專利名稱：：應用一氧化氮前體的治療方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及用于分析氨甲酰磷酸合成酶I表型的分離的多核苷酸分子，這些分子編碼的肽，及其關于新鑒別的氨甲酰磷酸合成酶I多態(tài)性的診斷和治療應用。這種應用是確定對象對于高氨血癥、精氨酸產(chǎn)生降低及骨髓移植物毒性(bonemarrowtransplanttoxicity)的易感性的方法，所述方法基于分析分離自所述對象活檢組織的核酸樣品?？s寫表ABG-動脈血氣ALI-急性肺損傷ASO-等位基因特異性寡核苷酸ATP-腺苷三磷酸BCAA-支鏈氨基酸BMT-骨髓移植(物)BSA-牛血清白蛋白BuCy-白消安，環(huán)磷酰胺BUN-血液尿素氮CBVP16-環(huán)磷酰胺，亞硝脲氮芥，表鬼臼毒素吡喃葡糖苷cc-立方厘米CPSI-氨甲酰磷酸合成酶ICTC-環(huán)磷酰胺，三胺硫磷，碳鉑CVP16TBI-環(huán)磷酰胺，表鬼臼毒素吡喃葡糖苷，整體放射ECMO-體外膜氧合(extracorprealmembraneoxygenation)fl-全長GSHosc-谷胱甘肽合成酶HAT-次黃嘌呤，氨基蝶呤，胸苷HVOD-肝靜脈梗阻癥iNO-吸入的一氧化氮KDa-千道爾頓KLH-匙孔血藍蛋白l-升LAT-連接激活的翻譯LCR-連接酶鏈反應MAS-胎糞吸入綜合征NAG-n-乙酰谷氨酸NASDATM-基于核酸序列的擴增NO或NOx-一氧化氮NOS-一氧化氮合成酶O/C-鳥氨酸/瓜氨酸PBSCT-外周血干細胞移植PPHN-新生兒持續(xù)性肺動脈高壓PCR-聚合酶鏈反應RCR-修復鏈反應RDS-呼吸窘迫綜合征REF-限制性核酸內(nèi)切酶指紋分析RT-逆轉錄酶SSCP-單鏈構象多態(tài)性SDA-鏈置換激活SNP-單核苷酸多態(tài)性TC-三胺硫磷，環(huán)磷酰胺TEAA-全部必需氨基酸UC-尿素循環(huán)UCF-尿素循環(huán)功能VPA-丙戊酸
背景技術：
精氨酸的體內(nèi)合成途徑從鳥氨酸開始。鳥氨酸組合氨甲酰磷酸鹽產(chǎn)生瓜氨酸，瓜氨酸與天冬氨酸組合，在存在腺苷三磷酸(ATP)的條件下產(chǎn)生精氨酸代琥珀酸(argininosuccinate)。最后，從精氨酸代琥珀酸中分裂出反丁烯二酸產(chǎn)生精氨酸。精氨酸的降解途徑是通過精氨酸酶的水解作用產(chǎn)生鳥氨酸和尿素。這些反應形成尿素循環(huán)。尿素循環(huán)是除去內(nèi)源和外源蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生的廢物氮的主要途徑，示于圖1?；煹囊粋€常見的副作用是破壞代謝過程。事實上，高劑量化療中使用的藥劑影響許多細胞過程。位于化學敏感組織如肝和胃腸道中的代謝過程面臨特別大的破壞危險。氮的持續(xù)周轉和加工涉及機體的所有組織，但是尿素循環(huán)的首要步驟限于肝和腸道。與骨髓移植(BMT)相關的高劑量化療干擾肝功能并且對腸道有毒性。提示尿素循環(huán)功能失調(diào)的特發(fā)性高氨血癥據(jù)報道與經(jīng)歷骨髓移植的患者高死亡率相關。Daviesetal.，BoneMarrowTransplantation，171119-1125(1996)；Tseetal.，AmericanJournalofHematology，38140-141(1991)；及Mitchelletal.，AmericanJournalofMedicine，85662-667(1988)。BMT的一個常見并發(fā)癥是肝靜脈梗阻癥(HVOD)。HVOD與黃疸、肝大小增加和正常的肝血流破壞相關。HVOD在將近20-40％的患者中出現(xiàn)，并且與嚴重的發(fā)病率和死亡率相關。在高劑量化療后，一氧化氮(NO)在調(diào)節(jié)血管緊張度及維持肝和肺小靜脈開放中起作用。完整的尿素循環(huán)功能功能不僅對于氨的排泄是重要的，對于維持足夠的精氨酸(NO的前體)的組織水平也是重要的。氨甲酰磷酸合成酶I(CPSI)是通過尿素循環(huán)催化尿素產(chǎn)生的首要步驟的限速酶。CPSI是高度組織特異性的，其功能和產(chǎn)生基本上限于肝和腸道?；蚪M編碼的CPSI在胞質(zhì)中產(chǎn)生并且被轉運到線粒體中，在此其被分裂成其成熟的160kD單體形式。所述酶組合氨和碳酸氫鹽形成氨甲酰，消耗兩個ATP分子及使用輔因子N-乙酰-谷氨酸(NAG)。降低尿素循環(huán)功能的任何遺傳誘因均導致高氨血癥，并且很可能是造成與包括BMT相關的毒性在內(nèi)的亞最佳(sub-optimal)的尿素循環(huán)功能相關疾病的嚴重性的因素。因此，本領域需要鑒定患有與亞最佳的尿素循環(huán)功能相關疾病、經(jīng)歷BMT或者面臨暴露于環(huán)境或藥理學肝毒素的群體中存在的等位基因。考慮到尿素循環(huán)中CPSI的作用，因此需要鑒定這種群體中存在的CPSI等位基因。概述本發(fā)明揭示了篩選對象亞最佳尿素循環(huán)功能的易感性的方法。所述方法包括如下步驟(a)從對象獲得核酸樣品；及(b)檢測所述對象核酸樣品中氨甲酰磷酸合成酶I(CPSI)基因的多態(tài)性，多態(tài)性的存在表明對象對于亞最佳尿素循環(huán)功能的易感性。根據(jù)本發(fā)明，關于確定對象對于骨髓移植物毒性的易感性而特別提供了多態(tài)性的檢測。在一些實施方案中，氨甲酰磷酸合成酶多肽的多態(tài)性包含CPSI基因的外顯子36中C顛換為A，在一些實施方案中相應于CPSI基因的cDNA的第4340位核苷酸C顛換為A。在一些實施方案中，在相應于CPSI基因的cDNA的第4340位核苷酸的C顛換為A進一步包含三聯(lián)體密碼子AAC轉變?yōu)锳CC，其編碼在第1405位氨基酸具有蘇氨酸部分的CPSI多肽。本發(fā)明還提供了分離的和純化的生物學活性CPSI多肽。在一些實施方案中，本發(fā)明的多肽是一種重組多肽。在一些實施方案中，本發(fā)明的多肽包含在第1405位氨基酸具有天冬酰胺部分的人CPSI。本發(fā)明還提供了一種分離的和純化的多核苷酸，其編碼生物學活性CPSI多肽。在一些實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸包含人DNA分子。在一些實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸包含相應于CPSI基因的cDNA，其包括第4340位核苷酸由C顛換為A。在一些實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸進一步包含相應于CPSI基因的cDNA，其包括在4340位核苷酸的三聯(lián)體密碼子ACC轉變?yōu)锳AC，及編碼在第1405位氨基酸具有天冬酰胺部分的CPSI多肽。本發(fā)明還提供了適用于進行本發(fā)明的方法及用于檢測本發(fā)明的多肽和多核苷酸的試劑盒和試劑，包括寡核苷酸、核酸探針和抗體。本發(fā)明還揭示了制備本發(fā)明的多核苷酸和多肽的方法。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及基于本發(fā)明所述氨甲酰磷酸合成酶I(CPSI)基因的多態(tài)性的治療方法。這種治療方法包括施用一氧化氮前體治療和預防亞最佳尿素循環(huán)功能介導或調(diào)節(jié)的疾病(例如骨髓移植物毒性)及使用本發(fā)明分離的和純化的多核苷酸的基因治療方案。因此，本發(fā)明的一個目的是提供多核苷酸分子，其可用于分析脊椎動物對象中氨甲酰磷酸合成酶I(CPSI)。本發(fā)明的另一個目的是基于通過分析得自對象組織的核酸包括基因組DNA和cDNA而獲得的信息，確定脊椎動物對象、特別是人對象中CPSI表型。本發(fā)明的再一個目的是提供確定CPSI表型的簡便技術。本發(fā)明的另一個目的是提供用于產(chǎn)生抗體的多肽和多核苷酸分子，所述抗體可以區(qū)分組成CPSI多態(tài)性的不同形式的CPSI。本發(fā)明的另一個目的是提供診斷和治療與CPSI多態(tài)性相關的臨床病癥的方法。上文闡述了本發(fā)明的一些目的，結合如下附圖和實施例可以顯而易見本發(fā)明的其它目的。附圖簡述圖1是尿素循環(huán)示意圖；圖2是未反映被識別的突變的共有CPSI蛋白的示意圖；圖3是描述蛋白質(zhì)中一些已知突變及描述本發(fā)明T1405N多態(tài)性的共有CPSI蛋白的示意圖；圖4是公認的CPSI轉錄后修飾的示意圖；圖5是CPSI的人基因組基因座的示意圖；圖6是全長CPSIcDNA的克隆方案示意圖；圖7是全長CPSIcDNA的另一種克隆方案示意圖；圖8是在COS-7細胞中表達的CPSI蛋白的代謝活性的示意圖；圖9是CPSIcDNA中內(nèi)含予的大小和位置的示意圖；圖10是外顯子36(SEQIDNO5)的圖示，示出本發(fā)明的代表性寡核苷酸引物的位置；圖11示出T1405CPSI的氨基酸序列(SEQIDNO4)(終止密碼子翻譯為“X”，165049MW，1.163602e+07CN)，起始氨基酸甲硫氨酸被認為是在-1位；圖12示出N1405CPSI的氨基酸序列(SEQIDNO2)(終止密碼子翻譯為“X”，165062MW，1.161634E+07CN)，起始氨基酸甲硫氨酸被認為在-1位；圖13是血漿精氨酸水平的濃度曲線圖；圖14是接受瓜氨酸與安慰劑的患者之間在48小時研究期間的平均血壓無顯著不同(P＝0.53，多變量ANCOVA)的圖示。