一種花生致敏蛋白Arah2標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法
【專利摘要】一種花生致敏蛋白Arah2標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，屬于蛋白的制備方法。其包括以下工藝步驟：1）脫脂；2）粗提液的制備；3）硫酸銨分級沉淀；4）等電點沉淀；5）透析；6）離子交換層析；7）免疫親和層析。本發(fā)明通過液氮超微粉碎，低溫離心，有機脫脂萃取等多種方法相結(jié)合制得脫脂花生蛋白粉，最大程度的保留了其生物活性，并通過硫酸銨沉淀，等電點沉淀，離子交換層析和結(jié)合單抗的免疫親和層析，最大程度的提高了花生過敏原的純度和免疫活性，并可達(dá)到了規(guī)?；苽涞囊?。
【專利說明】一種花生致敏蛋白Arah2標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于蛋白的制備方法，具體涉及一種花生致敏蛋白Arah2標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]食物過敏反應(yīng)被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為當(dāng)前世界性的重大衛(wèi)生學(xué)問題。花生是最常見的八大食品過敏原之一，且為八大類容易引起過敏的食品之首，花生過敏屬于即時性過敏，發(fā)生率較高，與其他食物過敏的不同之處在于，它是一種終身性的疾患，不會隨著年齡的增長而產(chǎn)生免疫耐受，有時可引起過敏性休克，甚至危及生命，已成為全球范圍內(nèi)關(guān)心的問題。研究花生過敏原的檢測與控制，必須首先獲得高純度的過敏原組分，它可以更為細(xì)致地了解花生過敏原的生化特性及各種加工過程對其致敏性的影響提供實驗材料，從而有助于低過敏或無致敏的花生制品的研究以及花生過敏原的檢測。南昌大學(xué)張英坤(2007)在其碩士畢業(yè)論文《抗花生過敏原Arah2多克隆抗體的制備及其應(yīng)用》中介紹了一種制備Arah2花生過敏原的方法，他以四粒紅花生為實驗對象，經(jīng)粉碎、脫脂、蛋白抽提、陰離子交換層析、SDS-PAGE電泳回收，得到了電泳純(純度>95%)的Arah2。但是該方法只試用于實驗室小試產(chǎn)品，未能達(dá)到規(guī)模化制備要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計提供一種花生致敏蛋白Arah2標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法的技術(shù)方案。
[0004]所述的一種花生致敏蛋白Arah2標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，其特征在于包括以下工藝步驟:
1)脫脂
取花生種子烘烤后依次進(jìn)行去紅皮、粉碎、正己烷脫脂、離心、風(fēng)干和過篩，得到花生
粉；
2)粗提液的制備
取花生粉以10ml/g加入至pH8.0、濃度0.5M的Tris-HCL溶液中混合，超微粉碎、超速離心，得到花生蛋白上清液；
3)硫酸銨分級沉淀
取花生蛋白上清液緩慢加入硫酸銨，邊加邊攪拌，直至溶液中硫酸銨飽和度達(dá)30%，靜置，離心；離心后的上清液中繼續(xù)緩慢加入硫酸銨直至飽和度達(dá)50%，靜置，離心；離心后的上清液中繼續(xù)緩慢加入硫酸銨直至飽和度達(dá)70%，靜置，離心；收集沉淀，用pH 7.4、濃度0.01mol/L的PBS緩沖液復(fù)溶，4°C保存，得到沉淀復(fù)溶物I ;
4)等電點沉淀
取沉淀復(fù)溶物I加lmol/1的HCL至等電點為5.2，靜置、離心；沉淀用pH 7.4、濃度0.01mol/L的PBS緩沖液復(fù)溶，4°C保存，得到沉淀復(fù)溶物II ； 5)透析
取沉淀復(fù)溶物II裝入透析袋中，用PEG20000透析，得到花生蛋白粗提液；
6)離子交換層析
