一種測(cè)定乳基嬰幼兒配方粉中乳清蛋白含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種測(cè)定乳基嬰幼兒配方粉中乳清蛋白含量的方法，所述方法包括以下的步驟：①待檢樣品上樣液的制備；②酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液的制備；③聚丙烯酰胺凝膠電泳；④染色與脫色；⑤成像與計(jì)算。所述的方法準(zhǔn)確性高、操作簡(jiǎn)單、成本低，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的質(zhì)量和trace值作參比，無(wú)需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線即能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確檢測(cè)乳清蛋白的含量。
【專利說(shuō)明】一種測(cè)定乳基嬰幼兒配方粉中乳清蛋白含量的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體涉及一種測(cè)定乳基嬰幼兒配方粉中乳清蛋白含量的方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 牛乳中的蛋白質(zhì)可大致分為酪蛋白和乳清蛋白兩大類，其中酪蛋白占牛乳中蛋白 質(zhì)含量的約80%，酪蛋白由a Sl-酪蛋白、a S2-酪蛋白、￠-酪蛋白和K-酪蛋白四種蛋 白質(zhì)組成，且四種酪蛋白占總酪蛋白的比例分別為40%、10%、40%和10%，所述的百分比 為質(zhì)量百分比；乳清蛋白約占牛乳中蛋白質(zhì)含量的20%，乳清蛋白主要由P -乳球蛋白、 a _乳白蛋白、免疫球蛋白和血清白蛋白組成，分別約占總?cè)榍宓鞍椎?0%、20%、12%和 6%，所述的百分比為質(zhì)量百分比。乳清蛋白相比于酪蛋白能為嬰兒提供更高的營(yíng)養(yǎng)，另外 嬰兒的消化系統(tǒng)也更易消化乳清蛋白而非酪蛋白。成熟母乳中乳清蛋白和酪蛋白的比例為 60:40,為了使嬰兒配方粉更接近母乳，為嬰兒提供更有利于其生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)，我國(guó)市售的乳 基嬰兒配方粉都通過(guò)添加乳清蛋白來(lái)調(diào)整乳粉內(nèi)乳清蛋白的含量。
[0003] 對(duì)于乳粉內(nèi)乳清蛋白含量的檢測(cè)，目前國(guó)內(nèi)主要依據(jù)GB/T 5413. 2 1997,該法檢 測(cè)時(shí)用光密度計(jì)來(lái)檢測(cè)不同蛋白的光密度，最后通過(guò)計(jì)算不同蛋白的光密度來(lái)計(jì)算乳清蛋 白的含量。光密度檢測(cè)法存在一定的缺陷，因?yàn)椴煌牡鞍捉Y(jié)合考馬斯亮藍(lán)的能力不同，即 使在蛋白質(zhì)濃度相同的情況下，不同蛋白仍會(huì)表現(xiàn)出不同的光密度值，因此僅用蛋白質(zhì)光 密度掃描的trace值來(lái)計(jì)算乳清蛋白的含量，會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度較低，誤差較大。因 此需要探尋一種更加準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單、成本低、且能適用于乳基嬰幼兒配方粉這一復(fù)雜體系 中乳清蛋白含量的檢測(cè)方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)中僅利用蛋白質(zhì)光密度掃描的trace 值來(lái)檢測(cè)乳粉中乳清蛋白含量時(shí)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度較低、誤差較大的缺陷，提供一種準(zhǔn)確性 高、操作簡(jiǎn)單、成本低的測(cè)定乳基嬰幼兒配方粉中乳清蛋白含量的方法。
[0005] 本發(fā)明提供一種測(cè)定乳基嬰幼兒配方粉中乳清蛋白含量的方法，所述方法包括以 下的步驟：
[0006] ①待檢樣品上樣液的制備：將待檢樣品攪拌并充分溶解于去離子水中，然后與 SDS-PAGE上樣緩沖液混合均勻，水浴煮沸，迅速移入到冰水中冷卻，即得所述待檢樣品上樣 液；所述待檢樣品指非水解的乳基嬰幼兒配方粉；
[0007] ②酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液的制備：將a -酪蛋白、0 -酪蛋白和 K-酪蛋白溶解于水得酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的混合樣；將￠-乳球蛋白、a-乳白蛋白和血清白蛋 白溶解于水得乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的混合樣；將所述酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的混合樣和所述乳清蛋白標(biāo) 準(zhǔn)品的混合樣分別和SDS-PAGE上樣緩沖液混合均勻，水浴煮沸，然后迅速移入到冰水中冷 卻，即得酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液和乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液；
[0008] ③聚丙烯酰胺凝膠電泳：將步驟①所述待檢樣品上樣液、步驟②所述酪蛋白標(biāo)準(zhǔn) 品上樣液和所述乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的上樣液上樣，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，得聚丙烯酰胺 凝膠；
[0009] ④染色與脫色：移出步驟③所述的聚丙烯酰胺凝膠，用染色液染色即得染色的凝 膠；將所述染色的凝膠用脫色液脫色至背景透明，即得脫色的凝膠；
