專利名稱：一種高純度牛血清白蛋白的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從牛血清中提取白蛋白的方法，尤其涉及一種高純度牛血清白蛋白的制備方法。
背景技術(shù)：
牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)是牛血清中的一種球蛋白，包含583個氨基酸殘基，分子量為66. 43kDa，等電點為4. 7，含氮量為16%，含糖量為O. 08%,含脂量只有O. 2% ;白蛋白可與多種陽離子、陰離子和其他小分子物質(zhì)結(jié)合，BSA是生物學(xué)諸多學(xué)科及醫(yī)、藥學(xué)各領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的生化試劑,例如在western blot中作為封閉試劑，血液中的白蛋白主要起維持滲透壓作用、PH緩沖作用、載體作用和營養(yǎng)作用；在動物細胞無血清培養(yǎng)中，添加白蛋白可起到生理和機械保護作用和載體作用。 BSA的制備方法較多，但多數(shù)尚處于實驗階段，目前市場上的BSA主要采用以下三種方法制得(I)鹽析法，用硫酸銨分級沉淀后，經(jīng)辛酸處理精制而得；(2)有機溶劑沉淀法，以E. J. Cohn氏法最常用，最早用于人血液制品的生產(chǎn)，利用乙醇的低介電常數(shù)性質(zhì)以及蛋白質(zhì)在一定溫度、pH、離子強度及濃度條件下在不同濃度乙醇中溶解度不同分離血漿蛋白質(zhì)，可以生產(chǎn)出多種血漿蛋白；(3)熱激法，取牛血用枸櫞酸鈉抗凝離心后得到血漿，加熱，加入辛酸鈉，調(diào)PH值后加乙醇，再經(jīng)過濾、脫鹽、濃縮、凍干后得牛血清白蛋白。鹽析法為最傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法，此法原理較為簡單，但是硫酸銨對設(shè)備有一定的腐蝕性，整個工藝比較耗時，且硫酸銨用量很多，所得產(chǎn)品純度只有809Γ90%，收率一般為
O.8^1. 0%，以上導(dǎo)致此法生產(chǎn)效率低，成本偏高；利用冷乙醇沉淀法也有一些不足乙醇是一種非特異性沉淀劑，盡管BSA生產(chǎn)效率顯著，但產(chǎn)品純度不是很高，作為有機溶劑的乙醇還可能使蛋白質(zhì)發(fā)生聚集或變性，為了避免蛋白質(zhì)變性，必須在一 20°C的低溫環(huán)境中進行，設(shè)備與廠房的投入很大，乙醇易燃，給生產(chǎn)帶來安全隱患，單程需7日，能源消耗巨大，費時費力，生產(chǎn)不易實現(xiàn)自動化，有機溶劑沉淀法所得BSA純度在90°/Γ95%，收率在10%左右，相對而言成本比較高，從而使其產(chǎn)品因在市場中售價偏高而降低了競爭力；單純使用熱激法，雖然用料少且省時，但是收率僅有I. 8^2. 0%，且純度也不高，僅能達到90%。因此，目前BSA的制備方法存在費時費力、收率低、純度不高、生產(chǎn)效率低、成本高等缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明提供一種高純度牛血清白蛋白的制備方法，它用料少，省時省力，收率高，用本制備方法可較大幅度地降低成本。本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明提供一種高純度牛血清白蛋白的制備方法，包括如下步驟:Α)分離血漿取新鮮牛血，加入血量體積的10%的抗凝劑，輕輕攪拌使抗凝劑分散均勻，4°C，1500rpm離心，分離收集血漿；B)制備血清室溫下，取所述血漿，邊攪拌邊加入無水氯化鈣粉末，待所述無水氯化鈣粉末完全溶解后靜置O. 8^1. 2h，將凝結(jié)成果凍狀的血漿塊打碎，5000rpm離心，上層澄清液體即為牛血清，下層乳黃色凝塊為纖維蛋白，收集所述牛血清；C)加熱提取取所述牛血清用pH5. 2 · O PBS緩沖液稀釋2 10倍后放入帶夾層的反應(yīng)釜中，加入辛酸鈉并攪拌使之完全溶解,再加入所述牛血清體積的5°/Γ20%的乙醇，用I當(dāng)量濃度的HCl調(diào)pH值至4. (Γ6. 2，油浴加熱，使反應(yīng)釜中牛血清的溫度保持在55 75°C，
