaagttctagccggtttttcctacaaggaatccagttgaatacaattcttcctgacgccagagaccctgcctttaaagctgccaacggctccctgcgagcgctgcaggccacagtcggcaattcctacaagtgcaacgcggaggagcacgtccgtgtcacgaaggcgttttcagtcaatatattcaaagtgtgggtccaggctttcaaggtggaaggtggccagtttggctctgtggaggagtgtctgctggacgagaacagcctcgagaagtccagcccctaccagaagaaaaccgagaacccctgcgcccagcggtgcctgcagtcttgtcagcaggaacccgacgacctgaagcagaaggcctgcgagagccggtgcaccaagctggaatacgaccccagatgcgtgtacgaccctagaggccacaccggcaccaccaaccagagaagccctccaggcgagcggaccagaggcagacagcctggcgactacgacgacgacagacggcagcccagaagagaagagggcggcagatggggacctgccggccctagagagagagaacgcgaggaagattggagacagcccagagaggactggcggaggccttctcaccagcagccccggaagatcagacccgagggcagagaaggcgagcaggaatggggcacacctggctctcacgtgcgcgaggaaaccagccggaacaaccccttctacttcccctcccggcggttcagcaccagatacggcaaccagaacggccggatcagagtgctgcagagattcgaccagcggagccggcagttccagaacctgcagaaccaccggatcgtgcagatcgaggccaagcccaacaccctggtgctgcccaaacacgccgacgccgacaacatcctcgtgatccagcagggccaggccaccgtgacagtggccaacggcaacaacagaaagagcttcaacctggacgagggccacgccctgagaatccccagcggcttcatcagctacatcctgaacagacacgacaatcagaacctgagggtggccaagatcagcatgcccgtgaacacccctggccagttcgaggacttcttccccgcatcctcccgggaccagagcagctacctgcagggcttcagccggaataccctggaagccgccttcaacgccgagttcaacgagatcagacgggtgctgctggaagagaacgctggcggagagcaggaagaacggggccagagaagatggtccaccagaagcagcgagaacaacgagggcgtgatcgtgaaggtgtccaaagaacacgtggaagaactgaccaagcacgccaagagcgtgtccaagaagggctccgaggaagagggggacatcaccaaccccatcaatctgagagagggcgagcccgacctgagcaacaacttcggcaagctgttcgaagtgaagcccgacaagaagaacccccagctgcaggacctggacatgatgctgacctgcgtggaaatcaaagagggggccctgatgctgccacacttcaactccaaagccatggtcatcgtggtcgtgaacaagggcaccggcaacctggaactggtggccgtgcggaaagagcagcagcagagaggccgcagagaggaagaagaggacgaggacgaagaagaagagggatccaaccgggaagtgcggcggtacaccgccagactgaaagaaggcgacgtgttcatcatgcctgccgcccaccccgtggccatcaatgcctctagcgagctgcatctgctgggcttcggcattaacgccgagaacaatcaccggatctttctggccggcgacaaagacaacgtgatcgaccagatcgagaagcaggccaaggacctggcctttcccggctctggcgaacaagtggaaaagctgatcaagaaccagaaagaaagccacttcgtgtccgccagaccccagagccagtctcagagccctagctcccccgagaaagagtctcctgagaaagaggaccaggaagaggaaaaccagggcggcaagggccctctgctgagcatcctgaaggccttcaatgaattcacgctgatccccatcgctgtgggtggtgccctggcggggctggtcctcatcgtcctcatcgcctacctcgtcggcaggaagaggagtcacgcaggctaccagactatctag

SEQ ID NO：19-AraH2-LAMP核苷酸序列

信號(hào)：(1)..(86)

穩(wěn)定化：(87)..(1146)

ARA H2：(1147)-(1600)