[0010] ⑤成像與計(jì)算：將步驟④所述脫色的凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)，用圖像處理軟件 分析記錄所述待檢樣品對(duì)應(yīng)泳道各條帶的trace值，對(duì)照所述酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和所述乳清蛋 白標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)泳道各條帶的trace值，并根據(jù)步驟③所上樣的酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品或乳清蛋白標(biāo) 準(zhǔn)品的質(zhì)量，計(jì)算所述待檢樣品中乳清蛋白占總蛋白的比例，所述的trace值為SDS-PAGE 的光密度掃描圖譜內(nèi)蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)峰的峰面積。
[0011] 步驟①為，待檢樣品上樣液的制備：將待檢樣品攪拌并充分溶解于去離子水中，然 后與SDS-PAGE上樣緩沖液混合均勻，水浴煮沸，迅速移入到冰水中冷卻，即得所述待檢樣 品上樣液；所述待檢樣品指非水解的乳基嬰幼兒配方粉。其中，所述去離子水為本領(lǐng)域常規(guī) 的去離子水，較佳地為純水，更佳地為超純水。本發(fā)明中，所述的溶解是指在水中形成穩(wěn)定、 均一的體系。所述待檢樣品上樣液A的蛋白質(zhì)含量的終濃度為本領(lǐng)域常規(guī)的終濃度，較佳 地，在2mg/mL?4mg/mL范圍內(nèi)，更佳地為3mg/mL。所述SDS-PAGE上樣緩沖液為本領(lǐng)域常 規(guī)的SDS-PAGE上樣緩沖液，較佳地為2 X SDS-PAGE上樣緩沖液。較佳地，所述2 X SDS-PAGE 上樣緩沖液的口^1值為6.8，含有1'1^8-1〇^1〇〇1111，5〇5〇.〇51^/1，溴酚蘭〇.〇〇21^/1，0-巰 基乙醇0. lkg/L，甘油20%，所述百分比為體積百分比。所述煮沸的時(shí)間為本領(lǐng)域常規(guī)的時(shí) 間，較佳地為2?8min，更佳地為3?5min。
[0012] 步驟②為，酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液的制備：將a-酪蛋白、￠-酪 蛋白和K-酪蛋白溶解于水得酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的混合樣；將￠-乳球蛋白、a-乳白蛋白和 血清白蛋白溶解于水得乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的混合樣；將所述酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的混合樣和所述乳 清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的混合樣分別和SDS-PAGE上樣緩沖液混合均勻，水浴煮沸，然后迅速移入到 冰水中冷卻，即得酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液和乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液。其中，所述酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 混合樣為本領(lǐng)域常規(guī)的酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品混合樣，較佳地由包括以下步驟的方法制備而得：將 a-酪蛋白、￠-酪蛋白和K-酪蛋白以質(zhì)量比4:3:1的比例溶解于水獲得終蛋白濃度為 I. 70mg/mL的水溶液，即得。所述乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品混合樣為本領(lǐng)域常規(guī)的乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 混合樣，較佳地由包括以下步驟的方法制備而得：將￠-乳球蛋白、a-乳白蛋白和血清白 蛋白以質(zhì)量比8:3:1的比例溶解于水獲得終蛋白濃度為1.43mg/mL的水溶液，即得。所述 SDS-PAGE上樣緩沖液為本領(lǐng)域常規(guī)的SDS-PAGE上樣緩沖液，較佳地為2X SDS-PAGE上樣 緩沖液。較佳地，所述2 X SDS-PAGE上樣緩沖液的pH值為6. 8,含有Tris-HCL lOOmM，SDS 0. 05kg/L，溴酚蘭0. 002kg/L，P -巰基乙醇0. lkg/L，甘油20 %，所述百分比為體積百分比。 所述煮沸的時(shí)間為本領(lǐng)域常規(guī)的時(shí)間，較佳地為2?8min，更佳地為3?5min。
[0013] 步驟③為，聚丙烯酰胺凝膠電泳：將步驟①所述待檢樣品上樣液、步驟②所述酪 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液和所述乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液上樣，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，得聚丙 烯酰胺凝膠。其中，所述待檢樣品上樣液的上樣量為本領(lǐng)域常規(guī)的上樣量，較佳地為2? 6 y L，更佳地為4 y L。所述酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液的上樣量為本領(lǐng)域常規(guī)的上樣量，較佳地為 2?8 y L，更佳地為5 y L。所述乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液的上樣量為本領(lǐng)域常規(guī)的上樣量， 較佳地為2?8 y L，更佳地為5 y L。所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳的條件為本領(lǐng)域常規(guī)的條 件，較佳地為35?45mA恒流電泳30?50min后，電流調(diào)為25?35mA恒流，電泳至藍(lán)色條 帶距膠底部0. 5cm處；更佳地為40mA恒流電泳40min后，電流調(diào)為30mA恒流，電泳至藍(lán)色 條帶距膠底部0. 5cm處。所述聚丙烯酰胺凝膠電泳的電泳液為本領(lǐng)域常規(guī)的電泳液，較佳 地，所述電泳液pH值為8. 6,含有Tris 25mM/L，甘氨酸192mM/L，SDS lg/L。所述聚丙烯酰 胺凝膠電泳的凝膠為本領(lǐng)域常規(guī)的凝膠，較佳地為5%的濃縮膠和12%的分離膠，所述百 分比為質(zhì)量體積百分比（w/v)。所述聚丙烯酰胺凝膠電泳即為SDS-PAGE。