O.8^1. 2h后取出反應(yīng)液，壓濾機壓濾，收集濾液，棄掉濾渣；D)置換溶液和濃縮將所述濾液用20000分子量以下的超濾裝置過濾并將緩沖體系置換為ρΗ8. (Γ8. 5 Tris-HCl,同時進行濃縮；E) DEAE柱進一步純化裝柱后用ρΗ8. (Γ8. 5 Tris-HCl平衡柱子，將超濾濃縮后的BSA溶液泵入層析柱中，并繼續(xù)用ρΗ8. (Γ8. 5 Tris-HCl平衡，待接入純化系統(tǒng)中的核酸蛋白檢測儀吸光值有所上升時，收集穿透組分，待穿透峰回落至基線后用含O. 15M NaCl的PH8. (Γ8. 5 Tris-HCl溶液洗脫，待核酸蛋白檢測儀吸光值有所上升時，收集洗脫組分并脫鹽濃縮，得到脫鹽濃縮后的洗脫組分；F)BSA劑型處理取所述脫鹽濃縮后的洗脫組分，力口入防腐劑、絡(luò)合劑，得到高純BSA溶液，或直接進行冷凍干燥，得到BSA凍干粉。
作為本發(fā)明的進一步改進是步驟A)中所述抗凝劑采用濃度為39Γ5%的檸檬酸三鈉溶液。作為本發(fā)明的進一步改進是步驟B)中所述加入無水氯化鈣粉末的量為3 10g/L血漿。作為本發(fā)明的進一步改進是步驟C)中所述加入辛酸鈉的量為f lOmmol/L血清。作為本發(fā)明的進一步改進是步驟C)中所述乙醇的濃度為95%。作為本發(fā)明的進一步改進是步驟A)和步驟B)在集中屠宰場分散操作，步驟C)、
D)、E)、F)在潔凈廠房集中操作，實現(xiàn)低成本生產(chǎn)與高質(zhì)量的產(chǎn)品產(chǎn)出，以滿足生物制藥等行業(yè)對牛血清白蛋白嚴(yán)格的質(zhì)量要求。本發(fā)明所用的檸檬酸三鈉為抗凝劑，辛酸鈉為牛血清白蛋白的保護劑，使牛血清白蛋白在溫度55 °C以上不變性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是用料少，可節(jié)約投入；工藝流程短，省時省力；操作簡單，重復(fù)性好，適合大批量生產(chǎn)；目標(biāo)產(chǎn)品得率高、純度高、質(zhì)量好，本方法制得的成品牛血清白蛋白經(jīng)過質(zhì)量檢驗，產(chǎn)品質(zhì)量完全符合現(xiàn)行行業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，使用效果良好，可滿足生化試劑與生物制藥行業(yè)對牛血清白蛋白的質(zhì)量要求；成本低，經(jīng)濟效益顯著。


圖I是本發(fā)明工藝流程圖。圖2是本發(fā)明一步沉淀法制備的BSA與其他生產(chǎn)廠家提供的同類別BSA純度對比(12% SDS-PAGE)示意圖，其中a d泳道為某市售國外品牌的BSA (組分五，白蛋白含量98%)，濃度依次為7、6、5、4mg/ml ；e泳道為牛血清X 10倍稀釋；f、g泳道為本法一次沉淀制得的BSA ;tTl為國內(nèi)5家具備代表性的企業(yè)生產(chǎn)的BSA產(chǎn)品。圖3是本發(fā)明層析處理后的BSA與某進口品牌BSA純度對比(12% SDS-PAGE)示意圖，其中A F泳道為某市售國外品牌的BSA (組分五，白蛋白含量98%)，A 4mg/ml,B 2mg/ml, C lmg/ml,D :0. 8mg/ml,E :0. 6mg/ml,F :0. 4mg/ml ；G 為牛血清 X 15 倍稀釋;H、J 為 DEAE層析處理后的BSA樣品；1 :濾渣；K :廢液。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。實施例一高純度牛血清白蛋白的制備。高純度牛血清白蛋白的制備，包括如下步驟