TM/CYTO：(1601)..(1716)

atggcgccccgcagcgcccggcgacccctgctgctgctactgctgttgctgctgctcggcctcatgcattgtgcgtcagcagcaatgtttatggtgaaaaatggcaacgggaccgcgtgcataatggccaacttctctgctgccttctcagtgaactacgacaccaagagtggccctaagaacatgacccttgacctgccatcagatgccacagtggtgctcaaccgcagctcctgtggaaaagagaacacttctgaccccagtctcgtgattgcttttggaagaggacatacactcactctcaatttcacgagaaatgcaacacgttacagcgttcagctcatgagttttgtttataacttgtcagacacacaccttttccccaatgcgagctccaaagaaatcaagactgtggaatctataactgacatcagggcagatatagataaaaaatacagatgtgttagtggcacccaggtccacatgaacaacgtgaccgtaacgctccatgatgccaccatccaggcgtacctttccaacagcagcttcagcaggggagagacacgctgtgaacaagacaggccttccccaaccacagcgccccctgcgccacccagcccctcgccctcacccgtgcccaagagcccctctgtggacaagtacaacgtgagcggcaccaacgggacctgcctgctggccagcatggggctgcagctgaacctcacctatgagaggaaggacaacacgacggtgacaaggcttctcaacatcaaccccaacaagacctcggccagcgggagctgcggcgcccacctggtgactctggagctgcacagcgagggcaccaccgtcctgctcttccagttcgggatgaatgcaagttctagccggtttttcctacaaggaatccagttgaatacaattcttcctgacgccagagaccctgcctttaaagctgccaacggctccctgcgagcgctgcaggccacagtcggcaattcctacaagtgcaacgcggaggagcacgtccgtgtcacgaaggcgttttcagtcaatatattcaaagtgtgggtccaggctttcaaggtggaaggtggccagtttggctctgtggaggagtgtctgctggacgagaacagcctcgagaggcagcagtgggaactgcagggcgacagaagatgccagtcccagctggaacgggccaacctgaggccttgcgagcagcacctgatgcagaaaatccagcgcgacgaggacagctacggccgggatccttacagccccagccaggacccttactcccctagccaggatcccgacagaagggacccctacagccctagcccctacgatagaagaggcgccggaagcagccagcaccaggaaagatgctgcaacgagctgaacgagtttgagaacaaccagcgctgcatgtgcgaggccctgcagcagatcatggaaaatcagagcgaccggctgcagggacggcagcaggaacagcagttcaagagagagctgcggaacctgccccagcagtgtggactgagagccccccagagatgcgacctggaagtggaaagcggcggcagagataggtacgaattcacgctgatccccatcgctgtgggtggtgccctggcggggctggtcctcatcgtcctcatcgcctacctcgtcggcaggaagaggagtcacgcaggctaccagactatctag

SEQ ID NO：20-AraH3-LAMP核苷酸序列

信號(hào)：(1)..(86)

穩(wěn)定化：(87)..(1146)

AraH3：(1147)..(2623)

TM/CYTO：(2624)..(2739)