對于治療組和安慰劑組示出了平均值+/-SD。圖15是示出在手術后立即接受或者手術后12小時接受瓜氨酸的患者中血清瓜氨酸水平中位數(shù)顯著較高的條形圖(P＝0.012，P＝0.015)，而在接受安慰劑的患者中分流手術后瓜氨酸濃度在手術后即刻或者手術后12小時均顯著低于基線(P＝0.020，P＝0.001)。圖16是示出在手術后12小時接受瓜氨酸的患者中平均血清精氨酸水平顯著較高的條形圖(P＝0.037)，而在接受安慰劑的患者中分流手術后精氨酸濃度在手術后12小時顯著低于基線(P＜0.001)。詳細描述本發(fā)明揭示了令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，即氨甲酰磷酸合成酶I(CPSI)的多態(tài)性，所述酶催化尿素循環(huán)的第一個限速步驟。特別地，所述多態(tài)性特征在于CPSI中的氨基酸取代，即第1405位氨基酸的蘇氨酸/天冬酰胺取代(雜合性＝.44)。本發(fā)明還揭示了令人驚奇地觀測到CPSI基因中單核苷酸改變是CPSI多態(tài)性的原因。特別地，CPSI基因的外顯子36的C顛換為A使得三聯(lián)體密碼子ACC改變?yōu)锳AC，導致編碼的CPSI多肽中T1405N的改變。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，可以對衍生自脊椎動物對象的組織的核酸分子進行操作，以用于分析CPSI表型，產(chǎn)生這種核酸分子編碼的肽及用于關于CPSI多態(tài)性的診斷和治療方法。這些核酸分子可以如下述擴增，所述分子通常包括RNA、基因組DNA和衍生自RNA的cDNA。A.總則目前大多數(shù)可利用的CPSI結構信息得自對大鼠CPSI酶的研究。大鼠CPSI酶和人CPSI酶均包含1500個殘基的單個多肽，并且呈現(xiàn)大約95％的序列相同性。大鼠CPSI多肽和核酸序列信息由Nyunoya，H.，etal.，JournalofBiologicalChemistry2609346-9356(1985)揭示，在GENBANK登記號為AH005315、M12335、M12328、M12327、M12326、M12325、M12324、M12323、M12322、M12321、M12320、M12319、M12318和M11710，在此并入?yún)⒖?。大鼠CPSI的結構信息得自序列同源性和底物與輔因子結合研究；然而，無晶體學數(shù)據(jù)可利用。成熟CPSI實際上是含有2個主要區(qū)域的模塊。第一個區(qū)域(殘基39-406)與大腸桿菌(Escherichiacoli)的異源二聚體CPS的小亞基同源。細菌和酵母CPSI多肽和核酸序列信息在GENBANK登記號AB005063、X67573、M27174、P07258、P03965、BAA21088、SYBYCP、SYBYCS和SYECCS中揭示，在此并入?yún)⒖?。另一個區(qū)域(殘基417-1500，后文稱作CPS結構域)與大腸桿菌CPS的大亞基同源。Meister，A.，Adv.Enzymol.Relat.AreasMol.Biol.62315-374(1989)。這個亞基負責從氨合成氨甲酰磷酸及底物與輔因子的結合。Meister，A.，Adv.Enzymol.Relat.AreasMol.Biol.62315-374(1989)。CPS結構域通過基因復制而產(chǎn)生并且在原基因組(pro-genome)中串聯(lián)融合，如圖2所示，其自身由兩個磷酸化結構域和參與結合n-乙酰-谷氨酸(NAG)的一個C末端調(diào)節(jié)結構域組成。Nyunoya，H.，etal.，JournalofBiologicalChemistry2609346-9356(1985)。如圖2所示，殘基407-416是兩個主要亞基之間的橋梁，殘基1-38組成在被除去之前將未成熟的CPSI定向于線粒體的前導肽。圖2還示出所述小亞基樣區(qū)域由兩個大約相等的亞結構域組成。相互作用亞結構域(殘基39-212)相應于大腸桿菌CPS的小亞基中的與大亞基締合必需的區(qū)域。谷氨酰胺酶亞基(殘基213-406)與一些谷氨酰胺酰胺轉移酶同源，及與從具有相當谷氨酰胺酶活性的其它成分中產(chǎn)生的CPSI區(qū)域同源，如Guillou，F(xiàn).，etal.ProcNatlAcadSci868304-8308(1989)；Nyunoya，H.，etal.，JournalofBiologicalChemistry2609346-9356(1985)；和Guy，H.I.etal.，JournalofBiologicalChemistry2702190-2197(1995)所述。由于CPSI缺少分裂谷氨酰胺需要的半胱氨酸殘基，因此谷氨酰胺酶亞結構域在這種酶中的功能還不確定。確信CPS結構域(相應于大腸桿菌中大亞基)催化從氨中合成氨甲酰磷酸鹽，反應式如下如圖1和2所示，這個反應包括三個步驟碳酸氫鹽由在此稱作ATPA的ATP分子磷酸化，產(chǎn)生羧基磷酸鹽；從羧基磷酸鹽和氨合成氨甲酰；及由另一ATP分子(ATPB)磷酸化氨甲酰，產(chǎn)生氨甲酰磷酸鹽，如Rubio，V.andGrisolia，S.，Enzyme26233-239(1981)所述。如圖4所示，CPS結構域看起來是通過復制及復制成分的串聯(lián)融合而產(chǎn)生的；因此，其氨基端一半和COOH-端一半是同源的，如Nyunoya，H.，etal.，JournalofBiologicalChemistry2609346-9356(1985))所述。每個同源一半均分別包含大約40和20kD的氨基-和COOH-末端結構域，其中確信40kD的氨基一半結構域參與碳酸氫鹽磷酸化(碳酸氫鹽磷酸化結構域，殘基417-788)(圖2)。COOH-一半的相應結構域通過氨基甲酸磷酸化結構域(殘基969-1329)參與氨基甲酸磷酸化(圖2)，如Alonso，E.andRubio，V.，EuropeanJournalofBiochemistry229377-384(1995))所述。這些磷酸化結構域與磷酸化碳酸氫鹽的、已知三維結構的生物素羧化酶(Toh，H.etal.，EuropeanJournalofBiochemistry215687-696(1993))以及催化相似反應的兩種酶，DD-連接酶和谷胱甘肽合成酶(GSHase)同源(Artymiuk，P.J.etal.，NatureStruct.Biol.3128-132(1996))。因此，關于這些酶的信息有助于解釋在CPSI缺陷患者中同源結構域中發(fā)現(xiàn)的突變。再次參考圖2，確定大亞基樣區(qū)域的20kDa結構域，氨基末端一半的結構域(殘基789-968)的功能。相反，相應COOH-末端結構域(殘基1330-1500)稱作變構結構域，因為CPSI的激活物n-乙酰-谷氨酸(NAG)和大腸桿菌酶的核苷酸效應物UMP和IMP結合在這個結構域中，如Rodriguez-Aparicio，L.B.etal.，Biochemistry283070-3074(1989)和Cervera，J.etal.，Biochemistry357247-7255(1996)所述。A.1.酶加工人CPSImRNA編碼165kD的、1500個氨基酸的前蛋白質(zhì)。這種前體的氨基末端含有38個殘基，包括8個堿性殘基，1個酸性殘基，在成熟酶起始點4個殘基前具有Pro-Gly序列(Nyunoya，H.etal.，JournalofBiologicalChemistry2609346-9356(1985)；Lagace，M.etal.，JournalofBiologicalChemistry26210415-10418(1987)。這個高度保守的信號序列促進酶進入線粒體基質(zhì)，在此其被除去以產(chǎn)生160kD成熟酶。A.2.CPSI的正常表達CPSI酶活性首先在妊娠5-10周的人胎兒肝臟中檢測到(Moorman，A.F.etal.HistochemicalJournal22457-468(1990))。在妊娠20周時，CPSI的水平達到將近50％的正常成人水平，該水平保持直至出生，之后在20歲逐步升高至成人水平(Raiha，N.C.R.andSuihkonen，J.ActaPaediatricaScand57121-127(1968))。CPSI的組織表達基本限于肝，在腸道和腎中有微量活性。當在成人期肝臟產(chǎn)生其成熟腺泡結構時，CPSI被區(qū)室化(compartmentalized)在末端門小靜脈(terminalportalvenules)周圍的實質(zhì)細胞中(Moorman，A.F.etal.HistochemicalJournal22457-468(1990))。