[0014] 步驟④為，染色與脫色：移出步驟③所述的聚丙烯酰胺凝膠，用染色液染色即得染 色的凝膠；將所述染色的凝膠用脫色液脫色至背景透明，即得脫色的凝膠。其中，所述的染 色液為本領(lǐng)域常規(guī)的染色液；較佳地為考馬斯亮藍(lán)染色液，更佳地為〇. 1 %的考馬斯亮藍(lán) 染色液。較佳地，所述0. 1 %的考馬斯亮藍(lán)染色液為，冰醋酸7. 5%，甲醇10%，考馬斯亮藍(lán) R-250 0.1%的水溶液，所述百分比為質(zhì)量百分比。所述的脫色液為本領(lǐng)域常規(guī)的脫色液， 較佳地為冰醋酸7. 5%、甲醇10%的水溶液，所述百分比為質(zhì)量百分比。所述的染色的時(shí)間 為本領(lǐng)域常規(guī)的時(shí)間，較佳地為1?2小時(shí)，更佳地為1. 5小時(shí)。
[0015] 步驟⑤為，成像與計(jì)算：將步驟④所述脫色的凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)，用圖像 處理軟件分析記錄所述待檢樣品對(duì)應(yīng)泳道各條帶的trace值，對(duì)照所述酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和所 述乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)泳道各條帶的trace值，并根據(jù)步驟③所上樣的酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品或乳 清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量，計(jì)算所述待檢樣品中乳清蛋白占總蛋白的比例，所述的trace值為 SDS-PAGE的光密度掃描圖譜內(nèi)蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)峰的峰面積。其中，所述的圖像處理軟件為本領(lǐng) 域常規(guī)的圖像處理軟件，較佳地為Quantity One圖像處理軟件。較佳地，所述峰面積的獲 得是利用所述Quantity One圖像處理軟件，經(jīng)過(guò)高斯建模后，以高斯建模后的trace值作 為蛋白質(zhì)的最終trace值。
[0016] 較佳地，所述計(jì)算的方法為：分別將待檢樣品上樣液中a-酪蛋白、￠-酪蛋白、 K-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳白蛋白和￠-乳球蛋白的trace值除以在酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上 樣液或乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液中各蛋白對(duì)應(yīng)的trace值，再分別乘以在酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣 液或乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液中各蛋白所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量，分別計(jì)算出待檢樣品中6種蛋白的質(zhì) 量；最后通過(guò)待檢樣品中3種乳清蛋白，即血清白蛋白、a-乳白蛋白和￠-乳球蛋白的質(zhì) 量之和，與6種蛋白，S卩a-酪蛋白、￠-酪蛋白、K-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳白蛋白和 3 _乳球蛋白的質(zhì)量之和的比值計(jì)算得出乳清蛋白占總蛋白的百分比。
[0017] 以血清白蛋白、a-酪蛋白為例，其質(zhì)量的計(jì)算公式為：
[0018] M待檢樣品（血清白蛋白）
[0019] =待檢樣品中血清白蛋白的trace值
[0020] /乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品中血清白蛋白的trace值
[0021] X乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品中血清白蛋白的上樣量（ilg)
[0022] M待檢樣品（a-酪蛋白）
[0023] =待檢樣品中a -酪蛋白的trace值
[0024] /酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品中a -酪蛋白的trace值
[0025] X酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品中a -酪蛋白的上樣量（ii g)
[0026] 乳清蛋白占總蛋白的百分比的計(jì)算公式為：
[0027] 乳清蛋白占總蛋白的百分比（％ )
[0028] =E M待檢樣品（血清白蛋白+a -乳白蛋白
[0029] +3 _乳球蛋白）/ E M待檢樣品（血清白蛋白+a -乳白蛋白
[0030] +P _乳球蛋白+a -酪蛋白+P -酪蛋白+K -酪蛋白）
[0031] 在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí) 例。