米用 DEAE-Sepharose Fast Flow 離子柱層析,用 pH8.0、濃度 50mol/L Tris-HCl 緩沖溶液平衡，以0.3mol/L NaCl洗脫溶液進(jìn)行洗脫，蠕動泵流速lml/min，5min間隔自動收集，檢測280nm吸收，收集洗脫液，透析，濃縮，得到花生致敏粗蛋白；
7)免疫親和層析
制備免疫親和柱，將花生致敏粗蛋白經(jīng)偶聯(lián)了抗Arah2致敏蛋白的單克隆抗體的免疫親和柱層析，以PH2.4、濃度0.1 mol/ L的glycine-HCL溶液洗脫，洗脫速度為0.5?2ml/min,收集洗脫液，得到花生致敏蛋白Arah2標(biāo)準(zhǔn)品。
[0005]所述的一種花生致敏蛋白Arah2標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，其特征在于所述的步驟I)中取花生種子在60°C的烘箱中烘烤6小時，去紅皮，液氮凍融后用粉碎機粉碎，按照花生粉末質(zhì)量:正己烷體積為1:2進(jìn)行-20°C過夜萃取，4°C下10000r/m離心lOmin，傾去正己烷，脫脂粉風(fēng)干后過60目篩，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0006]所述的一種花生致敏蛋白Arah2標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，其特征在于所述的步驟2)中超微粉碎條件:200W的超聲破碎儀中超聲100s，每次5s，間隔Is ;超速離心條件:4°C下10000-12000r/min 離心 10_15min。
[0007]所述的一種花生致敏蛋白Arah2標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，其特征在于所述的步驟3)和
4)中靜置條件為:4°C靜置8h ;離心條件為:4°C下10000-12000r/min離心10_15min。
[0008]所述的一種花生致敏蛋白Arah2標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，其特征在于所述的步驟5)中透析條件為4°C透析6h。
[0009]所述的一種花生致敏蛋白Arah2標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，其特征在于所述的步驟7)中制備免疫親和柱具體包括:
a處理凝膠 b偶聯(lián)抗體
更換抗體緩沖液:把純化的抗Arah2致敏蛋白的單克隆抗體在偶聯(lián)緩沖液中進(jìn)行透
析；
偶聯(lián):用一個帶有塞子的玻璃容器，把準(zhǔn)備好的介質(zhì)懸浮液加到含抗體的偶聯(lián)緩沖液中，然后上下顛倒均勻，室溫I h或者是4°C過夜，利用紫外分光光度計測定溶液中剩余抗體的方法評定免疫親和柱的偶聯(lián)率；
洗滌:用至少5倍凝膠介質(zhì)體積的偶聯(lián)緩沖液清洗多余的抗體；
封閉:將偶聯(lián)抗體的凝膠轉(zhuǎn)移到封閉緩沖液中，在4°C條件下過夜或者在室溫條件下放置2 h，封閉任何活化的集團(tuán)，或者是放置于pH8.0、濃度0.1 M的Tris-HCl緩沖液中，放置2h ；
平衡:用至少三種不同pH的緩沖液循環(huán)洗滌介質(zhì)，每一種緩沖液至少是5倍的介質(zhì)體積，每一次循環(huán)清洗都應(yīng)包含有0.1M的乙酸/乙酸鈉，后面緊接著用0.1 M Tris-HCl ；c填裝親和柱
將偶聯(lián)好抗體的免疫親和介質(zhì)填裝到層析柱中，最后將混合膜按照柱子孔徑大小進(jìn)行裁剪，放入柱中，與凝膠界面緊貼。[0010]本發(fā)明通過液氮超微粉碎，低溫離心，有機脫脂萃取等多種方法相結(jié)合制得脫脂花生蛋白粉，最大程度的保留了其生物活性，并通過硫酸銨沉淀，等電點沉淀，離子交換層析和結(jié)合單抗的免疫親和層析，最大程度的提高了花生過敏原的純度和免疫活性，并可達(dá)到了規(guī)?；苽涞囊蟆?br> 【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為花生蛋白免疫層析后圖，其中M為Maker，2為實施例1中0.1 mol/ L的glycine-HCL溶液洗脫后所收集的峰液。