atggcgccccgcagcgcccggcgacccctgctgctgctactgctgttgctgctgctcggcctcatgcattgtgcgtcagcagcaatgtttatggtgaaaaatggcaacgggaccgcgtgcataatggccaacttctctgctgccttctcagtgaactacgacaccaagagtggccctaagaacatgacccttgacctgccatcagatgccacagtggtgctcaaccgcagctcctgtggaaaagagaacacttctgaccccagtctcgtgattgcttttggaagaggacatacactcactctcaatttcacgagaaatgcaacacgttacagcgttcagctcatgagttttgtttataacttgtcagacacacaccttttccccaatgcgagctccaaagaaatcaagactgtggaatctataactgacatcagggcagatatagataaaaaatacagatgtgttagtggcacccaggtccacatgaacaacgtgaccgtaacgctccatgatgccaccatccaggcgtacctttccaacagcagcttcagcaggggagagacacgctgtgaacaagacaggccttccccaaccacagcgccccctgcgccacccagcccctcgccctcacccgtgcccaagagcccctctgtggacaagtacaacgtgagcggcaccaacgggacctgcctgctggccagcatggggctgcagctgaacctcacctatgagaggaaggacaacacgacggtgacaaggcttctcaacatcaaccccaacaagacctcggccagcgggagctgcggcgcccacctggtgactctggagctgcacagcgagggcaccaccgtcctgctcttccagttcgggatgaatgcaagttctagccggtttttcctacaaggaatccagttgaatacaattcttcctgacgccagagaccctgcctttaaagctgccaacggctccctgcgagcgctgcaggccacagtcggcaattcctacaagtgcaacgcggaggagcacgtccgtgtcacgaaggcgttttcagtcaatatattcaaagtgtgggtccaggctttcaaggtggaaggtggccagtttggctctgtggaggagtgtctgctggacgagaacagcctcgaggtgaccttcagacagggcggagaagagaatgagtgccagtttcagcggctgaacgcccagaggcccgacaacagaatcgagagcgagggcggctacatcgagacatggaaccccaacaaccaggaatttcagtgcgctggggtggccctgagcaggaccgtgctgagaagaaatgccctgaggcggcccttctacagcaacgcccccctggaaatctacgtgcagcagggcagcggctacttcggcctgatctttcccggatgcccctccacctatgaggaacccgctcaggaaggcagacggtatcagagccagaagcctagcagacggttccaagtgggccaggacgatcccagccaacagcagcaggactctcaccagaaggtgcaccgcttcgacgagggcgacctgatcgctgtgccaaccggcgtggccttctggatgtacaacgacgaggataccgacgtcgtgaccgtgaccctgagcgacaccagctccatccacaaccagctggaccagttccccaggcggttttacctggccggcaatcaggaacaggaatttctgagataccagcagcagcagggctccagaccccactacagacagatcagccctagagtgcggggcgacgaacaggaaaatgagggcagcaacatcttctccggctttgcccaggaatttctgcagcacgccttccaggtggaccggcagaccgtggaaaacctgagaggcgagaacgagagagaggaacagggcgccatcgtgactgtgaagggcggcctgaggatcctgagccccgacgaagaggatgagtcctctagaagcccccccaaccgccgggaagagttcgatgaggaccgcagcagacctcagcagcgggggaagtacgacgagaacaggcggggctacaagaacggcatcgaggaaacaatctgcagcgccagcgtgaagaagaatctgggccggtccagcaaccccgacatctacaatccacaggccggcagcctgcggagcgtgaacgaactggatctgcccatcctgggatggctgggcctgtctgcccagcacggcaccatctaccggaacgccatgttcgtgcctcactacaccctgaatgcccacaccatcgtggtggctctgaacggccgcgcccacgtccaagtggtggacagcaacggcaatcgggtgtacgatgaagaactgcaggaaggacacgtcctggtggtgccccagaattttgccgtggccgccaaggcccagtccgagaactatgagtatctggccttcaagaccgacagccggccctctatcgccaatcaagccggcgagaacagcatcatcgacaacctgcccgaggaagtggtggccaacagctaccggctgcctagagagcaggcccggcagctgaagaacaacaaccctttcaagttcttcgtgcccccattcgaccaccagagcatgagagaggtggccgaattcacgctgatccccatcgctgtgggtggtgccctggcggggctggtcctcatcgtcctcatcgcctacctcgtcggcaggaagaggagtcacgcaggctaccagactatctag

SEQ ID NO：21-AraH1-AraH2-AraH3-LAMP(AraH-LAMP，AraH1-H2-H3-LAMP)核苷酸序列

信號(hào)：(1)..(86)

穩(wěn)定化：(87)..(1146)

AraH1：(1147)..(2949)

連接序列：(2950)..(2961)

AraH2：(2962)..(3414)

連接序列：(3415)..(3426)

AraH3：(3427)..(4902)

TM/CYTO：(4903)..(5019)