[0032] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0033] 本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：1、待檢樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單易行，只需要對(duì)乳基嬰幼兒 配方粉進(jìn)行簡(jiǎn)單地復(fù)原，即可加入上樣緩沖液配制成待檢樣品的上樣液用于進(jìn)行聚丙烯酰 胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。簡(jiǎn)化了乳清蛋白含量的檢測(cè)步驟，易于操作，節(jié)省時(shí)間，檢測(cè)費(fèi)用低，對(duì)實(shí) 驗(yàn)儀器要求低，普通實(shí)驗(yàn)室即能開(kāi)展檢測(cè)工作。2、酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液 的上樣量在一定的范圍內(nèi)，能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的檢測(cè)待檢樣的乳清蛋白含量，無(wú)需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 既能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確檢測(cè)乳清蛋白的含量，且SDS-PAGE圖譜中6種蛋白質(zhì)（a -酪蛋白、P -酪蛋 白、K-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳白蛋白和￠-乳球蛋白）的條帶均清晰可辨。因此該檢 測(cè)方法的準(zhǔn)確度高、可操作性高，且不會(huì)因?yàn)樯蠘恿康目量桃蠖斐蓪?shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度降低。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0034] 圖1為酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的SDS-PAGE圖譜。
[0035] 圖2為酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品SDS-PAGE膠的光密度掃描圖譜。
[0036] 圖3為乳基嬰幼兒配方粉的SDS-PAGE圖譜。
[0037] 圖4為乳基嬰幼兒配方粉SDS-PAGE膠的光密度掃描圖譜。
[0038] 圖5為自配乳基嬰幼兒配方粉乳清蛋白檢測(cè)的SDS-PAGE圖譜。其中：a為酪蛋 白標(biāo)準(zhǔn)品；b為乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；1.乳清蛋白/酪蛋白為75:25 ;2.乳清蛋白/酪蛋白為 70:30 ;3.乳清蛋白/酪蛋白為65:35 ;4.乳清蛋白/酪蛋白為60:40 ;5.乳清蛋白/酪蛋 白為55:45 ;6.乳清蛋白/酪蛋白為50:50,所述比例為質(zhì)量比。
[0039] 圖6為編號(hào)1?6的市售乳基嬰兒配方粉乳清蛋白檢測(cè)的SDS-PAGE圖譜。其中：a為酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；b為乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；編號(hào)1?6表示6份不同的市售乳基嬰兒配方粉。
[0040] 圖7為編號(hào)7?12的市售乳基嬰幼兒配方粉乳清蛋白檢測(cè)的SDS-PAGE圖譜。其 中：a為酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；b為乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；標(biāo)號(hào)7?12表示6份不同的市售乳基嬰兒配 方粉。
[0041] 圖8為乳基嬰幼兒配方粉乳清蛋白檢測(cè)的SDS-PAGE圖譜
[0042] 圖9為自配乳清蛋白：酪蛋白為50:50的乳基嬰幼兒配方粉乳清蛋白檢測(cè)的 SDS-PAGE圖譜，所述比例為質(zhì)量比。其中：a為酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；b為乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；標(biāo)號(hào)1 表不乳清蛋白：釀蛋白為50:50的乳基嬰幼兒配方粉。
[0043] 圖10為自配乳清蛋白：酪蛋白為75:25的乳基嬰幼兒配方粉乳清蛋白檢測(cè)的 SDS-PAGE圖譜，所述比例為質(zhì)量比。其中：a為酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；b為乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；標(biāo)號(hào)1 表示乳清蛋白：酪蛋白為75:25的市售乳基嬰兒配方粉。

【具體實(shí)施方式】
[0044] 下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí) 施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商 品說(shuō)明書選擇。
[0045] 如下實(shí)施例，所使用的試劑包括：標(biāo)準(zhǔn)品a-酪蛋白、￠-酪蛋白、K-酪蛋白、血 清白蛋白、ct -乳白蛋白和P -乳球蛋白購(gòu)自美國(guó)sigma公司；丙烯酰胺（Acr)、Tris、N-N 甲叉雙丙烯酰胺（Bis)、N，N，N'，N' -四甲基乙二胺（TEMED)、十二烷基硫酸鈉（SDS)、過(guò)硫酸 銨（Ap)和巰基乙醇購(gòu)自上海迪申生物；冰醋酸、甲醇、甘油、考馬斯藍(lán)R-250,溴酚藍(lán)和甘氨 酸購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。市售嬰兒配方粉，從市場(chǎng)上購(gòu)買獲得。