【具體實施方式】
[0012]以下結(jié)合實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0013]實施例1:一種花生致敏蛋白Arah2標(biāo)準(zhǔn)品的制備 I)脫脂
取花生種子在60°C的烘箱中烘烤6小時，去紅皮，液氮凍融后用粉碎機粉碎，按照花生粉末質(zhì)量:正己烷體積為1:2進(jìn)行-20°C過夜萃取，4°C下10000r/m離心lOmin，傾去正己烷，脫脂粉風(fēng)干后過60目篩，4°C保存?zhèn)溆茫玫交ㄉ邸?br> [0014]2)粗提液的制備
花生粉以 10ml/g 加入 ph8.0、濃度 0.5M 的 Tris-HCL(含 lmol/L NaCl，8mol/L 尿素，0.07% β -巰基乙醇0.5mg/ml EDTA)，漩渦混合器混合，在200W的超聲破碎儀中超聲100s，每次5s，間隔Is (為了破碎細(xì)胞)，然后超速離心(10000-12000r，4°C，10_15min)以去除脂肪，得到花生蛋白上清液。
[0015]3)硫酸銨分級沉淀
花生蛋白上清液中緩慢加入硫酸銨，邊加邊攪拌，直至溶液中硫酸銨飽和度達(dá)30%，40C靜置8h，4°C 10000-12000r/min離心10_15min，離心后的上清液中繼續(xù)緩慢加入硫酸銨直至飽和度達(dá)50%，4°C靜置8h，4°C 10000-12000r/min離心10_15min，離心后的上清液中繼續(xù)緩慢加入硫酸銨直至飽和度達(dá)70%，4°C靜置8h，4°C 10000-12000r/min離心lOmin，收集沉淀，用0.01mol/L (pH 7.4)的PBS緩沖液復(fù)溶，4°C保存，得到沉淀復(fù)溶物I。
[0016]4)等電點沉淀
在PH計的監(jiān)控下等電點沉淀，沉淀復(fù)溶物I加lmol/1的HCL至pI5.2，4°C下靜置8h，4°C 10000-12000r/min 離心 10_15min，所得的沉淀用 0.01mol/L (pH 7.4)的 PBS 緩沖液復(fù)溶，4°C保存，得到沉淀復(fù)溶物II。
[0017]5)透析
取沉淀復(fù)溶物II裝入透析袋中，用PEG20000于4°C透析6h，得到花生蛋白粗提液。
[0018]6)離子交換層析
采用陰離子交換樹脂DEAE-Sepharose Fast Flow(16X250mm)進(jìn)行分離,花生蛋白粗提液上柱前，用 pH8.0、濃度 50mol/L Tris-HCl 緩沖溶液平衡 DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱，花生粗提液上柱后，280nm檢測蛋白峰，用O?lmol/L NaCl連續(xù)梯度洗脫，收集
0.3mol/L NaCl洗脫溶液，透析，濃縮，得到花生致敏粗蛋白。
[0019]8)免疫親和層析。[0020]制備免疫親和柱，用ρΗ2.4、濃度0.1 mol/ L的glycine-HCL溶液(7.5甘氨酸用蒸餾水溶解，調(diào)PH2.4，并定容IL作為洗脫液，洗脫流速為0.5?2ml/min，收集洗脫液，得到花生致敏蛋白Arah2標(biāo)準(zhǔn)品。
[0021]其中制備免疫親和柱具體包括: a處理凝膠
b偶聯(lián)抗體
更換抗體緩沖液:把純化的抗Ar ah 2致敏蛋白的單克隆抗體在偶聯(lián)緩沖液中進(jìn)行透析，所述的偶聯(lián)緩沖液為:0.2 mo I/L NaHCO3,包含0.5mol/L的NaCl，配制:稱取16.8gNaHC03, 29.22gNaCl 溶解到 IL 蒸餾水中，調(diào) pH8.3 ；
偶聯(lián):用一個帶有塞子的玻璃容器，把準(zhǔn)備好的介質(zhì)懸浮液加到含抗體的偶聯(lián)緩沖液中，然后上下顛倒均勻，室溫I h或者是4°C過夜，利用紫外分光光度計測定溶液中剩余抗體的方法評定免疫親和柱的偶聯(lián)率；
洗滌:用至少5倍凝膠介質(zhì)體積的偶聯(lián)緩沖液清洗多余的抗體；
