專利名稱：一種牛血清白蛋白提取方法
技術領域：
本發(fā)明涉及白蛋白的制備方法，具體涉及一種牛血清白蛋白提取方法。
背景技術：
牛血清白蛋白(BSA)，又稱第五組分，是牛血清中的一種球蛋白，包含583個氨基酸殘基，分子量為66. 430 kDa，等電點為4. 7，是生物學諸多學科及醫(yī)、藥學各領域廣泛應用的生化試劑，也可用作醫(yī)藥保健食品、調(diào)味品。牛血清白蛋白最常用的制備方法是以牛血為原料分離出血清，用硫酸銨分級沉淀后，經(jīng)辛酸處理精制而得；中國專利文獻CN 1544470C公開了一種牛血清白蛋白熱乙醇法提取工藝，其方法是采用3. 8%枸櫞酸鈉抗凝血得到血漿，加熱加入辛酸鈉，調(diào)pH值后加乙醇，再經(jīng)過濾、脫鹽、濃縮、凍干后得牛血清白蛋白。上述牛血清白蛋白制備方法中需要添加許多成本較高的鹽類(如枸櫞酸鈉、辛酸鈉等)及有機化學物質(zhì)(乙醇溶劑等)，制備出白蛋白的純度難以保證，而且生產(chǎn)工藝較復雜，難以進行大批量生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種純度高、工藝流程簡單、成本低的牛血清白蛋白提取方法。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案是 一種牛血清白蛋白提取方法，包括以下步驟
(1)取新鮮的牛血，離心分離后取上清液，加入與上清液等體積的無菌無熱原去離子水，再按上清液體積的1/4 3/4加入60 70°C的0. 024M軟脂酸鈉溶液，混勻后靜置50 100 min ；
(2)向上步所得溶液中加稀鹽酸，調(diào)節(jié)溶液pH至4.0 6. 5，60 70°C下水浴1 2h,過濾得濾液；
(3)按上清體積的40%向上步所得濾液中加入3mol/L HC1，混勻后再加入氯化鈉，使其在溶液中的質(zhì)量濃度達到4%，0 4°C下放置30 60min ；
(4)靜置后過濾得沉淀，按上清體積的4 6%向沉淀中加入無菌無熱原去離子水，加稀堿溶液，調(diào)溶液pH至9. 0 10. 0 ；
(5)待沉淀完全溶解后，再加稀鹽酸調(diào)溶液pH至8.0 9. 0，在無菌無熱原去離子水中透析10 16h ；
(6)透析液放入凍干機中，45 50小時后取出，得蛋白粉。在所述步驟(1)中，離心分離的轉速為觀00 3200r/m，時間為10 20 min。在所述步驟(2)、(5)中，所用稀鹽酸的濃度為lmol/L。在所述步驟(4)中，所用稀堿溶液為lmol/L NaOH溶液。本發(fā)明具有積極有益的效果
1.純度高、質(zhì)量好，易于保存，在生產(chǎn)過程中只加少量保護劑，不含其它鹽類及化學物質(zhì)，因而保證了成品的純度，產(chǎn)品可室溫下保存。2.常規(guī)方法中提取白蛋白采用3. 8%枸櫞酸鈉抗凝血得到血漿，而本發(fā)明采用血清，避免加入枸櫞酸鈉，一方面節(jié)約成本，另外減少化學原料的參入，提高了白蛋白的純度； 常規(guī)提取白蛋白的辛酸法，辛酸的價格遠高于軟脂酸，同時軟脂酸為十六烷酸，較辛酸結合白蛋白的能力強，保護白蛋白的作用相應也提高。3.本發(fā)明用料少，工藝流程短，操作簡單，適合批量生產(chǎn)，生產(chǎn)效率比冷鹽析法(耗時需5天)提高了 5倍；收率高，一般在1. 8 2. 0 % ；軟脂酸的價格遠低于辛酸，因此生產(chǎn)成本大大降低，如與冷鹽析法相比，成本低50%。
具體實施例方式以下結合具體實施例進一步闡述本發(fā)明。下述實施例中所用的原料及設備，如無特別說明，均為市售。實施例1 一種牛血清白蛋白提取方法，包括以下步驟
取新鮮的牛血，3000r/m離心lOmin，取上清液，_20°C凍存?zhèn)溆谩Ｈ〕浞秩诨蟮呐Ｑ?0ml，加去離子水30ml，充分攪勻，再加入70°C的0. 024M軟脂酸鈉溶液20ml，放置 75min。測得混合溶液的pH為8. 76，加IM HCl 1. 6ml，使pH至5. 16，水浴1.釙(溫度從 65°C升至70°C)。用單層普通濾紙進行過濾，得濾液60ml，加3M HCl 12ml,NaCl 2. 88g，4°C 放置30min，使用雙層過濾，將沉淀加水1. 7ml，攪成糊狀，加IM NaOH 3. 5ml，pH至9. 98，再加IM HCl 0. Ilml至pH8. 