[0046] 所用的儀器包括：Mini-PROTEAN Tetra Cell 電泳槽、164-5050 Powerpac Basic 電泳儀和Gel Doc? XR+成像系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。分析天平購(gòu)自梅特勒-托利 多集團(tuán)。
[0047] 所述的2 X SDS-PAGE上樣緩沖液的pH值為6. 8,含有Tris-HCL lOOmM，SDS 0. 05kg/L，溴酚蘭0. 002kg/L，P -巰基乙醇0. lkg/L，甘油20 %，所述百分比為體積百分比。 [0048] 實(shí)施例1酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液的制備和酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、乳清蛋 白標(biāo)準(zhǔn)品的SDS-PAGE檢測(cè)
[0049] ①酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液的制備
[0050] 酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品混合樣：將a-酪蛋白、￠-酪蛋白和K-酪蛋白以4:3:1(質(zhì)量比） 的比例配制成終蛋白濃度為I. 70mg/mL的水溶液即可；
[0051] 乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品混合樣：將@ _乳球蛋白、a -乳白蛋白和血清白蛋白以 8:3:1(質(zhì)量比）的比例配制成終蛋白濃度為1.43mg/mL水溶液即可。
[0052] 所述酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品混合樣和所述乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品混合樣分別和2XSDS-PAGE上 樣緩沖液等體積混合均勻，水浴煮沸3min，然后迅速移入到冰水中冷卻，即得所述酪蛋白標(biāo) 準(zhǔn)品上樣液和所述乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液，可以用于后續(xù)檢測(cè)。
[0053] ②酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)分析
[0054] 所述酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液和所述乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液的上樣量均為5 y L。分析 條件為：40mA恒流電泳40min后，電流調(diào)為30mA恒流電泳至藍(lán)色條帶距膠底部0. 5cm處為 止，即得電泳膠。所述電泳的電泳液pH值為8. 6,包含Tris 25mM/L，甘氨酸192mM/L，SDS lg/L〇
[0055] ③染色與脫色
[0056] 移出步驟②所述的電泳膠，用0. 1 %的考馬斯亮藍(lán)染色液染色約I. 5h，即得染色 的凝膠。所述0. 1%的考馬斯亮藍(lán)染色液為，冰醋酸7. 5%，甲醇10%，考馬斯亮藍(lán)R-250 〇. 1 %的水溶液，所述百分比為質(zhì)量百分比。
[0057] 將所述染色的凝膠，用脫色液脫色至背景透明，即得脫色的凝膠。所述脫色液為： 冰醋酸7. 5%，甲醇10%的水溶液，所述百分比為質(zhì)量百分比。
[0058] ④成像
[0059] 將步驟③所述的脫色的凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)，用Quantity One圖像處理軟件 成像。圖1即為酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的SDS-PAGE圖譜。由圖1可知酪蛋白混 合標(biāo)準(zhǔn)品（a -酪蛋白、P -酪蛋白和K -酪）和乳清蛋白混合標(biāo)準(zhǔn)品（血清白蛋白、a -乳 白蛋白和￠-乳球蛋白）中各蛋白質(zhì)在如上所述電泳條件下都實(shí)現(xiàn)了很好的分離。
[0060] 圖2為酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品SDS-PAGE膠的光密度掃描圖譜。如圖2 所示，掃描圖譜中a-酪蛋白、￠-酪蛋白、K-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳白蛋白和￠-乳 球蛋白實(shí)現(xiàn)了很好的分離。圖譜中K-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳白蛋白和￠-乳球蛋白 的單峰，說(shuō)明這四種蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)了完全分離。
[0061] 實(shí)施例2乳基嬰幼兒配方粉上樣液的制備和乳基嬰幼兒配方粉的SDS-PAGE檢測(cè)
[0062] ①乳基嬰幼兒配方粉上樣液的制備
[0063] 所述乳基嬰幼兒配方粉為光明乳業(yè)市售的培兒貝瑞1段產(chǎn)品。
[0064] 將所述乳基嬰幼兒配方粉攪拌并充分溶解于超純水中，攪拌使所述乳基嬰幼兒配 方粉充分溶解使其蛋白質(zhì)含量的終濃度為2mg/mL，然后和2X SDS-PAGE上樣緩沖液等體積 混合均勻，水浴煮沸2min，迅速移入到冰水中冷卻，即得所述乳基嬰幼兒配方粉上樣液，可 以用于后續(xù)檢測(cè)。
[0065] ②乳基嬰幼兒配方粉的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)分析
[0066] 所述乳基嬰幼兒配方粉上樣液的上樣量為4yL。分析條件為：40mA恒流電泳 40min后，電流調(diào)為30mA恒流電泳至藍(lán)色條帶距膠底部0. 5cm處為止，即得電泳膠。所述電 泳的電泳液口!1值為8.6，包含1^8 251111/1，甘氨酸1921111/1，503 18/1。
[0067] ③染色與脫色
[0068] 移出步驟②所述的電泳膠，用0. 1 %的考馬斯亮藍(lán)染色液染色約I. 5h，即得染色 的凝膠。所述0. 1%的考馬斯亮藍(lán)染色液為，冰醋酸7. 5%，甲醇10%，考馬斯亮藍(lán)R-250 0. 1 %的水溶液，所述百分比為質(zhì)量百分比。