除了被區(qū)室化之外，還已知一些因素對于調(diào)節(jié)CPSI活性和表達是重要的。例如，鳥氨酸水平低下或者缺少使得CPSI活性降低，大概是由于積聚的氨甲酰磷酸鹽(CP)的抑制作用所致，如Jackson，M.J.etal.，AnnualReviewofGenetics20431-464(1986)；和Rubio，V.，BiochemicalSocietyTransactions21198-202(1993))所述。CPSImRNA和酶的水平均隨著高蛋白飲食而增加，并且應答胰高血糖素和糖皮質(zhì)激素(Jackson，M.J.etal.，AnnualReviewofGenetics20431-464(1986)；deGroot，C.J.，etal.，Biochemical&BiophysicalResearchCommunications124882-888(1984))。在檢驗的正常未受刺激的肝組織中，觀測到豐富的CPSImRNA。B.篩選技術根據(jù)本發(fā)明，提供了一種篩選導致對象中氨清除率下降和精氨酸產(chǎn)生降低的亞最佳尿素循環(huán)功能易感性的方法。所述方法包括(a)獲得對象核酸樣品；及(b)檢測對象核酸樣品中氨甲酰磷酸合成酶I(CPSI)基因的多態(tài)性，所述多態(tài)性的存在表明對象對于導致氨清除率下降和精氨酸產(chǎn)生降低的亞最佳尿素循環(huán)功能的易感性。根據(jù)本發(fā)明，特別提供了多態(tài)性的檢測以確定對象對于骨髓移植物毒性的易感性。進一步注意到本發(fā)明的多態(tài)性可用于在除了BMT或者施用丙戊酸之外的許多情形中預測毒性，如本文及在實施例中揭示。所述多態(tài)性還涉及在如成人肝硬化、其它藥物毒性、新生兒肝功能削弱等情形中介導或調(diào)節(jié)被破壞的氨清除率和精氨酸產(chǎn)生。如本文及權利要求書中所用，術語“多態(tài)性”是指群體中出現(xiàn)兩或多個經(jīng)遺傳確定的替代序列或等位基因。多態(tài)性標記是出現(xiàn)分歧的基因座。所述標記例如具有至少兩個等位基因，每個等位基因的出現(xiàn)頻率均高于1％。多態(tài)性基因座可以是小如一個堿基對。本發(fā)明有用的核酸分子包括與第4340位堿基和外顯子36內(nèi)C顛換為A將三聯(lián)體密碼子從ACC轉變?yōu)锳AC的區(qū)域中CPSI序列特異性雜交的那些分子。這種顛換導致所編碼的CPSI多肽中T1405N改變。典型地，這些核酸長度為至少大約20個核苷酸，并且具有相應于在共有CPSIcDNA序列(EC6.3.4.16)第4340位堿基C顛換為A的區(qū)域的核苷酸序列，所述顛換將三聯(lián)體密碼子從ACC轉變?yōu)锳AC。本文所用術語“共有序列”是指CPSI的核酸或蛋白質(zhì)序列，已知其核酸或氨基酸序列在攜帶編碼正常功能蛋白質(zhì)或其核酸自身具有正常功能的基因的個體群體中高頻率出現(xiàn)。本發(fā)明提供的核酸分子可以根據(jù)本領域已知的任何技術標記，如放射性標記、熒光標記、酶標記、序列標記等等。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，所述核酸分子在第4340位堿基C顛換為A。這種分子可用作等位基因特異性寡核苷酸探針以追蹤例如對象家族中的特殊突變?？梢詫C體樣品進行測試以確定CPSI基因在第4340位堿基是否含有C顛換為A。進行測試的合適機體樣品包括包含得自活檢組織的DNA、RNA或蛋白質(zhì)的那些樣品，包括肝和腸道活檢組織；或者得自血液、出生前樣品；或者胚胎組織。在本發(fā)明的一些實施方案中，提供了一對分離的寡核苷酸引物5′-AGCTGTTTGCCACGGAAGCC-3′(SEQIDNO6)和5′-CCCAGCCTCTCTTCCATCAGAAAGTAAG-3′(SEQIDNO7)。這些引物衍生自CPSI外顯子36(本發(fā)明多態(tài)性的位置)和相關的內(nèi)含子序列(SEQIDNO5)，產(chǎn)生119個堿基對的片段。衍生自CPSI外顯子36(本發(fā)明多態(tài)性的位置)和相關內(nèi)含子序列(SEQIDNO5)的其它引物在圖10中SEQIDNO8-10及實施例2(SEQIDNO15和16)中示出。所述寡核苷酸引物用于診斷對象處于高氨血癥危險，如可以是BMT并發(fā)癥或毒性的結果。所述引物在測序之前指導靶多核苷酸擴增。這些獨特的CPSI外顯子36寡核苷酸引物基于鑒別外顯子36中C顛換為A而設計和生產(chǎn)。在本發(fā)明的一些實施方案中，提供了分離的等位基因特異性寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明還提供了與其基本相似的序列。所述等位基因特異性寡核苷酸用于診斷對象處于高氨血癥危險，如可以是BMT并發(fā)癥或毒性的結果。這些獨特的CPSI外顯子36寡核苷酸引物基于鑒別外顯子36中C顛換為A而設計和生產(chǎn)。術語“基本上互補”或者“基本序列”是指在嚴格條件下與提供的序列(例如SEQIDNO5-10)和/或與任一SEQIDNO5-10具有足夠同源性的序列雜交的序列，由此本發(fā)明的等位基因特異性寡核苷酸與所述序列雜交。本文所用術語“分離的”包括基本上沒有其它核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物或其它與其相締合的物質(zhì)的寡核苷酸，所述締合是在細胞材料或者在合成培養(yǎng)基中?！鞍卸嗪塑账帷被蛘摺鞍泻怂帷笔侵父信d趣的核酸序列，例如CPSI編碼多核苷酸?？捎糜谝镫s交的其它引物基于本發(fā)明對CPSI多態(tài)性的揭示而易于為本領域技術人員所獲知。本發(fā)明的引物包含足夠長度的寡核苷酸和適當?shù)男蛄?，以對多態(tài)性基因座中大量核酸開始聚合化。CPSI基因座示于圖5。特別地，本文所用術語“引物”在一些實施方案中是指包含CPSI基因的兩或多個脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的序列，在一些實施方案中包含三個以上、在一些實施方案中包含八個以上、及在一些實施方案中包含至少大約20個核苷酸，其中所述DNA序列相對于SEQIDNO1和3中包含的CPSI在第4340位堿基C顛換為A。相對于CPSI在第4340位堿基包含胞嘧啶(C)的等位基因在此稱作“CPSIa等位基因”、“T1405等位基因”或者“蘇氨酸編碼等位基因”。相對于CPSI在第4340位堿基包含腺苷(A)的等位基因在此稱作“CPSIb等位基因”、“N1405等位基因”或者“精氨酸編碼等位基因”。本發(fā)明還提供了區(qū)別CPSI基因的CPSIa和CPSIb等位基因的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與所述CPSI基因的一部分(當所述第4340位核苷酸是腺苷時，其包括相應于所述CPSI基因的cDNA的第4340位核苷酸)雜交，但當所述第4340位核苷酸是胞嘧啶時與所述CPSI基因的所述部分不雜交。本發(fā)明還提供了區(qū)別CPSI基因的CPSIa和CPSIb等位基因的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與所述CPSI基因的一部分(當所述第4340位核苷酸是胞嘧啶時，其包括相應于所述CPSI基因的cDNA的第4340位核苷酸)雜交，但當所述第4340位核苷酸是腺苷時與所述CPSI基因的所述部分不雜交。這種寡核苷酸在一些實施方案中的長度為10-30個堿基。這種寡核苷酸可任選進一步包含可檢測的標記。有益于合成的環(huán)境條件包括存在三磷酸核苷及進行聚合的制劑，如DNA聚合酶，及合適的溫度和pH。在一些實施方案中，所述引物是擴增效力最大的單鏈引物，但也可以是雙鏈的。如果是雙鏈的，首先將引物進行處理以使其鏈分離，之后用于制備延伸產(chǎn)物。所述引物必須足夠長以在存在聚合誘導劑的條件下引發(fā)延伸產(chǎn)物的合成。引物的實際長度依賴于許多因素，包括溫度、緩沖液及核苷酸組成。所述寡核苷酸引物典型含有12-20或更多個核苷酸，但也可以含有較少的核苷酸。本發(fā)明的引物被設計為與被擴增的基因組基因座的每個鏈均“基本上”互補。這意味著所述引物必須是充分互補的以與其各自的鏈在使得所述制劑進行聚合的條件下雜交。換句話說，所述引物應與顛換兩側的5’和3’序列充分互補，以與其雜交并使得基因組基因座擴增。本發(fā)明的寡核苷酸引物用于擴增方法中，所述方法是一種酶促鏈反應，產(chǎn)生與反應步驟數(shù)目相關的指數(shù)值的多態(tài)性基因座。典型地，一個引物與多態(tài)性基因座的負鏈互補，另一引物與正鏈互補。退火引物，變性核酸，隨后用酶和核苷酸延伸，酶如DNA聚合酶I的大片段(Klenow)，產(chǎn)生含有靶多態(tài)性基因座序列的新合成的正鏈和負鏈。由于這些新合成的序列也是模板，因此重復變性、引物退火和延伸步驟循環(huán)導致所述引物限定的區(qū)域(即靶多態(tài)性基因座序列)以指數(shù)值產(chǎn)生。