A)分離血漿取新鮮牛血，經(jīng)嚴(yán)格的檢疫，確保無感染疾病，加入血量體積的10%的抗凝劑，即濃度為3°/Γ5%的檸檬酸三鈉溶液，輕輕攪拌使抗凝劑分散均勻，4°C，1500rpm離心，分離收集血漿；
B)制備血清室溫下，取所述血漿，邊攪拌邊加入無水氯化鈣粉末，加入無水氯化鈣粉末的量為3 10g/L血漿，待所述無水氯化鈣粉末完全溶解后靜置O. 8^1. 2h，至容器內(nèi)血漿·完全凝結(jié)成果凍狀，將凝結(jié)成果凍狀的血漿塊打碎，5000rpm離心，上層澄清液體即為牛血清，下層乳黃色凝塊為纖維蛋白，收集所述牛血清；
C)加熱提取取所述牛血清用pH5.2 7. O PBS緩沖液稀釋2 10倍后放入帶夾層的反應(yīng)釜中，按f 10mmol/L血清加入辛酸鈉，并攪拌使辛酸鈉完全溶解,再加入所述牛血清體積的5°/Γ20%的乙醇，用I當(dāng)量濃度的HCl調(diào)pH值至4. (Γ6. 2，油浴加熱，使反應(yīng)釜中牛血清的溫度保持在55 75°C，0. 8^1. 2h后取出反應(yīng)液，壓濾機壓濾，收集濾液，棄掉濾渣；
D)置換溶液和濃縮將所述濾液用20000分子量以下的超濾裝置過濾并將緩沖體系置換為ρΗ8· 0 8· 5 Tris-HCl，同時進行濃縮；
E)DEAE柱進一步純化用O.5mol/L的NaOH溶液浸泡層析柱，再用純水淋洗干凈，裝入DEAE填料并用純水沖洗壓實；裝柱后用5倍以上柱體積的ρΗ8. (Γ8. 5 Tris-HCl平衡柱子，將超濾濃縮后的BSA溶液泵入層析柱中，并繼續(xù)用ρΗ8. (Γ8. 5 Tris-HCl平衡，待接入純化系統(tǒng)中的核酸蛋白檢測儀吸光值有所上升時，收集穿透組分，待穿透峰回落至基線后用含
O.15M NaCl的ρΗ8. (Γ8. 5 Tris-HCl溶液洗脫，待核酸蛋白檢測儀吸光值有所上升時，收集洗脫組分并脫鹽濃縮，得到脫鹽濃縮后的洗脫組分；用0. 5mol/L的NaOH溶液清洗層析柱后可以重復(fù)使用；
F)BSA劑型處理取所述脫鹽濃縮后的洗脫組分，加入防腐劑、絡(luò)合劑，得到高純BSA溶液，或直接進行冷凍干燥，得到BSA凍干粉。利用本發(fā)明制備的產(chǎn)品包裝為密封瓶裝或塑料袋裝，保存溫度小于等于20°C，本發(fā)明所用的檸檬酸三鈉為抗凝劑，市售，辛酸鈉為牛血清白蛋白的保護劑，使之在溫度55°C以上不變性，市售，鹽酸及乙醇為市售；對本發(fā)明制備的牛血清白蛋白進行檢驗，其質(zhì)量檢測結(jié)果見表一，從表一中可以看出，本發(fā)明的質(zhì)量完全符合行業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；對于本發(fā)明的產(chǎn)品，純度用電泳法測定，如圖2和圖3所示，從圖中可以看出，利用本發(fā)明制備的牛血清白蛋白雜質(zhì)含量少、純度較高。
權(quán)利要求