[0069] 將所述染色的凝膠，用脫色液脫色至背景透明，即得脫色的凝膠。所述脫色液為， 冰醋酸7. 5%，甲醇10%的水溶液，所述百分比為質(zhì)量百分比。
[0070] ④成像
[0071] 將步驟③所述的脫色的凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)，用Quantity One圖像處理軟件 成像，經(jīng)過(guò)高斯建模后，以高斯建模后的trace值作為蛋白質(zhì)的最終trace值。
[0072] 圖3即為所述乳基嬰幼兒配方粉的SDS-PAGE圖譜。由圖3可知乳基嬰幼兒配方 粉內(nèi)主要的6種蛋白質(zhì)（a -酪蛋白、￠-酪蛋白、K -酪蛋白、血清白蛋白、a -乳白蛋白和 3 _乳球蛋白）在如上所述電泳條件下實(shí)現(xiàn)了很好的分離。
[0073] 圖4即為所述為乳基嬰幼兒配方粉SDS-PAGE膠的光密度掃描圖譜。如圖4所示， 掃描圖譜中a-酪蛋白、￠-酪蛋白、K-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳白蛋白和￠-乳球蛋 白實(shí)現(xiàn)了很好的分離。其中K-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳白蛋白和￠-乳球蛋白在掃描 圖譜中是單峰說(shuō)明這四種蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)了完全分離。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方 法適合乳粉內(nèi)主要蛋白質(zhì)的電泳分離，且能達(dá)到理想的效果。
[0074] 實(shí)施例3自配乳基嬰幼兒配方粉的SDS-PAGE檢測(cè)和乳清蛋白含量測(cè)定
[0075] ①自配乳基嬰幼兒配方粉的上樣液的制備
[0076] 以生產(chǎn)嬰幼兒奶粉的生產(chǎn)工藝，生產(chǎn)乳清蛋白含量不同的配方粉。共設(shè)計(jì)6個(gè)不 同乳清蛋白含量（乳清蛋白：酪蛋白分別為50 :50,55 :45,60 :40,65 :35,70 :30和75 :25， 所述比例為質(zhì)量比）的配方粉。將所述自配乳基嬰幼兒配方粉攪拌并充分溶解于超純水 中并控制其蛋白質(zhì)含量的終濃度為3mg/mL，然后和2XSDS-PAGE上樣緩沖液等體積混合均 勻，水浴煮沸5min，迅速移入到冰水中冷卻，即得所述自配乳基嬰幼兒配方粉上樣液，可以 用于后續(xù)檢測(cè)。
[0077] ②自配乳基嬰幼兒配方粉的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)分析
[0078] 所述自配乳基嬰幼兒配方粉上樣液的上樣量為4 y L。取實(shí)施例1獲得的酪蛋白標(biāo) 準(zhǔn)品上樣液和乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液，所述酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液和所述乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上 樣液的上樣量均為5 ii L。分析條件為：40mA恒流電泳40min后，電流調(diào)為30mA恒流電泳至 藍(lán)色條帶距膠底部0. 5cm處為止，即得電泳膠。所述電泳的電泳液pH值為8. 6,包含Tris 25mM/L，甘氨酸 192mM/L，SDS lg/L。
[0079] ③染色與脫色
[0080] 移出步驟②所述的電泳膠，用〇. 1 %的考馬斯亮藍(lán)染色液染色約I. 5h，即得染色 的凝膠。所述0. 1%的考馬斯亮藍(lán)染色液為，冰醋酸7. 5%，甲醇10%，考馬斯亮藍(lán)R-250 0. 1 %的水溶液，所述百分比為質(zhì)量百分比。
[0081] 將所述染色的凝膠，用脫色液脫色至背景透明，即得脫色的凝膠。所述脫色液為， 冰醋酸7. 5%，甲醇10%的水溶液，所述百分比為質(zhì)量百分比。
[0082] ④成像
[0083] 將步驟③所述的脫色的凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)，用Quantity One圖像處理軟件 成像，經(jīng)過(guò)高斯建模后，以高斯建模后的trace值作為蛋白質(zhì)的最終trace值分析記錄各泳 道的蛋白質(zhì)條帶trace值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)條帶的trace值和上樣量（ii g)即可以計(jì)算乳 清蛋白與總蛋白質(zhì)的比例。
[0084] 圖5即為所述自配乳基嬰幼兒配方粉的SDS-PAGE圖譜。由圖5可知乳清蛋白含 量不同的乳基嬰幼兒配方粉、酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)主要的6種蛋白質(zhì)（a-酪 蛋白、￠-酪蛋白、K-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳白蛋白和￠-乳球蛋白）在如上所述電 泳條件下實(shí)現(xiàn)了很好的分離。
[0085] ⑤計(jì)算乳清蛋白含量
[0086] 乳清蛋白占總蛋白的百分比的計(jì)算公式為：
[0087] 乳清蛋白占總蛋白的百分比（％ )
[0088] =E M待檢樣品（血清白蛋白+a -乳白蛋白
[0089] +3 _乳球蛋白）/ E M待檢樣品（血清白蛋白+a -乳白蛋白
[0090] +P _乳球蛋白+a -酪蛋白+P -酪蛋白+K -酪蛋白）
[0091] 其中：
[0092] M待檢樣品（X)
[0093] =待檢樣品中X的trace值/A中X的trace值
[0094] XA中X的上樣量（y g)