所述鏈反應的產(chǎn)物是一種discreet核酸雙鏈體，具有相應于所用特異性引物的末端的末端。本發(fā)明的寡核苷酸引物可以使用任何合適方法制備，如常規(guī)的磷酸三酯和磷酸二酯方法或其自動化方案。在一些這種自動化方案中，二乙基亞磷酰胺(diethylphosphoramidites)用作起始物，其可以通過Beaucageetal.，TetrahedronLetters221859-1862(1981)所述方法合成。一種在修飾的固體支持物上合成寡核苷酸的方法在美國專利No.4,458,066中描述。任何核酸樣品，純化或非純化形式，倘若其含有或者懷疑含有包含多態(tài)性基因座的核酸序列，則均可用作起始核酸或酸。因此，所述方法可以擴增例如DNA或RNA，包括信使RNA，其中DNA或RNA可以是單鏈或者雙鏈的。在RNA用作模板的情況中，利用將模板逆轉錄為DNA的最佳酶和/或條件。另外，可以利用含有每一個鏈的DNA-RNA雜種。也可以應用核酸的混合物，或者在先前使用相同或不同引物的擴增反應中產(chǎn)生的核酸。被擴增的特異性核酸序列，即多態(tài)性基因座，可以是較大分子的一部分或者最初可以作為分立的分子存在，由此所述特異性序列組成全部的核酸。擴增的序列最初非必須以純化形式存在；其可以是復合物混合物的一小部分，如包含于整個人DNA中。本發(fā)明利用的DNA可以從機體樣品如血液、組織材料(在一些實施方案中是肝組織)等中提取，通過多種技術如Maniatiset.al.inMolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringHarbor，N.Y.，p280-281(1982)所述技術進行。如果提取的樣品是不純的，則在擴增之前使用有效量的試劑進行處理，所述試劑使得樣品細胞或者動物細胞膜開放，并暴露和/或分離核酸的鏈。這種暴露和分離鏈的裂解和核酸變性步驟使得可以更容易地進行擴增。三磷酸脫氧核糖核苷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP單獨或者與引物一起以足夠量加入合成混合物中，將所得溶液加熱至大約90-100℃大約1-10分鐘，在一些實施方案中1-4分鐘。在這個加熱階段之后，使溶液冷卻以進行引物雜交。向該冷卻的混合物中加入實現(xiàn)引物延伸反應的合適制劑(在此稱作聚合劑)，所述反應在本領域技術人員已知的條件下進行。如果聚合劑是熱穩(wěn)定的，則其也可以與其它試劑一起加入。這種合成(或者擴增)反應可以在室溫直至一定溫度下進行，高于此一定溫度則此聚合劑不再起作用。因此，例如如果使用DNA聚合酶，則溫度通常不高于大約40℃。所述反應通常在室溫下進行。聚合劑可以是實現(xiàn)引物延伸產(chǎn)物合成的任何化合物或者系統(tǒng)，包括酶。為此合適的酶包括例如大腸桿菌DNA聚合酶I、大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段、聚合酶突變蛋白、逆轉錄酶，其它酶包括熱穩(wěn)定酶(即在溫度足夠高以引起變性之后進行引物延伸的那些酶)，如Taq聚合酶。合適的酶促進核苷酸以正確方式組合形成與每個多態(tài)性基因座核酸鏈互補的引物延伸產(chǎn)物。通常，所述合成從每個引物的3’末端開始，以5’方向沿著模板鏈行進，直至合成終止，產(chǎn)生不同長度的分子。新合成的鏈及其互補核酸鏈在上述雜交條件下形成雙鏈分子，這個雜種在所述方法的隨后步驟中使用。在接下來的步驟中，將新合成的雙鏈分子使用上述任何方法進行變性，提供單鏈分子。所述變性、退火和延伸產(chǎn)物合成的步驟可以重復進行，以擴增靶多態(tài)性基因座核酸序列達到檢測需要的程度。產(chǎn)生的特異性核酸序列的量以指數(shù)方式積聚。PCR.APracticalApproach，ILRPress，Eds.McPhersonetal.(1992)。擴增產(chǎn)物可以通過Southern印跡分析檢測，使用或不使用放射性探針。在一個這樣的方法中，例如擴增含有極低水平多態(tài)性基因座核酸序列的DNA小樣品，通過Southern印跡技術或相似地使用斑點印跡分析進行分析。高水平的擴增信號使得可便利地使用非放射性探針或標記?；蛘?，用于檢測擴增產(chǎn)物的探針可以直接或者間接可檢測地標記，例如使用放射性同位素、熒光化合物、生物發(fā)光化合物、化學發(fā)光化合物、金屬螯合劑或者酶進行標記。本領域技術人員已知與探針結合的其它合適標記，或者使用常規(guī)實驗能確定這種標記。通過本發(fā)明方法擴增的序列可以在溶液中或者與固體支持物結合之后進一步評價、檢測、克隆、測序等等，通過通常用于檢測特異性DNA序列的方法進行，如雙脫氧測序、PCR、寡聚體限制(Saikietal.，Bio/Technology31008-1012(1985)、等位基因特異性寡核苷酸(ASO)探針分析(Conneretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80278(1983)、寡核苷酸連接分析(OLAs)(Landgrenet.al.，Science2411007，1988)等等。關于DNA分析的分子技術已經(jīng)加以綜述(Landgrenet.al.，Science242229-237，1988)。在一些實施方案中，擴增方法是PCR，如本發(fā)明及美國專利No.4,683,195、4,683,202和4,965,188所述，所述文獻在此均并入?yún)⒖?，這些是本領域技術人員通常使用的方法。已經(jīng)描述了另外的擴增方法，只要使用本發(fā)明的引物通過PCR擴增的CPSI基因座通過另外的方式能被相似地擴增。這種另外的擴增系統(tǒng)包括但不限于自動維持序列復制(self-sustainedsequencereplication)，其從感興趣的短RNA序列和T7啟動子開始。逆轉錄酶將所述RNA拷貝進cDNA并降解RNA，隨后逆轉錄酶聚合DNA的第二條鏈。另一種核酸擴增技術是基于核酸序列的擴增(NASBATM)，其使用逆轉錄和T7RNA聚合酶，并摻入兩個引物以靶定其循環(huán)方案。NASBATM擴增可以用DNA或RNA開始并以任一個結束，在60-90分鐘內(nèi)擴增大約108拷貝?；蛘?，核酸可以通過連接激活的轉錄(LAT)而擴增。LAT從單鏈模板和單一引物開始運轉，所述引物部分是單鏈的，部分是雙鏈的。擴增通過cDNA與啟動子寡核苷酸的連接而起始，在幾小時內(nèi)擴增大約108至大約109倍。可以利用QB復制酶系統(tǒng)，將稱作MDV-1的RNA序列附著于與感興趣DNA序列互補的RNA上。在與樣品混合的基礎上，雜種RNA在樣品的mRNA中發(fā)現(xiàn)其互補體并結合，激活所述復制酶拷貝感興趣的尾隨(tag-along)序列。另一種核酸擴增技術連接酶鏈反應(LCR)是使用感興趣序列的兩個不同標記的部分，在樣品存在連續(xù)序列的條件下通過連接酶共價鍵合，形成新靶。修復鏈反應(RCR)核酸擴增技術使用兩種互補和靶特異性寡核苷酸探針對、耐熱聚合酶和連接酶、及DNA核苷酸，以幾何學擴增靶序列。2-堿基缺口分隔寡聚探針對，所述RCR填補并接合該缺口，模擬正常的DNA修復。通過鏈置換激活(SDA)的核酸擴增技術利用短的引物，其含有HincII的識別位點及在5’末端具有結合靶DNA的短突出端。DNA聚合酶填補與具有含硫腺嘌呤類似物的突出端相對的引物部分。加入HincII但只切割未修飾的DNA鏈。缺少5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶進入缺口部位并開始聚合，置換初始引物鏈下游并構建新的引物以作為更多的引物。SDA在37℃在2小時內(nèi)產(chǎn)生高于大約107倍擴增。與PCR和LCR不同，SDA不需要儀表化溫度循環(huán)。本發(fā)明方法使用的另一種擴增系統(tǒng)是QB復制酶系統(tǒng)。盡管本發(fā)明使用PCR作為擴增方法的實例，但是也可以使用這些其它方法擴增CPSI基因座。因此，本文及權利要求書中所用術語“擴增技術”涵蓋了所有前述方法。在本發(fā)明的一些實施方案中，提供了一種診斷或鑒別具有高氨血癥傾向或者較高易感性(處于患病危險中)的對象的方法，包括通過雙脫氧測序對對象樣品的靶核酸進行測序，在一些實施方案中，隨后擴增所述靶核酸。在本發(fā)明的一些實施方案中，提供了一種診斷具有高氨血癥傾向或者較高易感性(處于患病危險中)的對象的方法，包括將對象樣品的靶核酸與檢測CPSI多態(tài)性存在的試劑接觸，并檢測所述試劑。另一種方法包括將對象樣品的靶核酸與檢測在第4340位堿基(即外顯子36)存在C顛換為A的試劑接觸，并檢測所述顛換。本領域技術人員熟知許多雜交方法。其中許多方法用于進行本發(fā)明。肝靜脈梗阻癥(HVOD)是骨髓移植(BMT)的一種常見毒性作用。其在大約20-40％的患者中發(fā)生，并且與嚴重的發(fā)病率和死亡率相關。根據(jù)本發(fā)明，在試圖鑒別不均衡性跡象中，檢測了兩種CPSI等位基因在經(jīng)歷BMT的HVOD和非HVOD組中的頻率。