1.一種高純度牛血清白蛋白的制備方法，其特征在于包括如下步驟 A)分離血漿取新鮮牛血,加入血量體積的10%的抗凝劑，輕輕攪拌使抗凝劑分散均勻，4°C，1500rpm離心，分離收集血漿； B)制備血清室溫下，取所述血漿，邊攪拌邊加入無水氯化鈣粉末，待所述無水氯化鈣粉末完全溶解后靜置0. 8^1. 2h，將凝結(jié)成果凍狀的血漿塊打碎，5000 rpm離心，上層澄清液體即為牛血清，下層乳黃色凝塊為纖維蛋白，收集所述牛血清； C)加熱提取取所述牛血清用pH5.2 7. 0 PBS緩沖液稀釋2 10倍后放入帶夾層的反應(yīng)釜中，加入辛酸鈉并攪拌使之完全溶解,再加入所述牛血清體積的59^20%的乙醇，用I當(dāng)量濃度的HCl調(diào)pH值至4. (T6. 2，油浴加熱，使反應(yīng)釜中牛血清的溫度保持在55 75°C，0.8^1. 2h后取出反應(yīng)液，壓濾機壓濾，收集濾液，棄掉濾渣； D)置換溶液和濃縮將所述濾液用20000分子量以下的超濾裝置過濾并將緩沖體系置換為pH8. 0 8. 5 Tris-HCl，同時進行濃縮； E)DEAE柱進一步純化裝柱后用pH8.(T8. 5 Tris-HCl平衡柱子，將超濾濃縮后的BSA溶液泵入層析柱中，并繼續(xù)用pH8. (T8. 5 Tris-HCl平衡，待接入純化系統(tǒng)中的核酸蛋白檢測儀吸光值有所上升時，收集穿透組分，待穿透峰回落至基線后用含0. 15M NaCl的PH8. (T8. 5 Tris-HCl溶液洗脫，待核酸蛋白檢測儀吸光值有所上升時，收集洗脫組分并脫鹽濃縮，得到脫鹽濃縮后的洗脫組分； F)BSA劑型處理取所述脫鹽濃縮后的洗脫組分，加入防腐劑、絡(luò)合劑，得到高純BSA溶液，或直接進行冷凍干燥，得到BSA凍干粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高純度牛血清白蛋白的制備方法，其特征在于步驟A)中所述抗凝劑采用濃度為39T5%的檸檬酸三鈉溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高純度牛血清白蛋白的制備方法，其特征在于步驟B)中所述加入無水氯化鈣粉末的量為3 10g/L血漿。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高純度牛血清白蛋白的制備方法，其特征在于步驟C)中所述加入辛酸鈉的量為flOmmol/L血清。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高純度牛血清白蛋白的制備方法，其特征在于步驟C)中所述乙醇的濃度為95%。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高純度牛血清白蛋白的制備方法，其特征在于步驟A)和步驟B)在集中屠宰場分散操作，步驟0、0)、幻、的在潔凈廠房集中操作。
全文摘要
本發(fā)明提供一種高純度牛血清白蛋白的制備方法，包括如下步驟A)分離血漿；B)制備血清；C)加熱提?。籇)置換溶液和濃縮；E)DEAE柱進一步純化；F)BSA劑型處理。本發(fā)明用料少，可節(jié)約投入；工藝流程短，省時省力；操作簡單，重復(fù)性好，適合大批量生產(chǎn)；目標(biāo)產(chǎn)品得率高、純度高、質(zhì)量好，本方法制得的成品牛血清白蛋白經(jīng)過質(zhì)量檢驗，產(chǎn)品質(zhì)量完全符合現(xiàn)行行業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，使用效果良好，可滿足生化試劑與生物制藥行業(yè)對牛血清白蛋白的質(zhì)量要求；成本低，經(jīng)濟效益顯著。
文檔編號C07K14/765GK102952187SQ20121050273
公開日2013年3月6日 申請日期2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月30日
發(fā)明者李攀, 袁正明, 談宇清 申請人:深圳市美凱特科技有限公司