atggcgccccgcagcgcccggcgacccctgctgctgctactgctgttgctgctgctcggcctcatgcattgtgcgtcagcagcaatgtttatggtgaaaaatggcaacgggaccgcgtgcataatggccaacttctctgctgccttctcagtgaactacgacaccaagagtggccctaagaacatgacccttgacctgccatcagatgccacagtggtgctcaaccgcagctcctgtggaaaagagaacacttctgaccccagtctcgtgattgcttttggaagaggacatacactcactctcaatttcacgagaaatgcaacacgttacagcgttcagctcatgagttttgtttataacttgtcagacacacaccttttccccaatgcgagctccaaagaaatcaagactgtggaatctataactgacatcagggcagatatagataaaaaatacagatgtgttagtggcacccaggtccacatgaacaacgtgaccgtaacgctccatgatgccaccatccaggcgtacctttccaacagcagcttcagcaggggagagacacgctgtgaacaagacaggccttccccaaccacagcgccccctgcgccacccagcccctcgccctcacccgtgcccaagagcccctctgtggacaagtacaacgtgagcggcaccaacgggacctgcctgctggccagcatggggctgcagctgaacctcacctatgagaggaaggacaacacgacggtgacaaggcttctcaacatcaaccccaacaagacctcggccagcgggagctgcggcgcccacctggtgactctggagctgcacagcgagggcaccaccgtcctgctcttccagttcgggatgaatgcaagttctagccggtttttcctacaaggaatccagttgaatacaattcttcctgacgccagagaccctgcctttaaagctgccaacggctccctgcgagcgctgcaggccacagtcggcaattcctacaagtgcaacgcggaggagcacgtccgtgtcacgaaggcgttttcagtcaatatattcaaagtgtgggtccaggctttcaaggtggaaggtggccagtttggctctgtggaggagtgtctgctggacgagaacagcctcgagaagtccagcccctaccagaagaaaaccgagaacccctgcgcccagcggtgcctgcagtcttgtcagcaggaacccgacgacctgaagcagaaggcctgcgagagccggtgcaccaagctggaatacgaccccagatgcgtgtacgaccctagaggccacaccggcaccaccaaccagagaagccctccaggcgagcggaccagaggcagacagcctggcgactacgacgacgacagacggcagcccagaagagaagagggcggcagatggggacctgccggccctagagagagagaacgcgaggaagattggagacagcccagagaggactggcggaggccttctcaccagcagccccggaagatcagacccgagggcagagaaggcgagcaggaatggggcacacctggctctcacgtgcgcgaggaaaccagccggaacaaccccttctacttcccctcccggcggttcagcaccagatacggcaaccagaacggccggatcagagtgctgcagagattcgaccagcggagccggcagttccagaacctgcagaaccaccggatcgtgcagatcgaggccaagcccaacaccctggtgctgcccaaacacgccgacgccgacaacatcctcgtgatccagcagggccaggccaccgtgacagtggccaacggcaacaacagaaagagcttcaacctggacgagggccacgccctgagaatccccagcggcttcatcagctacatcctgaacagacacgacaatcagaacctgagggtggccaagatcagcatgcccgtgaacacccctggccagttcgaggacttcttccccgcatcctcccgggaccagagcagctacctgcagggcttcagccggaataccctggaagccgccttcaacgccgagttcaacgagatcagacgggtgctgctggaagagaacgctggcggagagcaggaagaacggggccagagaagatggtccaccagaagcagcgagaacaacgagggcgtgatcgtgaaggtgtccaaagaacacgtggaagaactgaccaagcacgccaagagcgtgtccaagaagggctccgaggaagagggggacatcaccaaccccatcaatctgagagagggcgagcccgacctgagcaacaacttcggcaagctgttcgaagtgaagcccgacaagaagaacccccagctgcaggacctggacatgatgctgacctgcgtggaaatcaaagagggggccctgatgctgccacacttcaactccaaagccatggtcatcgtggtcgtgaacaagggcaccggcaacctggaactggtggccgtgcggaaagagcagcagcagagaggccgcagagaggaagaagaggacgaggacgaagaagaagagggatccaaccgggaagtgcggcggtacaccgccagactgaaagaaggcgacgtgttcatcatgcctgccgcccaccccgtggccatcaatgcctctagcgagctgcatctgctgggcttcggcattaacgccgagaacaatcaccggatctttctggccggcgacaaagacaacgtgatcgaccagatcgagaagcaggccaaggacctggcctttcccggctctggcgaacaagtggaaaagctgatcaagaaccagaaagaaagccacttcgtgtccgccagaccccagagccagtctcagagccctagctcccccgagaaagagtctcctgagaaagaggaccaggaagaggaaaaccagggcggcaagggccctctgctgagcatcctgaaggccttcaatggcggcggaggcaggcagcagtgggaactgcagggcgacagaagatgccagtcccagctggaacgggccaacctgaggccttgcgagcagcacctgatgcagaaaatccagcgcgacgaggacagctacggccgggatccttacagccccagccaggacccttactcccctagccaggatcccgacagaagggacccctacagccctagcccctacgatagaagaggcgccggaagcagccagcaccaggaaagatgctgcaacgagctgaacgagtttgagaacaaccagcgctgcatgtgcgaggccctgcagcagatcatggaaaatcagagcgaccggctgcagggacggcagcaggaacagcagttcaagagagagctgcggaacctgccccagcagtgtggactgagagccccccagagatgcgacctggaagtggaaagcggcggcagagatcggtacggcggagggggcgtgaccttcagacagggcggagaagagaatgagtgccagtttcagcggctgaacgcccagaggcccgacaacagaatcgagagcgagggcggctacatcgagacatggaaccccaacaaccaggaatttcagtgcgctggggtggccctgagcaggaccgtgctgagaagaaatgccctgaggcggcccttctacagcaacgcccccctggaaatctacgtgcagcagggcagcggctacttcggcctgatctttcccggatgcccctccacctatgaggaacccgctcaggaaggcagacggtatcagagccagaagcctagcagacggttccaagtgggccaggacgatcccagccaacagcagcaggactctcaccagaaggtgcaccgcttcgacgagggcgacctgatcgctgtgccaaccggcgtggccttctggatgtacaacgacgaggataccgacgtcgtgaccgtgaccctgagcgacaccagctccatccacaaccagctggaccagttccccaggcggttttacctggccggcaatcaggaacaggaatttctgagataccagcagcagcagggctccagaccccactacagacagatcagccctagagtgcggggcgacgaacaggaaaatgagggcagcaacatcttctccggctttgcccaggaatttctgcagcacgccttccaggtggaccggcagaccgtggaaaacctgagaggcgagaacgagagagaggaacagggcgccatcgtgactgtgaagggcggcctgaggatcctgagccccgacgaagaggatgagtcctctagaagcccccccaaccgccgggaagagttcgatgaggaccgcagcagacctcagcagcgggggaagtacgacgagaacaggcggggctacaagaacggcatcgaggaaacaatctgcagcgccagcgtgaagaagaatctgggccggtccagcaaccccgacatctacaatccacaggccggcagcctgcggagcgtgaacgaactggatctgcccatcctgggatggctgggcctgtctgcccagcacggcaccatctaccggaacgccatgttcgtgcctcactacaccctgaatgcccacaccatcgtggtggctctgaacggccgcgcccacgtccaagtggtggacagcaacggcaatcgggtgtacgatgaagaactgcaggaaggacacgtcctggtggtgccccagaattttgccgtggccgccaaggcccagtccgagaactatgagtatctggccttcaagaccgacagccggccctctatcgccaatcaagccggcgagaacagcatcatcgacaacctgcccgaggaagtggtggccaacagctaccggctgcctagagagcaggcccggcagctgaagaacaacaaccctttcaagttcttcgtgcccccattcgaccaccagagcatgagagaggtggccgaattcacgctgatccccatcgctgtgggtggtgccctggcggggctggtcctcatcgtcctcatcgcctacctcgtcggcaggaagaggagtcacgcaggctaccagactatctag