結果表明本發(fā)明揭示的CPSI多態(tài)性導致對BMT毒性的易感性。因此，本發(fā)明提供了一種篩選對BMT毒性、特別是對HVOD具有易感性的對象的方法，通過檢測CPSI多態(tài)性進行。本發(fā)明方法中使用的材料非常適于制備診斷試劑盒。這種試劑盒可包含一個載體，其被區(qū)室化為包含密閉的一或多個容器，如小瓶、試管等等，每個容器均包含所述方法中使用的單獨的元件。例如，一個容器中可包含擴增CPSIDNA的材料，包括擴增來自對象的所述靶DNA必需的酶和寡核苷酸引物。所述寡核苷酸引物包括具有選自包括但不限于SEQIDNO6-10序列的引物，或者與其基本上互補或者基本上同源的引物序列。5’和3’多核苷酸序列兩側的靶基本上具有SEQIDNO5所示序列，或者與其基本上互補或者同源的序列。根據(jù)本發(fā)明的揭示，擴增CPSI的其它寡核苷酸引物為本領域技術人員所已知或者易于為其所知。本發(fā)明的試劑盒可進一步包含用于從得自對象的生物學樣品中提取核酸樣品的一或多種試劑。本領域技術人員顯而易見的任何這種試劑均涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，一種合適的組織裂解緩沖液以及捕獲核酸樣品的玻璃珠懸浮液及從玻璃珠上洗脫核酸樣品的洗脫緩沖液包含用于從得自對象的生物學樣品中提取核酸樣品的試劑。其它例子包括可商購的，如GENOMICISOLATIONKITA.S.A.P.TM(BoehringerMannheim，Indianapolis，Ind.)、基因組DNA分離系統(tǒng)(GIBCOBRL，Gaithersburg，Md.)、ELU-QUIKTMDNA純化試劑盒(Schleicher&Schuell，Keene，N.H.)、DNA提取試劑盒(Stratagene，LaJolla，Calif.)、TURBOGENTM分離試劑盒(Invitrogen，SanDiego，Calif.)等等。根據(jù)廠商指導使用這些試劑盒通常可以純化DNA，之后進行本發(fā)明的方法。C.影響CPSI編碼多核苷酸及其編碼的CPSI多肽的定義根據(jù)本發(fā)明，提供了純化和分離的CPSI編碼多核苷酸及其編碼的CPSI多肽。本發(fā)明特別提供了CPSI編碼多核苷酸，其包含在CPSI基因的第4340堿基位(即在外顯子36內(nèi))C顛換為A的CPSI編碼多核苷酸，這樣將三聯(lián)體密碼子從ACC改變?yōu)锳AC，導致所編碼的CPSI多肽中T1405N改變。本發(fā)明還特別提供了包含T1405N改變的編碼的CPSI多肽。因此，根據(jù)本發(fā)明還提供了等位基因變體多核苷酸及其編碼的多肽。另外，根據(jù)本發(fā)明還提供了生物學活性的CPSI多肽，及編碼這種CPSI多肽的CPSI編碼多核苷酸。生物學活性的例子包括介導尿素循環(huán)的第一個步驟的生物學活性及與抗CPSI抗體交叉反應的生物學活性。本發(fā)明提供的CPSI編碼多核苷酸和多肽在尿素循環(huán)的生物學重要性中具有的廣泛用途，這為本領域所已知。例如，所述CPSI編碼多核苷酸和多肽用于制備檢測生物學樣品中本發(fā)明的蛋白質(zhì)和核酸存在的篩選分析和分析試劑盒。另外，技術人員熟知分離的和純化的多肽可用作家畜的飼料添加劑，編碼所述多肽的多核苷酸因此用于生產(chǎn)所述多肽。在一些實施方案中，本發(fā)明提供的CPSI多核苷酸和多肽分離自脊椎動物和非脊椎動物。因此，本發(fā)明提供了CPSI的同系物，包括但不限于哺乳動物、酵母和細菌同系物。CPSI的哺乳動物同系物成員包括例如但不限于大鼠和人同系物。術語“CPSI基因產(chǎn)物”、“CPSI蛋白質(zhì)”和“CPSI多肽”是指具有與CPSI天然氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并且具有介導尿素循環(huán)中氨甲酰磷酸鹽合成或者與針對CPSI多肽的抗CPSI抗體交叉反應的生物學活性。術語“CPSI基因產(chǎn)物”、“CPSI蛋白質(zhì)”和“CPSI多肽”還包括與天然CPSI基因產(chǎn)物具有至少一些共有生物學活性的CPSI分子的類似物。另外，誘變領域的技術人員意識到至今未揭示或未發(fā)現(xiàn)的其它類似物也可用于構建CPSI類似物?！癈PSI基因產(chǎn)物”、“CPSI蛋白質(zhì)”或“CPSI多肽”非必需包含天然CPSI基因產(chǎn)物的所有或者基本上所有氨基酸序列。本發(fā)明可使用較短或較長的序列。因此，術語“CPSI基因產(chǎn)物”還包括融合或重組CPSI多肽和蛋白質(zhì)。本發(fā)明還揭示了制備這種蛋白質(zhì)的方法。術語“CPSI編碼多核苷酸”、“CPSI基因”和“CPSI基因序列”和“CPSI基因節(jié)段”是指與編碼上述CPSI基因產(chǎn)物、CPSI蛋白質(zhì)或CPSI多肽的多核苷酸序列基本上相同的任何DNA序列。該術語也是指與這種DNA序列相容的RNA或者反義序列。“CPSI編碼多核苷酸”、“CPSI基因”、“CPSI基因序列”和“CPSI基因節(jié)段”也包含相關控制序列的任意組合。術語“基本上相同”當用于限定CPSI基因產(chǎn)物或者CPSI氨基酸序列或者CPSI基因或者CPSI核酸序列時，是指由于一或多個缺失、取代或者添加而與天然CPSI序列不同但仍保留至少一些CPSI生物學活性的特殊序列，例如突變序列。或者，如果符合下列條件，則DNA類似物序列與本發(fā)明揭示的特異DNA序列是“基本上相同”的(a)所述DNA類似物序列衍生自天然CPSI基因的編碼區(qū)；或者(b)所述DNA類似物序列能與(a)的DNA序列在中等嚴格條件下雜交，并且編碼生物學活性的CPSI基因產(chǎn)物；或者(c)所述DNA序列是(a)和/或(b)所述DNA類似物序列遺傳密碼簡并的結果?；旧舷嗤念愃莆锏鞍踪|(zhì)與天然蛋白質(zhì)的相應序列大約60％以上相同。相似性程度較低但是生物學活性相當?shù)男蛄姓J為是等價物。在確定核酸序列中，能編碼基本上相似的氨基酸序列的所有對象核酸序列被認為是與參考核酸序列基本上相似的，不論密碼子序列中的差異如何。C.1相似性百分比相似性百分比可例如通過使用得自UniversityofWisconsinGeneticistComputerGroup的GAP計算機程序對比序列信息而確定。所述GAP程序利用經(jīng)Smithetal.，Adv.Appl.Math.2482(1981)修改的Needlemanetal.，J.Mol.Biol.48443(1970)的排列對比方法。簡而言之，GAP程序定義相似性為相似的排列符號(即核苷酸或者氨基酸)的數(shù)目除以兩個序列中較短序列的符號總數(shù)。GAP程序的代表性默認參數(shù)包括(1)核苷酸的一元(unitary)對比矩陣(包括相同時值為1，不同時值為0)和Gribskovetal.，Nucl.Acids.Res.146745(1986)的加權對比矩陣，如Schwartzetal.，eds.，AtlasofProteinSequenceandStructure，NationalBiomedicalResearchFoundation，pp.357-358(1979)所述；(2)對每個缺口罰值為3.0及對每個符號和每個缺口另外罰值0.01；及(3)對末端缺口沒有罰值。其它對比技術在實施例中描述。術語“同源性”描述了用于鑒別具有相似功能或者基序的基因或者蛋白質(zhì)的基于數(shù)學的序列相似性對比。因此，術語“同源性”與上述術語“相似性”和“相似性百分比”同義。因此，短語“基本上同源”或者“基本上相似”具有相似含義。C.2.核酸序列在某些實施方案中，本發(fā)明涉及CPSI基因和基因產(chǎn)物的應用，所述CPSI基因和基因產(chǎn)物在其各自序列內(nèi)包含基本上是CPSI基因序列的或相應蛋白質(zhì)的序列。術語“基本CPSI基因序列”是指基本上相應于CPSI多肽或者CPSI編碼多核苷酸的一部分并且具有相對較少的與CPSI蛋白或者CPSI基因(或者蛋白質(zhì)的生物學功能等價物)不同的堿基或者氨基酸(DNA或者蛋白質(zhì))的序列。術語“生物學功能等價物”為本領域所熟知，在此進一步描述。因此，與CPSI蛋白質(zhì)的氨基酸或者CPSI基因在一些實施方案中大約70％-80％、在一些實施方案中大約81％-90％、及在一些實施方案中大約91％-99％相同或者功能等價的序列是“基本上相同”的序列。本發(fā)明還包括CPSI基因產(chǎn)物和具有功能等價密碼子的CPSI基因。本文所用術語“功能等價密碼子”是指編碼相同氨基酸的密碼子，如精氨酸或絲氨酸的6個密碼子，也是指編碼生物學等價氨基酸的密碼子(見表1)。