封閉:將偶聯(lián)抗體的凝膠轉(zhuǎn)移到封閉緩沖液中，在4°C條件下過夜或者在室溫條件下放置2 h，封閉任何活化的集團(tuán)，或者是放置于pH8.0，0.1 M的Tris-HCl緩沖液中，放置2h，所述的封閉緩沖液為:0.2molL甘氨酸，配制:稱取15.014g甘氨酸，，用蒸餾水溶解，調(diào)ρΗ8.0,并定容到I L ；
平衡:用至少三種不同pH的緩沖液循環(huán)洗滌介質(zhì)，每一種緩沖液至少是5倍的介質(zhì)體積，每一次循環(huán)清洗都應(yīng)包含有0.1M的乙酸/乙酸鈉，后面緊接著是用0.1 M Tris-HCl ；c填裝親和柱
將偶聯(lián)好抗體的免疫親和介質(zhì)填裝到層析柱中，最后將混合膜按照柱子孔徑大小進(jìn)行裁剪，放入柱中，與凝膠界面緊貼。
[0022]實施例2:花生蛋白過敏原Arah2的SDS-PAGE鑒定
對實施例1得到的花生致敏蛋白Arah2標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行SDS-PAGE電泳法分析主要過敏原組分鑒定。結(jié)果如圖1所示。
[0023]圖1中花生蛋白相對分子量為19Kda處條帶明顯，與文獻(xiàn)報道一致，確定該蛋白為花生蛋白過敏原Arah2。
[0024]實施例3:用ELISA測定抗體效價
1、包被:將酶標(biāo)板每孔加入100μ I制備的過敏蛋白液(用0.05mol/L, pH9.6的NaCO3-NaHCO3緩沖液從lg/L倍稀釋)，4°C，靜置過夜。取出，用0.1 mol/L、ρΗ7.4的PBSTween緩沖液(含0.5 mol/L Tween-20)滿孔洗滌3次，扣干。
[0025]2、封閉:每孔加 250 μ I 10g/L BSA-PBS 溶液(溶于 0.01mol/L, PBS, ρΗ7.4)進(jìn)行封閉，37°C保溫2h，棄去封閉液，PBST洗滌3次，每次lmin，扣干；
3、加抗體:將抗體用lg/L BSA-PBS溶液倍比稀釋，每孔加100 μ I不同稀釋度抗體，做3個平行，37°C孵育Ih0 PBS Tween洗滌，扣干3次。
[0026]4、加酶標(biāo)二抗:每孔加100 μ I羊抗兔IgG-HRP結(jié)合物(用IL BSA-PBS溶液按體積比1:6000稀釋)，37°C孵育0.5h，然后用PBST緩沖液洗滌扣干3次。
[0027]5、顯色反應(yīng):每孔加入配制好的四甲基聯(lián)苯二胺底物液100 μ I孵育15min,取出，立即加入50 μ I 2mol/L H2S04終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀側(cè)A450值。[0028]6、效價確定:以陰性血清的吸光值為基準(zhǔn)，陽性O(shè)D值大于陰性O(shè)D值的3倍，且od
值大于0.25所對應(yīng)的抗血清的稀釋度即為該血清效價。通過下表的實驗結(jié)果，可知以新西
蘭大白兔為模式動物，使用實施例1制得的花生過敏原制備的抗體，效價達(dá)到1:81000。
花生過敏原Arah2標(biāo)準(zhǔn)物免疫后兔血清效價的測定
【權(quán)利要求】
1.一種花生致敏蛋白Arah2標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，其特征在于包括以下工藝步驟: 1)脫脂 取花生種子烘烤后依次進(jìn)行去紅皮、粉碎、正己烷脫脂、離心、風(fēng)干和過篩，得到花生粉； 2)粗提液的制備 取花生粉以10ml/g加入至pH8.0、濃度0.5M的Tris-HCL溶液中混合，超微粉碎、超速離心，得到花生蛋白上清液； 3)硫酸銨分級沉淀 取花生蛋白上清液緩慢加入硫酸銨，邊加邊攪拌，直至溶液中硫酸銨飽和度達(dá)30%，靜置，離心；離心后的上清液中繼續(xù)緩慢加入硫酸銨直至飽和度達(dá)50%，靜置，離心；離心后的上清液中繼續(xù)緩慢加入硫酸銨直至飽和度達(dá)70%，靜置，離心；收集沉淀，用pH 7.4、濃度0.01mol/L的PBS緩沖液復(fù)溶，4°C保存，得到沉淀復(fù)溶物I ; 4)等電點沉淀 取沉淀復(fù)溶物I加lmol/1的HCL至等電點為5.2，靜置、離心；沉淀用pH 7.4、濃度0.01mol/L的PBS緩沖液 復(fù)溶，4°C保存，得到沉淀復(fù)溶物II ； 