SEQ ID NO：22–LAMP-3(DC-LAMP)氨基酸序列

信號(hào)：(1)..(27)

穩(wěn)定化：(28)..(381)

TM/CYTO：(382)..(416)

MPRQLSAAAALFASLAVILHDGSQMRAKAFPETRDYSQPTAAATVQDIKKPVQQPAKQAPHQTLAARFMDGHITFQTAATVKIPTTTPATTKNTATTSPITYTLVTTQATPNNSHTAPPVTEVTVGPSLAPYSLPPTITPPAHTTGTSSSTVSHTTGNTTQPSNQTTLPATLSIALHKSTTGQKPVQPTHAPGTTAAAHNTTRTAAPASTVPGPTLAPQPSSVKTGIYQVLNGSRLCIKAEMGIQLIVQDKESVFSPRRYFNIDPNATQASGNCGTRKSNLLLNFQGGFVNLTFTKDEESYYISEVGAYLTVSDPETIYQGIKHAVVMFQTAVGHSFKCVSEQSLQLSAHLQVKTTDVQLQAFDFEDDHFGNVDECSSDYTIVLPVIGAIVVGLCLMGMGVYKIRLRCQSSGYQRI

SEQ ID NO：23-LAMP2氨基酸序列

信號(hào)：(1)..(28)

穩(wěn)定化：(29)..(375)

TM/CYTO：(376)..(408)

MVCFRLFPVPGSGLVLVCLVLGAVRSYALELNLTDSENATCLYAKWQMNFTVRYETTNKTYKTVTISDHGTVTYNGSICGDDQNGPKIAVQFGPGFSWIANFTKAASTYSIDSVSFSYNTGDNTTFPDAEDKGILTVDELLAIRIPLNDLFRCNSLSTLEKNDVVQHYWDVLVQAFVQNGTVSTNEFLCDKDKTSTVAPTIHTTVPSPTTTPTPKEKPEAGTYSVNNGNDTCLLATMGLQLNITQDKVASVININPNTTHSTGSCRSHTALLRLNSSTIKYLDFVFAVKNENRFYLKEVNISMYLVNGSVFSIANNNLSYWMPPSSYMCNKEQTVSVSGAFQINTFDLRVQPFNVTQGKYSTAQDCSADDDNFLVPIAVGAALAGVLILVLLAYFIGLKHHHAGYEQF