表1遺傳密碼子表氨基酸密碼子丙氨酸AlaAGCA；GCC；GCG；GCU半胱氨酸CysCUGC；UGU天冬氨酸AspDGAC；GAU谷氨酸GluEGAA；GAG苯丙氨酸PheFUUC；UUU甘氨酸GlyGGGA；GGC；GGG；GGU組氨酸HisHCAC；CAU異亮氨酸IleIAUA；AUC；AUU賴氨酸LysKAAA；AAG亮氨酸LeuLUUA；UUG；CUA；CUC；CUG；CUU甲硫氨酸MetMAUG天冬酰胺AsnNAAC；AAU脯氨酸ProPCCA；CCC；CCG；CCU谷氨酰胺GlnQCAA；CAG精氨酸ArgRAGA；AGG；CGA；CGC；CGG；CGU絲氨酸SerSACG；AGU；UCA；UCC；UCG；UCU蘇氨酸ThrTACA；ACC；ACG；ACU纈氨酸ValVGUA；GUC；GUG；GUU色氨酸TrpWUGG酪氨酸TyrYUAC；UAU也應理解氨基酸和核酸序列可包括額外的殘基，如額外的N-或C-末端氨基酸或者5’或3’序列，基本如本文揭示的序列之一所示，只要所述序列符合上述標準，包括在蛋白質(zhì)表達時保持蛋白質(zhì)生物學活性。添加末端序列特別用于核酸序列，例如可包括編碼區(qū)5’或3’部分兩側的不同非編碼序列或者可包括不同內(nèi)在序列，即已知在基因內(nèi)發(fā)生的內(nèi)含子。本發(fā)明還涵蓋了與說明書中所示序列互補或者基本上互補的DNA節(jié)段的應用?！盎パa”的核酸序列是根據(jù)標準Watson-Crick互補規(guī)則堿基配對的那些序列。如本文所用，術語“互補序列”是指基本上互補的核酸序列，可以通過上述相同核苷酸對比確定，或者定義為在本文所述相對嚴格的條件下能與質(zhì)詢核酸節(jié)段雜交。所述互補核酸節(jié)段的特別例子是反義寡核苷酸。核酸雜交除了受堿基成分、互補鏈長度及雜交核酸之間核苷酸堿基錯配數(shù)的影響之外，還受到如鹽濃度、溫度或者有機溶劑這樣條件的影響，這些易于為本領域技術人員所意識到。嚴格溫度條件通常包括超過30℃，典型超過37℃，在一些實施方案中超過45℃的溫度。嚴格鹽濃度通常低于1000mM，典型低于500mM，在一些實施方案中低于200mM。然而，參數(shù)的組合比任何單一參數(shù)的測定更重要(見例如Wetmur&Davidson，J.Mol.Biol.31349-370(1968))。探針序列也可以與雙鏈DNA在一定條件下特異性雜交，形成三鏈體或者更高等級的DNA復合物。本領域熟知這種探針的制備及合適的雜交條件。如本文所用，術語“DNA節(jié)段”是指已經(jīng)分離的沒有特殊物種全部基因組DNA的DNA分子。另外，編碼CPSI多肽的DNA節(jié)段是指含有CPSI編碼序列的DNA節(jié)段，分離自或者純化自源物種如人(Homosapiens)的全部基因組DNA。術語“DNA節(jié)段”包括DNA節(jié)段及這種節(jié)段的較小片段，及重組載體，包括例如質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒等等。相似地，包含分離的或純化的CPSI基因的DNA節(jié)段是指包括基本上分離自其它天然存在的基因或者蛋白質(zhì)編碼序列的CPSI編碼序列的DNA節(jié)段。在這方面，術語“基因”用于簡單地描述功能蛋白質(zhì)、多肽或者肽編碼單位。如本領域技術人員所已知，這個功能術語包括基因組序列和cDNA序列。“基本上分離自其它編碼序列”是指在這種情況中，感興趣的基因，CPSI基因形成DNA節(jié)段編碼區(qū)的主要部分，該DNA節(jié)段不含有大部分天然存在的編碼DNA，如大的染色體片段及其它功能基因或者cDNA編碼區(qū)。當然，這個術語是指最初分離的DNA節(jié)段，并不排除后來通過人工加入所述節(jié)段的基因或者編碼區(qū)。在特殊的實施方案中，本發(fā)明涉及分離的DNA節(jié)段和摻入編碼CPSI多肽的DNA序列的重組載體，所述CPSI多肽在其氨基酸序列中包括SEQIDNO2、4、12和14任一所示氨基酸序列。在其它特殊的實施方案中，本發(fā)明涉及分離的DNA節(jié)段和摻入編碼一種蛋白質(zhì)的DNA序列的重組載體，所述蛋白質(zhì)在其氨基酸序列中包括相應于人體組織的CPSI多肽的氨基酸序列。也應理解本發(fā)明不限于SEQIDNO1-4和11-14所示特定的核酸和氨基酸序列。重組載體和分離的DNA節(jié)段因此可不同地包括CPSI多肽編碼區(qū)自身，包括在基本編碼區(qū)中具有選擇的改變或者修飾的編碼區(qū)，或者包括編碼的較大的多肽，其仍然包括CPSI多肽編碼區(qū)或者可編碼具有改變的氨基酸序列的生物學功能等價蛋白質(zhì)或者肽。在某些實施方案中，本發(fā)明涉及分離的DNA節(jié)段和編碼在其氨基酸序列中包括基本如SEQIDNO2、4、12和14任一所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)或肽的重組載體。天然地，在所述DNA節(jié)段或載體編碼全長CPSI基因產(chǎn)物時，核酸序列的例子是基本如SEQIDNO1、3、11和13任一所示的序列，并且編碼在尿素循環(huán)中具有活性的蛋白質(zhì)，所述活性例如可通過比色分析檢測從氨產(chǎn)生的羰基磷酸鹽而確定，如實施例3所述。術語“基本如SEQIDNO2、4、12和14任一所示的序列”是指基本上相應于SEQIDNO2、4、12和14任一氨基酸序列一部分的序列，并且具有相對極少的與SEQIDNO2、4、12和14任一氨基酸序列的氨基酸不同的氨基酸或者具有是SEQIDNO2、4、12和14任一氨基酸序列的氨基酸的生物學功能等價物的氨基酸。術語“生物學功能等價物”為本領域所熟知并在本文進一步闡述。因此，在一些實施方案中與SEQIDNO2、4、12和14任一個的氨基酸具有大約70-80％、在一些實施方案中大約81％-90％、及在一些實施方案中大約91％-99％相同或者功能等價的序列是“基本如SEQIDNO2、4、12和14所示的序列”。在特殊的實施方案中，本發(fā)明涉及基因治療方法，該方法使用分離的DNA節(jié)段和摻入編碼一種蛋白質(zhì)的DNA序列的重組載體，所述蛋白質(zhì)在其氨基酸序列中包括SEQIDNO2、4、12和14所示任一氨基酸序列，SEQIDNO2、4、12和14包括衍生自人體組織的序列。在其它特殊的實施方案中，本發(fā)明涉及分離的DNA序列和摻入編碼一種蛋白質(zhì)的DNA序列的重組DNA載體，所述蛋白質(zhì)在其氨基酸序列中包括人肝臟組織的CPSI蛋白質(zhì)的氨基酸序列。在某些其它的實施方案中，本發(fā)明涉及分離的DNA節(jié)段和重組載體，在其序列中包括基本如SEQIDNO1、3、11和13任一所示的核酸序列。術語“基本如SEQIDNO1、3、11和13任一所示的序列”以如上述相同含義應用，是指所述核酸序列分別基本上相應于SEQIDNO1、3、11和13任一所示的一部分，并且具有相對極少的分別與SEQIDNO1、3、11和13任一的密碼子不相同的密碼子或者具有是SEQIDNO1、3、11和13任一的密碼子的功能等價物的密碼子。再者，可以應用編碼在尿素循環(huán)中具有活性、與抗CPSI抗體交叉反應或者具有CPSI基因產(chǎn)物其它生物學活性的基因產(chǎn)物的DNA節(jié)段。本文所用術語“功能等價密碼子”是指編碼相同氨基酸的密碼子，如精氨酸或者絲氨酸的6個密碼子，也是指編碼生物學等價氨基酸的密碼子(見表1)。本發(fā)明的核酸節(jié)段無論其自身編碼序列的長度如何，均可以與其它DNA序列組合，如與啟動子、增強子、多腺苷酸化信號、額外的限制酶位點、多克隆位點、其它編碼節(jié)段等組合，由此其全長可明顯變化。因此推測幾乎可以應用任何長度的核酸片段，在一些實施方案中總長度限制于制備方法和在指定重組DNA方案的應用。例如，可以制備這樣的核酸片段，其包括分別與SEQIDNO1、3、11和13所示核酸序列互補的一段短序列，如長度為大約10個核苷酸，直至10000或者5000個堿基對，在某些情況中優(yōu)選3000個堿基對的節(jié)段。也可以使用總長度為大約1000、500、200、100和大約50個堿基對的DNA節(jié)段。本發(fā)明的DNA節(jié)段涵蓋了生物學功能等價CPSI蛋白質(zhì)和肽。這種序列可以是已知在核酸序列及編碼的蛋白質(zhì)中天然發(fā)生的密碼子冗余和功能等價的結果而產(chǎn)生的?；蛘撸δ艿葍r蛋白質(zhì)或肽可以通過應用重組DNA技術產(chǎn)生，其中蛋白質(zhì)結構的改變可以基于置換的氨基酸的性質(zhì)而工程化，例如在第4和第5位氨基酸Ile和Leu的取代是SEQIDNO11-14。人工設計的改變可以是通過應用定向誘變技術實現(xiàn)的，例如對蛋白質(zhì)的抗原性或者測試CPSI突變體以檢測在尿素循環(huán)中的活性或者分子水平的其它活性進行改良。如果需要，也可以制備融合蛋白和肽，例如其中CPSI編碼區(qū)與具有所需功能的其它蛋白質(zhì)或肽在同一表達單位內(nèi)排列，如為了進行純化或者免疫檢測(例如蛋白質(zhì)分別可以通過親和層析和酶標記編碼區(qū)而純化)。本發(fā)明另外的重要方面是重組載體。特別有用的載體是其中DNA節(jié)段的編碼部分位于啟動子的控制下的那些載體。啟動子可以是與CPSI基因天然相關的形式，例如在哺乳動物組織中，可以通過分離位于編碼節(jié)段或者外顯子上游的5’非編碼序列而獲得，例如使用重組克隆和/或PCR技術，結合本發(fā)明揭示的組合物。