5)透析 取沉淀復(fù)溶物II裝入透析袋中，用PEG20000透析，得到花生蛋白粗提液； 6)離子交換層析 米用 DEAE-Sepharose Fast Flow 離子柱層析,用 pH8.0、濃度 50mol/L Tris-HCl 緩沖溶液平衡，以0.3mol/L NaCl洗脫溶液進(jìn)行洗脫，蠕動泵流速lml/min，5min間隔自動收集，檢測280nm吸收，收集洗脫液，透析，濃縮，得到花生致敏粗蛋白； 7)免疫親和層析 制備免疫親和柱，將花生致敏粗蛋白經(jīng)偶聯(lián)了抗Arah2致敏蛋白的單克隆抗體的免疫親和柱層析，以PH2.4、濃度0.1 mol/ L的glycine-HCL溶液洗脫，洗脫速度為0.5~2ml/min,收集洗脫液，得到花生致敏蛋白Arah2標(biāo)準(zhǔn)品。
2.如權(quán)利要求1所述的一種花生致敏蛋白Arah2標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，其特征在于所述的步驟I)中取花生種子在60°C的烘箱中烘烤6小時，去紅皮，液氮凍融后用粉碎機粉碎，按照花生粉末質(zhì)量:正己烷體積為1:2進(jìn)行-20°C過夜萃取，4°C下10000r/m離心lOmin，傾去正己烷，脫脂粉風(fēng)干后過60目篩，4°C保存?zhèn)溆谩?br> 3.如權(quán)利要求1所述的一種花生致敏蛋白Arah2標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，其特征在于所述的步驟2)中超微粉碎條件:200W的超聲破碎儀中超聲100s，每次5s，間隔Is ;超速離心條件:4°C下 10000-12000r/min 離心 10_15min。
4.如權(quán)利要求1所述的一種花生致敏蛋白Arah2標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，其特征在于所述的步驟3)和4)中靜置條件為:4°C靜置8h ;離心條件為:4°C下10000-12000r/min離心10_15mino
5.如權(quán)利要求1所述的一種花生致敏蛋白Arah2標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，其特征在于所述的步驟5)中透析條件為4°C透析6h。
6.如權(quán)利要求1所述的一種花生致敏蛋白Arah2標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，其特征在于所述的步驟7)中制備免疫親和柱具體包括:a處理凝膠 b偶聯(lián)抗體 更換抗體緩沖液:把純化的抗Arah2致敏蛋白的單克隆抗體在偶聯(lián)緩沖液中進(jìn)行透析； 偶聯(lián):用一個帶有塞子的玻璃容器，把準(zhǔn)備好的介質(zhì)懸浮液加到含抗體的偶聯(lián)緩沖液中，然后上下顛倒均勻，室溫I h或者是4°C過夜，利用紫外分光光度計測定溶液中剩余抗體的方法評定免疫親和柱的偶聯(lián)率； 洗滌:用至少5倍凝膠介質(zhì)體積的偶聯(lián)緩沖液清洗多余的抗體； 封閉:將偶聯(lián)抗體的凝膠轉(zhuǎn)移到封閉緩沖液中，在4°C條件下過夜或者在室溫條件下放置2 h，封閉任何活化的集團(tuán)，或者是放置于pH8.0、濃度0.1 M的Tris-HCl緩沖液中，放置2h ； 平衡:用至少三種不同pH的緩沖液循環(huán)洗滌介質(zhì)，每一種緩沖液至少是5倍的介質(zhì)體積，每一次循環(huán)清洗都應(yīng)包含有0.1M的乙酸/乙酸鈉，后面緊接著用0.1 M Tris-HCl ；c填裝親和柱 將偶聯(lián)好抗體的免疫親和介質(zhì)填裝到層析柱中，最后將混合膜按照柱子孔徑大小進(jìn)行裁剪，放入柱中，與 凝膠界面緊貼。
【文檔編號】G01N33/577GK103645328SQ201310691700
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月17日
【發(fā)明者】諸葛潔婧, 潘家榮, 潘文彬, 梁世正, 張弛, 馮濤 申請人:中國計量學(xué)院