[0095] X :代表不同的蛋白質(zhì)（a-酪蛋白、P -酪蛋白、K-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳 白蛋白或乳球蛋白）；A:代表乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品或酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。
[0096] 如待檢樣品中a-酪蛋白的質(zhì)量的計(jì)算公式如下：
[0097] M待檢樣品a-酪蛋白）
[0098] =待檢樣品中a -酪蛋白的trace值
[0099] /酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品中a -酪蛋白的trace值
[0100] X酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品中a -酪蛋白的上樣量（ii g)
[0101] A標(biāo)準(zhǔn)品中X的上樣量（]i g)
[0102] = A標(biāo)準(zhǔn)品上樣量（ii g) X X在A標(biāo)準(zhǔn)品中所占的比例
[0103] 如酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品中a -酪蛋白的上樣量：
[0104] 酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品中a -酪蛋白的上樣量（iig)
[0105] =酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的上樣量（y g) X [V(l+3+4)]
[0106] 所述酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的上樣量的質(zhì)量分別為4.25 yg和 3. 575 u g〇
[0107] 自配乳基嬰幼兒配方粉內(nèi)乳清蛋白含量的測(cè)定結(jié)果如表1所示：
[0108] 表1自配乳基嬰幼兒配方粉內(nèi)乳清蛋白含量的測(cè)定

【權(quán)利要求】
1. 一種測(cè)定乳基嬰幼兒配方粉中乳清蛋白含量的方法，其特征在于，所述方法包括以 下的步驟： ① 待檢樣品上樣液的制備：將待檢樣品攪拌并充分溶解于去離子水中，然后與 SDS-PAGE上樣緩沖液混合均勻，水浴煮沸，迅速移入到冰水中冷卻，即得所述待檢樣品上樣 液；所述待檢樣品指非水解的乳基嬰幼兒配方粉； ② 酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液的制備：將a-酪蛋白、￠-酪蛋白和k-酪 蛋白溶解于水得酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的混合樣；將0 _乳球蛋白、a _乳白蛋白和血清白蛋白溶解 于水得乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的混合樣；將所述酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的混合樣和所述乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的 混合樣分別和SDS-PAGE上樣緩沖液混合均勻，水浴煮沸，然后迅速移入到冰水中冷卻，即 得酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液和乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液； ③ 聚丙烯酰胺凝膠電泳：將步驟①所述待檢樣品上樣液、步驟②所述酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上 樣液和所述乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液上樣，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，得聚丙烯酰胺凝膠； ④ 染色與脫色：移出步驟③所述的聚丙烯酰胺凝膠，用染色液染色即得染色的凝膠； 將所述染色的凝膠用脫色液脫色至背景透明，即得脫色的凝膠； ⑤ 成像與計(jì)算：將步驟④所述脫色的凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)，用圖像處理軟件分析 記錄所述待檢樣品對(duì)應(yīng)泳道各條帶的trace值，對(duì)照所述酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和所述乳清蛋白標(biāo) 準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)泳道各條帶的trace值，并根據(jù)步驟③所上樣的酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品或乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 的質(zhì)量，計(jì)算所述待檢樣品中乳清蛋白占總蛋白的比例，所述的trace值為SDS-PAGE的光 密度掃描圖譜內(nèi)蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)峰的峰面積。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟①中，所述水為去離子水；所述待檢樣 品上樣液的蛋白質(zhì)含量的終濃度在2mg/mL?4mg/mL范圍內(nèi)；所述SDS-PAGE上樣緩沖液 為2 X SDS-PAGE上樣緩沖液；所述2 X SDS-PAGE上樣緩沖液的pH值為6. 8,含有Tris-HCL lOOmM，SDSO. 05kg/L，溴酚蘭0? 002kg/L，0 -巰基乙醇0? lkg/L，甘油20 %，所述百分比為體 積百分比；和/或，所述煮沸的時(shí)間為2?8min。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟①中，所述水為超純水；所述待檢樣品 上樣液的蛋白質(zhì)含量的終濃度為3mg/mL ;和/或，所述煮沸的時(shí)間為3?5min。