在其它實施方案中，預期通過將編碼DNA節(jié)段定位于重組或者異源啟動子控制下而獲得一定的優(yōu)勢。如本文所用，重組或者異源啟動子是指與CPSI基因在其天然環(huán)境中非正常相關的啟動子。這種啟動子可包括分離自細菌、病毒、真核細胞或者哺乳動物細胞的啟動子。自然，應用有效指導DNA節(jié)段在選擇的細胞類型中表達的啟動子是重要的。用于蛋白質(zhì)表達的啟動子及細胞類型組合為分子生物學領域技術人員所熟知，見例如Sambrooketal.，1989所述，所述內(nèi)容在此并入?yún)⒖?。應用的啟動子可以是組成型或者可誘導型啟動子，并且可以在適當條件下使用以指導導入的DNA節(jié)段的高水平表達，這在大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)或肽中是有益的。用于高水平表達的合適啟動子系統(tǒng)包括但不限于痘苗病毒啟動子和桿狀病毒啟動子。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了一種表達載體，其包含編碼CPSI多肽的多核苷酸，所述多肽在尿素循環(huán)中具有活性、與抗CPSI抗體交叉反應或者具有本發(fā)明的其它生物學活性。在一些實施方案中，本發(fā)明的表達載體包含編碼人CPSI基因產(chǎn)物的多核苷酸。在一些實施方案中，本發(fā)明的表達載體包含編碼一種多肽的多核苷酸，所述多肽包含SEQIDNO2、4、12和14任一所示氨基酸殘基序列。在一些實施方案中，本發(fā)明的表達載體包含一種多核苷酸，其包含SEQIDNO1、3、11和13任一所示核苷酸堿基序列。在一些實施方案中，本發(fā)明的表達載體包含與增強子-啟動子可操縱地連接的多核苷酸。在一些實施方案中，本發(fā)明的表達載體包含與原核細胞啟動子可操縱地連接的多核苷酸?；蛘撸景l(fā)明的表達載體包含與增強子-啟動子(真核細胞啟動子)可操縱地連接的多核苷酸，所述表達載體進一步包含一個多腺苷酸化信號，其位于3’羧基末端氨基酸及編碼的多肽的轉錄單位中。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了一種用編碼CPSI多肽的多核苷酸轉染的重組宿主細胞，所述CPSI多肽在調(diào)節(jié)尿素循環(huán)中具有活性、與抗CPSI抗體交叉反應或者具有本發(fā)明的其它生物學活性。SEQIDNO1-4和11-14示出來自示例的脊椎動物，人的核苷酸和氨基酸序列。本發(fā)明還提供了在其它脊椎動物包括大鼠中發(fā)現(xiàn)的同源或者生物學等價多核苷酸和CPSI多肽。本發(fā)明還提供了在無脊椎動物包括細菌和酵母中發(fā)現(xiàn)的同源或者生物學等價的多核苷酸和CPSI多肽。在一些實施方案中，本發(fā)明的重組宿主細胞用編碼人CPSI多肽的多核苷酸轉染。在一些實施方案中，本發(fā)明的重組宿主細胞用SEQIDNO1、3、11和13任一所示多核苷酸序列轉染。在一些實施方案中，本發(fā)明的宿主細胞是一種真核宿主細胞。在一些實施方案中，本發(fā)明的重組宿主細胞是脊椎動物細胞。在一些實施方案中，本發(fā)明的重組宿主細胞是哺乳動物細胞。另一方面，本發(fā)明的重組宿主細胞是原核宿主細胞。在一些實施方案中，本發(fā)明的重組宿主細胞是細菌細胞，在一些實施方案中是大腸桿菌菌株。在一些實施方案中，重組宿主細胞包含在重組宿主細胞中起作用的調(diào)節(jié)信號的轉錄控制下的多核苷酸，其中所述調(diào)節(jié)信號適當?shù)乜刂艭PSI多肽以可以進行所有必需的轉錄和轉錄后修飾的方式表達。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了一種制備CPSI多肽的方法，包括將細胞用編碼CPSI多肽的多核苷酸轉染以產(chǎn)生轉化的宿主細胞，所述CPSI多肽在尿素循環(huán)中具有活性、與抗CPSI抗體交叉反應或者具有本發(fā)明的其它生物學活性；將轉化的宿主細胞在足以使得多肽表達的條件下維持。在一些實施方案中，所述轉化的宿主細胞是真核細胞。在一些實施方案中，所述真核細胞是脊椎動物細胞。或者，所述宿主細胞是原核細胞。在一些實施方案中，所述原核細胞是大腸桿菌細菌細胞。在一些實施方案中，轉染進轉化的細胞中的多核苷酸包含SEQIDNO1、3、11和13任一所示核苷酸堿基序列。SEQIDNO1-4和11-14描述了示例的脊椎動物，人的核苷酸和氨基酸序列。本發(fā)明還提供了在其它脊椎動物、特別是溫血脊椎動物、更特別是在大鼠中發(fā)現(xiàn)的同源或生物學等價CPSI多核苷酸和多肽。本發(fā)明還提供了在無脊椎動物包括細菌和酵母中發(fā)現(xiàn)的同源或者生物學等價多核苷酸和CPSI多肽。如上所述，結合制備重組CPSI蛋白質(zhì)和肽的表達實施方案，通常使用較長的DNA節(jié)段，在一些實施方案中使用編碼完整CPSI蛋白質(zhì)或其功能結構域或裂解產(chǎn)物的DNA節(jié)段。然而，應意識到使用較短的DNA節(jié)段以指導CPSI肽或表位核心區(qū)域(epitopecoreregions)表達也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，如可用于產(chǎn)生抗CPSI抗體。預期特別有用的DNA節(jié)段是在一些實施方案中編碼長度為大約15-50個氨基酸、在一些實施方案中編碼長度為大約15-30個氨基酸的肽抗原的節(jié)段。編碼肽的DNA節(jié)段通常具有長度為大約45-150、或者大約45-90個核苷酸的最小編碼長度。編碼全長蛋白質(zhì)的DNA節(jié)段對于SEQIDNO2、4、12和14任一所示蛋白質(zhì)可具有大約4500-4600個核苷酸的最小編碼長度。自然，本發(fā)明還涵蓋了與SEQIDNO1、3、11和13任一所示序列互補或者基本上互補的DNA節(jié)段。術語“互補”和“基本上互補”的含義如上述。除了內(nèi)含子或者側翼區(qū)域之外(其詳細描述在圖9中示出)，在遺傳密碼簡并后，一些實施方案中，與SEQIDNO1、3、11和13任一序列的核苷酸大約70％-80％、在一些實施方案中大約81％-90％及在一些實施方案中大約91％-99％相同或者功能等價(即編碼相同的氨基酸)的序列是“基本如SEQIDNO1、3、11和13任一所示的序列”。與SEQIDNO1、3、11和13任一所示序列基本上相同的序列也可以功能性定義為是在相對嚴格條件下能與含有SEQIDNO1、3、11和13任一序列的互補體的核酸節(jié)段雜交的序列。本文描述了合適的相對嚴格雜交條件，這些為本領域技術人員所熟知。C.2.生物學功能等價物如上所述，可以在本文描述的CPSI蛋白質(zhì)和肽的結構中進行修飾和改變，并且仍獲得具有相同或者另外所需特性的分子。例如，蛋白質(zhì)結構中的某些氨基酸可以取代為其它氨基酸而不明顯喪失例如細胞核中結構的相互活性(interactive)能力。既然蛋白質(zhì)的相互活性能力和性質(zhì)限定了蛋白質(zhì)的生物學功能活性，因此在蛋白質(zhì)序列(或者其基本的DNA編碼序列)中可以進行某些氨基酸序列取代，仍能獲得具有相同或者甚至相反性質(zhì)的蛋白質(zhì)(例如拮抗劑，激動劑)。因此期待在CPSI蛋白質(zhì)和肽(或者基本DNA)的序列中可以進行多種變化而不明顯喪失其生物學用途或活性。本領域技術人員也熟知在闡述生物學功能等價蛋白質(zhì)或肽中根本的是這樣的觀點，即限制在分子的指定部分中可以進行改變的數(shù)目及仍可獲得具有可接受水平的等價生物學活性的分子。因此在本文生物學功能等價肽是其中一些(非大多數(shù)或全部)氨基酸可以被取代的那些肽。當然，根據(jù)本發(fā)明可以容易地進行并使用具有不同取代的許多獨特的蛋白質(zhì)/肽。技術人員也熟知某些殘基示出對于蛋白質(zhì)或肽的生物學或者結構性質(zhì)特別重要，例如活性位點中的殘基，這種殘基通常不可被置換。在本發(fā)明中即是如此，其中如果在例如CPSI多肽的磷酸化結構域中的任何改變均可導致所得肽喪失其在本發(fā)明中某一方面的用途。氨基酸取代，例如可用于修飾本文所述CPSI蛋白質(zhì)和肽的那些氨基酸取代，通?；诎被醾孺溔〈南鄬ο嗨菩?，例如其疏水性、親水性、電荷、大小等等。對氨基酸側鏈取代基的大小、形狀和類型的分析表明精氨酸、賴氨酸和組氨酸是正電荷的殘基；丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸的大小相似；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有相似的形狀。因此基于這些因素，精氨酸、賴氨酸和組氨酸；丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸是生物學功能等價物。在產(chǎn)生這種改變中，可以考慮氨基酸的親水指數(shù)。