45，在去離子水中透析12h。將透析液13. 5ml，放入凍干機中，48 小時后取出，得蛋白粉。實施例2 —種牛血清白蛋白提取方法，包括以下步驟 取新鮮的牛血，3000r/m離心lOmin，取上清，_20°C凍存?zhèn)溆?。取充分融化后的牛血?0ml，加去離子水30ml，充分攪勻，再加入70°C的0. 024M 軟脂酸鈉溶液20ml，放置75min。測得混合溶液的pH為8. 78，加IM HCl 1. 7ml，使pH至 5. 17，水浴1. (溫度從65°C升至70°C)。用單層濾紙進行過濾，得濾液60ml，加3M HCl 12ml,NaCl 2. 88g，4°C放置30min，使用雙層過濾，將沉淀加水1. 5ml，攪成糊狀，加IM NaOH 3. 0ml，pH至10. 04，再加IM HCl 0. 20ml至pH8. 51，在去離子水中透析12h。將透析液 12. 5ml，放入凍干機中，48小時后取出，得蛋白粉。上述實施例1、2中所制得的牛血清白蛋白的主要性能指標如下
①外觀灰白色疏松固體，無融化現(xiàn)象；復溶后為淡黃色澄明液體，無渾濁；
②得率(凍干粉質(zhì)量/原血清中的蛋白總量χ100 %) > 26. 0% ；
③含水量(真空減壓干燥法)<0. 3% ；
④PH值(生理氯化鈉溶液將供試品蛋白質(zhì)含量稀釋成10g/L):7. 3 7. 4 ；
⑤水溶性(向無菌去離子水中加入蛋白制品，超聲30min，在25°C恒溫箱中水平振蕩 24h,如無沉淀，再加入蛋白樣品，如此反復，直至不能溶解，取上清，測蛋白含量)> 8% ；
⑥純度(白蛋白的濃度/總蛋白的濃度X100 %) > 95. 0%。
權利要求
1.一種牛血清白蛋白提取方法，包括以下步驟(1)取新鮮的牛血，離心分離后取上清，加入與該上清等體積的無菌無熱原去離子水， 再按所述上清體積的1/4 3/4加入60 70°C的0. 024M軟脂酸鈉溶液，混勻后靜置50 IOOmin ；(2)向上步所得溶液中加稀鹽酸，調(diào)節(jié)溶液pH至4.0 6. 5，60 70°C下水浴1 2h,過濾得濾液；(3)按所述上清體積的40%向上步所得濾液中加入3M HC1，混勻后再加入氯化鈉，使其在溶液中的質(zhì)量濃度達到4%，0 4°C下放置30 60min ；(4)靜置后過濾得沉淀，按所述上清體積的4 6%向沉淀中加入無菌無熱原去離子水， 加稀堿溶液，調(diào)溶液pH至9. 0 10. 0 ；(5)待沉淀完全溶解后，再加稀鹽酸調(diào)溶液pH至8.0 9. 0，在無菌無熱原去離子水中透析10 16h ；(6 )透析液放入凍干機中，45 50h后取出，得蛋白粉。
2.根據(jù)權利要求1所述的牛血清白蛋白提取方法，其特征在于，在所述步驟(1)中，離心分離的轉速為觀00 3200r/m，時間為10 20 min。
3.根據(jù)權利要求1所述的牛血清白蛋白提取方法，其特征在于，在所述步驟(2)、(5) 中，所用稀鹽酸的濃度為lmol/L。
4.根據(jù)權利要求1所述的牛血清白蛋白提取方法，其特征在于，在所述步驟(4)中，所用稀堿溶液為lmol/L NaOH溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種牛血清白蛋白提取方法。旨在解決牛血清白蛋白的生產(chǎn)工藝較復雜、純度不高且生產(chǎn)成本高難以進行大批量生產(chǎn)的技術難題。本發(fā)明通過向分離血清中添加入適量軟脂酸鈉靜置，調(diào)節(jié)溶液pH后水浴加熱1～2h，過濾后向濾液中依次加3MHCl、氯化鈉，4℃放置，過濾得沉淀，向沉淀中加入適量水，并調(diào)pH使沉淀溶解，再調(diào)溶液pH至8.0～9.0，透析后凍干即得。本發(fā)明工藝用料少，工藝流程短，操作簡單，生產(chǎn)效率高，適合批量生產(chǎn)，所得產(chǎn)品純度高、質(zhì)量好，易于保存。
文檔編號C07K14/765GK102241767SQ20111016847
公開日2011年11月16日 申請日期2011年6月22日 優(yōu)先權日2011年6月22日
發(fā)明者丁利靜, 何美霞, 華海嬰, 崔西國, 張勇, 張紅梅, 張黎蓉, 李志剛, 王芳, 賀石林, 高元法 申請人:河南省醫(yī)藥科學研究院