SEQ ID NO：24-LIMP II氨基酸序列

信號(hào)：(5)..(27)

穩(wěn)定化：(28)..(433)

TM/CYTO：(434)..(478)

MGRCCFYTAGTLSLLLLVTSVTLLVARVFQKAVDQSIEKKIVLRNGTEAFDSWEKPPLPVYTQFYFFNVTNPEEILRGETPRVEEVGPYTYRELRNKANIQFGDNGTTISAVSNKAYVFERDQSVGDPKIDLIRTLNIPVLTVIEWSQVHFLREIIEAMLKAYQQKLFVTHTVDELLWGYKDEILSLIHVFRPDISPYFGLFYEKNGTNDGDYVFLTGEDSYLNFTKIVEWNGKTSLDWWITDKCNMINGTDGDSFHPLITKDEVLYVFPSDFCRSVYITFSDYESVQGLPAFRYKVPAEILANTSDNAGFCIPEGNCLGSGVLNVSICKNGAPIIMSFPHFYQADERFVSAIEGMHPNQEDHETFVDINPLTGIILKAAKRFQINIYVKKLDDFVETGDIRTMVFPVMYLNESVHIDKETASRLKSMINTTLIITNIPYIIMALGVFFGLVFTWLACKGQGSMDEGTADERAPLIRT

SEQ ID NO：25-ENDOLYN氨基酸序列

信號(hào)：(1)..(24)

穩(wěn)定化：(25)..(162)

TM/CYTO：(163)..(197)

MSRLSRSLLWAATCLGVLCVLSADKNTTQHPNVTTLAPISNVTSAPVTSLPLVTTPAPETCEGRNSCVSCFNVSVVNTTCFWIECKDESYCSHNSTVSDCQVGNTTDFCSVSTATPVPTANSTAKPTVQPSPSTTSKTVTTSGTTNNTVTPTSQPVRKSTFDAASFIGGIVLVLGVQAVIFFLYKFCKSKERNYHTL

SEQ ID NO：26–AraH3del核苷酸序列

gtgaccttcagacagggcggagaagagaatgagtgccagtttcagcggctgaacgcccagaggcccgacaacagaatcgagagcgagggcggctacatcgagacatggaaccccaacaaccaggaatttcagtgcgctggggtggccctgagcaggaccgtgctgagaagaaatgccctgaggcggcccttctacagcaacgcccccctggaaatctacgtgcagcagggcagcggctacttcggcctgatctttcccggatgcccctccacctatgaggaacccgctcaggaaggcagacggtatcagagccagaagcctagcagacggttccaagtgggccaggacgatcccagccaacagcagcaggactctcaccagaaggtgcaccgcttcgacgagggcgacctgatcgctgtgccaaccggcgtggccttctggatgtacaacgacgaggataccgacgtcgtgaccgtgaccctgagcgacaccagctccatccacaaccagctggaccagttccccaggcggttttacctggccggcaatcaggaacaggaatttctgagataccagcagcagcagggctccagaccccactacagacagatcagccctagagtgcggggcgacgaacaggaaaatgagggcagcaacatcttctccggctttgcccaggaatttctgcagcacgccttccaggtggaccggcagaccgtggaaaacctgagaggcgagaacgagagagaggaacagggcgccatcgtgactgtgaagggcggcctgaggatcctgagccccgacgaagaggatgagtcctctagaagcccccccaaccgccgggaagagttcgatgaggaccgcagcagacctcagcagcgggggaagtacgacgagaacaggcggggctacaagaac

SEQ ID NO：27–AraH3del-LAMP核苷酸序列

信號(hào)：(1)..(86)

穩(wěn)定化：(87)..(1146)

ARAH3del：(1147)..(2064)