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟②中，所述酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品混合樣由包 括以下步驟的方法制備而得：將a-酪蛋白、￠-酪蛋白和k-酪蛋白以質(zhì)量比4:3:1的 比例溶解于水獲得終蛋白濃度為1. 70mg/mL的水溶液，即得酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品混合樣；所述 乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品混合樣由包括以下步驟的方法制備而得：將￠-乳球蛋白、乳白蛋白 和血清白蛋白以質(zhì)量比8:3:1的比例溶解于水獲得終蛋白濃度為1.43mg/mL的水溶液， 即得乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品混合樣；所述SDS-PAGE上樣緩沖液為2XSDS-PAGE上樣緩沖液，所 述2XSDS-PAGE上樣緩沖液的pH值為6. 8,含有Tris-HCL lOOmM，SDSO. 05kg/L，溴酚蘭 0.002kg/L，￠-巰基乙醇0. lkg/L，甘油20%，所述百分比為體積百分比；和/或，所述煮沸 的時(shí)間為2?8min。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟②中，所述煮沸的時(shí)間為3?5min。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟③中，所述待檢樣品上樣液的上樣量為 2?6 y L ;所述酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液的上樣量為2?8 y L ;所述乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液的 上樣量為2?8 y L ;所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳的條件為35?45mA恒流電泳30?50min 后，電流調(diào)為25?35mA恒流，電泳至藍(lán)色條帶距膠底部0. 5cm處；所述聚丙烯酰胺凝膠電 泳的電泳液pH值為8. 6,含有Tris 25mM/L，甘氨酸192mM/L，SDS lg/L ;和/或，所述聚丙 烯酰胺凝膠電泳的凝膠為5%的濃縮膠或12%的分離膠，所述百分比為質(zhì)量體積百分比。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟③中，所述待檢樣品上樣液的上樣量為 4U L ;所述酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液的上樣量為5 y L ;所述乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液的上樣量為 5 y L ;和/或，所述聚丙烯酰胺凝膠電泳的條件為40mA恒流電泳40min后，電流調(diào)為30mA 恒流，電泳至藍(lán)色條帶距膠底部0. 5cm處。
8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟④中，所述的染色液為考馬斯亮藍(lán)染色 液；所述的脫色液為冰醋酸7. 5%、甲醇10%的水溶液，所述百分比為質(zhì)量百分比；和/或， 所述的染色的時(shí)間為1?2小時(shí)。
9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟④中，所述的染色液為0. 1 %的考馬 斯亮藍(lán)染色液，所述〇. 1 %的考馬斯亮藍(lán)染色液為冰醋酸7. 5%，甲醇10%，考馬斯亮藍(lán) R-2500. 1 %的水溶液，所述百分比為質(zhì)量百分比；和/或，所述的染色的時(shí)間為1. 5小時(shí)。
10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟⑤中，所述的圖像處理軟件為 Quantity One圖像處理軟件；所述峰面積的獲得是利用所述Quantity One圖像處理軟件， 經(jīng)過(guò)高斯建模后，以高斯建模后的trace值作為蛋白質(zhì)的最終trace值；所述計(jì)算的方法 為：分別將待檢樣品上樣液中a-酪蛋白、￠-酪蛋白、k-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳白 蛋白和￠-乳球蛋白的trace值除以在酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液或乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液中各 蛋白對(duì)應(yīng)的trace值，再分別乘以在酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液或乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣液中各蛋 白所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量，分別計(jì)算出待檢樣品中6種蛋白的質(zhì)量；最后通過(guò)待檢樣品中3種乳清蛋 白，即血清白蛋白、a-乳白蛋白和￠-乳球蛋白的質(zhì)量之和，與6種蛋白，S卩a-酪蛋白、 酪蛋白、K-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳白蛋白和￠-乳球蛋白的質(zhì)量之和的比值計(jì)算 得出乳清蛋白占總蛋白的百分比。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104360078SQ201410722848
【公開(kāi)日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月2日
【發(fā)明者】賈宏信, 郭本恒 申請(qǐng)人:光明乳業(yè)股份有限公司