TM/CYTO：(2065)..(2181)

atggcgccccgcagcgcccggcgacccctgctgctgctactgctgttgctgctgctcggcctcatgcattgtgcgtcagcagcaatgtttatggtgaaaaatggcaacgggaccgcgtgcataatggccaacttctctgctgccttctcagtgaactacgacaccaagagtggccctaagaacatgacccttgacctgccatcagatgccacagtggtgctcaaccgcagctcctgtggaaaagagaacacttctgaccccagtctcgtgattgcttttggaagaggacatacactcactctcaatttcacgagaaatgcaacacgttacagcgtccagctcatgagttttgtttataacttgtcagacacacaccttttccccaatgcgagctccaaagaaatcaagactgtggaatctataactgacatcagggcagatatagataaaaaatacagatgtgttagtggcacccaggtccacatgaacaacgtgaccgtaacgctccatgatgccaccatccaggcgtacctttccaacagcagcttcagccggggagagacacgctgtgaacaagacaggccttccccaaccacagcgccccctgcgccacccagcccctcgccctcacccgtgcccaagagcccctctgtggacaagtacaacgtgagcggcaccaacgggacctgcctgctggccagcatggggctgcagctgaacctcacctatgagaggaaggacaacacgacggtgacaaggcttctcaacatcaaccccaacaagacctcggccagcgggagctgcggcgcccacctggtgactctggagctgcacagcgagggcaccaccgtcctgctcttccagttcgggatgaatgcaagttctagccggtttttcctacaaggaatccagttgaatacaattcttcctgacgccagagaccctgcctttaaagctgccaacggctccctgcgagcgctgcaggccacagtcggcaattcctacaagtgcaacgcggaggagcacgtccgtgtcacgaaggcgttttcagtcaatatattcaaagtgtgggtccaggctttcaaggtggaaggtggccagtttggctctgtggaggagtgtctgctggacgagaacagcctcgaggtgaccttcagacagggcggagaagagaatgagtgccagtttcagcggctgaacgcccagaggcccgacaacagaatcgagagcgagggcggctacatcgagacatggaaccccaacaaccaggaatttcagtgcgctggggtggccctgagcaggaccgtgctgagaagaaatgccctgaggcggcccttctacagcaacgcccccctggaaatctacgtgcagcagggcagcggctacttcggcctgatctttcccggatgcccctccacctatgaggaacccgctcaggaaggcagacggtatcagagccagaagcctagcagacggttccaagtgggccaggacgatcccagccaacagcagcaggactctcaccagaaggtgcaccgcttcgacgagggcgacctgatcgctgtgccaaccggcgtggccttctggatgtacaacgacgaggataccgacgtcgtgaccgtgaccctgagcgacaccagctccatccacaaccagctggaccagttccccaggcggttttacctggccggcaatcaggaacaggaatttctgagataccagcagcagcagggctccagaccccactacagacagatcagccctagagtgcggggcgacgaacaggaaaatgagggcagcaacatcttctccggctttgcccaggaatttctgcagcacgccttccaggtggaccggcagaccgtggaaaacctgagaggcgagaacgagagagaggaacagggcgccatcgtgactgtgaagggcggcctgaggatcctgagccccgacgaagaggatgagtcctctagaagcccccccaaccgccgggaagagttcgatgaggaccgcagcagacctcagcagcgggggaagtacgacgagaacaggcggggctacaagaacgaattcacgctgatccccatcgctgtgggtggtgccctggcggggctggtcctcatcgtcctcatcgcctacctcgtcggcaggaagaggagtcacgcaggctaccagactatctag

SEQ ID NO：28–AraH3-LAMP氨基酸序列

信號(hào)：(1)..(27)

穩(wěn)定化：(28)..(380)

ARAH3：(381)..(884)

TM/CYTO：(885)..(912)

MAPRSARRPLLLLLLLLLLGLMHCASAAMFMVKNGNGTACIMANFSAAFSVNYDTKSGPKNMTLDLPSDATVVLNRSSCGKENTSDPSLVIAFGRGHTLTLNFTRNATRYSVQLMSFVYNLSDTHLFPNASSKEIKTVESITDIRADIDKKYRCVSGTQVHMNNVTVTLHDATIQAYLSNSSFSRGETRCEQDRPSPTTAPPAPPSPSPSPVPKSPSVDKYNVSGTNGTCLLASMGLQLNLTYERKDNTTVTRLLNINPNKTSASGSCGAHLVTLELHSEGTTVLLFQFGMNASSSRFFLQGIQLNTILPDARDPAFKAANGSLRALQATVGNSYKCNAEEHVRVTKAFSVNIFKVWVQAFKVEGGQFGSVEECLLDENSLEVTFRQGGEENECQFQRLNAQRPDNRIESEGGYIETWNPNNQEFQCAGVALSRTVLRRNALRRPFYSNAPLEIYVQQGSGYFGLIFPGCPSTYEEPAQEGRRYQSQKPSRRFQVGQDDPSQQQQDSHQKVHRFDEGDLIAVPTGVAFWMYNDEDTDVVTVTLSDTSSIHNQLDQFPRRFYLAGNQEQEFLRYQQQQGSRPHYRQISPRVRGDEQENEGSNIFSGFAQEFLQHAFQVDRQTVENLRGENEREEQGAIVTVKGGLRILSPDEEDESSRSPPNRREEFDEDRSRPQQRGKYDENRRGYKNGIEETICSASVKKNLGRSSNPDIYNPQAGSLRSVNELDLPILGWLGLSAQHGTIYRNAMFVPHYTLNAHTIVVALNGRAHVQVVDSNGNRVYDEELQEGHVLVVPQNFAVAAKAQSENYEYLAFKTDSRPSIANQAGENSIIDNLPEEVVANSYRLPREQARQLKNNNPFKFFVPPFDHQSMREVAEFTLIPIAVGGALAGLVLIVLIAYLVGRKRSHAGYQTI

SEQ ID NO：29–LAMP1核苷酸序列

信號(hào)：(1)..(81)

穩(wěn)定化：(82)..(1140)

TM/CYTO：(1141)..(1251)

atggcgccccgcagcgcccggcgacccctgctgctgctactgctgttgctgctgctcggcctcatgcattgtgcgtcagcagcaatgtttatggtgaaaaatggcaacgggaccgcgtgcataatggccaacttctctgctgccttctcagtgaactacgacaccaagagtggccctaagaacatgacccttgacctgccatcagatgccacagtggtgctcaaccgcagctcctgtggaaaagagaacacttctgaccccagtctcgtgattgcttttggaagaggacatacactcactctcaatttcacgagaaatgcaacacgttacagcgtccagctcatgagttttgtttataacttgtcagacacacaccttttccccaatgcgagctccaaagaaatcaagactgtggaatctataactgacatcagggcagatatagataaaaaatacagatgtgttagtggcacccaggtccacatgaacaacgtgaccgtaacgctccatgatgccaccatccaggcgtacctttccaacagcagcttcagccggggagagacacgctgtgaacaagacaggccttccccaaccacagcgccccctgcgccacccagcccctcgccctcacccgtgcccaagagcccctctgtggacaagtacaacgtgagcggcaccaacgggacctgcctgctggccagcatggggctgcagctgaacctcacctatgagaggaaggacaacacgacggtgacaaggcttctcaacatcaaccccaacaagacctcggccagcgggagctgcggcgcccacctggtgactctggagctgcacagcgagggcaccaccgtcctgctcttccagttcgggatgaatgcaagttctagccggtttttcctacaaggaatccagttgaatacaattcttcctgacgccagagaccctgcctttaaagctgccaacggctccctgcgagcgctgcaggccacagtcggcaattcctacaagtgcaacgcggaggagcacgtccgtgtcacgaaggcgttttcagtcaatatattcaaagtgtgggtccaggctttcaaggtggaaggtggccagtttggctctgtggaggagtgtctgctggacgagaacagcacgctgatccccatcgctgtgggtggtgccctggcggggctggtcctcatcgtcctcatcgcctacctcgtcggcaggaagaggagtcacgcaggctaccagactatctag

SEQ ID NO：30–LAMP1氨基酸序列

信號(hào)：(1)..(27)

穩(wěn)定化：(28)..(380)

TM/CYTO：(381)..(416)

MAPRSARRPLLLLLLLLLLGLMHCASAAMFMVKNGNGTACIMANFSAAFSVNYDTKSGPKNMTLDLPSDATVVLNRSSCGKENTSDPSLVIAFGRGHTLTLNFTRNATRYSVQLMSFVYNLSDTHLFPNASSKEIKTVESITDIRADIDKKYRCVSGTQVHMNNVTVTLHDATIQAYLSNSSFSRGETRCEQDRPSPTTAPPAPPSPSPSPVPKSPSVDKYNVSGTNGTCLLASMGLQLNLTYERKDNTTVTRLLNINPNKTSASGSCGAHLVTLELHSEGTTVLLFQFGMNASSSRFFLQGIQLNTILPDARDPAFKAANGSLRALQATVGNSYKCNAEEHVRVTKAFSVNIFKVWVQAFKVEGGQFGSVEECLLDENSTLIPIAVGGALAGLVLIVLIAYLVGRKRSHAGYQTI