對每個氨基酸基于其疏水性和電荷特性確定親水指數(shù)異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；精氨酸(-4.5)。本領域已知親水氨基酸指數(shù)在授予蛋白質(zhì)相互作用生物學功能方面的重要性(Kyte&Doolittle，J.Mol.Biol.157105-132(1982)，并入本文作參考)。已知某些氨基酸可以由具有相似親水指數(shù)或分值的其它氨基酸取代，并仍保留相似的生物學活性。其親水指數(shù)在一些實施方案中為原始值的±2內(nèi)、在一些實施方案中為原始值的±1內(nèi)及在一些實施方案中為原始值的±0.5內(nèi)的氨基酸取代可用于基于親水指數(shù)產(chǎn)生改變。本領域也已知可以基于親水性有效地產(chǎn)生同樣的氨基酸取代。并入本文作參考的美國專利No.4,554,101闡述了蛋白質(zhì)的最大局部平均親水性，由其相鄰氨基酸的親水性決定，與其免疫原性和抗原性即蛋白質(zhì)的生物學性質(zhì)相關。已知氨基酸可以由具有相似親水性數(shù)值的另一個氨基酸取代，并且仍獲得生物學等價蛋白質(zhì)。如美國專利No.4,554,101所述，對如下氨基酸殘基確定了親水性數(shù)值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。其親水性數(shù)值在一些實施方案中為原始值的±2內(nèi)、在一些實施方案中為原始值的±1內(nèi)及在一些實施方案中為原始值的±0.5內(nèi)的氨基酸取代可用于基于相似的親水性數(shù)值產(chǎn)生改變。討論集中在從氨基酸改變中產(chǎn)生功能等價多肽，應意識到這些改變可以通過改變編碼DNA而實現(xiàn)，也要考慮的是遺傳密碼簡并及兩或多個密碼子可以編碼同一氨基酸。C.3.序列修飾技術對本發(fā)明所述CPSI蛋白質(zhì)和肽的修飾可以使用如定點誘變技術進行。位點特異性誘變是通過對基本DNA的特異性誘變來制備各個肽或者生物學功能等價的蛋白質(zhì)或肽。該技術進一步提供了(例如根據(jù)前述的一或多個考慮)通過在DNA中導入一或多個核苷酸序列改變而易于制備和測試序列變體的能力。位點特異性誘變可以產(chǎn)生突變體，通過使用編碼所需突變的DNA序列的特異性寡核苷酸序列及足夠數(shù)目的相鄰核苷酸，提供足夠大小的引物序列和序列復雜性以在橫跨缺失接合處的兩側形成穩(wěn)定的雙鏈體。典型地，在一些實施方案中可以應用長度為大約17-30個核苷酸的引物，在被改變的序列的接合處的兩側有大約5-10個殘基。通常，通過一些出版物的例證，本領域熟知位點特異性誘變技術(例如Adelmanetal.，1983)。正如所意識到的，該技術典型應用以單鏈和雙鏈兩種形式存在的噬菌體載體。定點誘變中使用的典型載體包括如M13噬菌體載體(Messingetal.，1981)。這些噬菌體可易于商購，其應用為本領域技術人員所熟知。雙鏈質(zhì)粒也通常用于定點誘變中，消除了將感興趣的基因從質(zhì)粒移至噬菌體的步驟。通常，定點誘變是通過首先獲得單鏈載體或者使雙鏈載體的兩個鏈解鏈而進行，所述雙鏈載體在其序列中包括編碼例如人CPSI多肽的DNA序列。制備具有所需突變序列的寡核苷酸引物，通常例如通過Crea等(1978)的方法合成。然后將這個引物與單鏈載體退火，進行DNA聚合酶處理如大腸桿菌聚合酶IKlenow片段，以完成具有突變的鏈的合成。因此，形成異源雙鏈體，其中一個鏈編碼原始未突變的序列，另一個鏈具有所需的突變。然后將這種異源雙鏈體載體用于轉化合適的細胞，如大腸桿菌細胞，選擇包括具有突變序列排列的重組載體的克隆。本發(fā)明還提供了使用定點誘變制備選擇的基因的序列變體，作為生產(chǎn)在尿素循環(huán)中具有活性的潛在有用的CPSI多肽或者其它物種的手段，但不限于這種方法，還有可獲得這些肽的序列變體的其它方式。例如，編碼所需基因的重組載體可以用誘變劑處理以獲得序列變體(見例如Eichenlaub，1979所述方法)，使用羥胺誘變質(zhì)粒DNA。C.4.其它結構等價物除了本文描述的CPSI肽基化合物之外，本發(fā)明還涉及可以配制其它空間排列相似化合物以模擬肽結構的關鍵部分。這種化合物可以與本發(fā)明的肽以相同的方式使用，并因此也是功能等價物。結構功能等價物的產(chǎn)生可以通過本領域技術人員已知的建模和化學設計技術實現(xiàn)。應理解所有這種空間排列相似的構建體均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。D.基因產(chǎn)物的導入在應用基因自身導入基因產(chǎn)物時，常規(guī)的導入方法是通過使用重組載體摻入所需基因及相關的控制序列。重組載體的制備為本領域技術人員所熟知，在許多參考文獻中有描述，例如Sambrook等(1989)所述，在此特別并入作參考。在載體中，應理解被表達的DNA編碼序列(在這種情況中是編碼CPSI基因產(chǎn)物的那些DNA序列)位于啟動子鄰近并在其控制下。本領域理解為了使得編碼序列在這種啟動子的控制下，通常將被表達的基因產(chǎn)物的轉錄讀框的轉錄起始位點的5’末端位于所選擇啟動子下游(即3’末端)的大約1-50個核苷酸之間。也可以在載體的轉錄單位中摻入一個合適的多腺苷酸化位點(例如5′-AATAAA-3′)，如果其未包含在原始插入的DNA中。典型地，這些polyA添加位點被置于編碼序列下游大約30-2000個核苷酸之間，在轉錄終止之前的位置。可以使用特異基因的控制序列(即CPSI基因的CPSI啟動子)，只要其它控制序列與處理的細胞基因型相容即可應用所述其它控制序列。因此，可以提及的其它啟動子例如包括SV40早期啟動子、逆轉錄病毒的長末端重復啟動子、肌動蛋白啟動子、熱激啟動子、金屬硫蛋白啟動子等等。如本領域所已知，啟動子是在轉錄開始處(即轉錄起始位點)之前(上游)典型地大約100個核苷酸對內(nèi)的DNA分子的一個區(qū)域。該區(qū)域典型含有位于不同基因中相似位置的一些類型的DNA序列元件。如本文所用，術語“啟動子”包括在本領域中稱為上游啟動子區(qū)域，啟動子區(qū)域或者一般化的真核細胞RNA聚合酶II轉錄單位的啟動子。另一類型的分立的轉錄調(diào)節(jié)序列元件是增強子。增強子提供特定編碼區(qū)(例如基因)的時間、位置和表達水平的特異性。增強子的主要功能是在含有與增強子結合的一或多個轉錄因子的細胞中提高編碼序列的轉錄水平。與啟動子不同，只要啟動子存在，增強子位于與轉錄起始位點不同距離時均可發(fā)揮作用。如本文所用，短語“增強子-啟動子”是指既含有增強子又含有啟動子元件的一個復合單位。增強子-啟動子與編碼至少一種基因產(chǎn)物的編碼序列可操縱地連接。如本文所用，短語“可操縱地連接”是指增強子-啟動子與編碼序列以該編碼序列的轉錄在增強子-啟動子的控制和調(diào)節(jié)下的方式連接。本領域熟知將增強子-啟動子與編碼序列可操縱地連接的手段。如本領域所熟知，相對于轉錄被控制的編碼序列的精確方向和位置依賴于增強子-啟動子的特異性性質(zhì)。因此，TATA框最小啟動子典型地位于轉錄起始位點上游大約25-30堿基對，上游啟動子元件典型地位于轉錄起始位點上游大約100-200堿基對。相反，增強子可位于起始位點下游，與該位點的距離可以相當?shù)拇?。本發(fā)明載體構建體中使用的增強子-啟動子可以是驅動在被轉染的細胞中表達的任何增強子-啟動子。通過應用具有熟知性質(zhì)的增強子-啟動子，基因產(chǎn)物表達的水平和模式可以最佳化。對于導入例如人CPSI基因(包括其等位基因變體)，提議應用將所需基因輸送至受影響的細胞的載體構建體。當然，這通常需要將該構建體輸送至靶細胞，例如哺乳動物肝細胞。提議在一些實施方案中這個目的可以通過使用攜帶CPSI序列的病毒載體有效感染細胞而導入所需的基因。這些載體在一些實施方案中可以是腺病毒、逆轉錄病毒、痘苗病毒載體，或者腺伴隨病毒。優(yōu)選這些載體，因為已經(jīng)將其成功用于將所需序列輸送至細胞并且趨于具有高感染效力。調(diào)試合適的載體-CPSI基因構建體，以作為藥物組合物施用，如下文所述。通常使用的表達載體的病毒啟動子衍生自多形瘤、巨細胞病毒、腺病毒2和猿猴病毒40(SV40)。SV40病毒的早期和晚期啟動子特別有益，因為其均易于作為也含有SV40病毒復制起點的片段而得自該病毒。也可以使用較小或者較大的SV40片段，只要包括位于病毒復制起點的從HindIII位點至BglI位點的大約250bp序列即可。另外，也可以及通常希望利用與所需基因序列正常相關的啟動子或者控制序列，只要這種控制序列與宿主細胞系統(tǒng)相容即可。復制起點可以通過構建包括外源起點的載體而提供，所述外源起點如可以衍生自SV40或者其它病毒(例如多形瘤、Adeno、VSV、BPV)，或者可以通過宿主細胞染色體復制機制提供。如果載體整合進宿主細胞染色體中，則后者通常是足夠的。在應用CPSI基因自身時，最便利的是直接簡單應用野生型CPSI基因。所述CPSI基因可因此包含蘇氨酸編碼等位基因，由此編碼的多肽的第1405位氨基酸包含蘇氨酸?；蛘?，所述CPSI基因包含精氨酸編碼等位基因，由此編碼的多肽的第1405位氨基酸包含精氨酸。另外，設想可以專門應用CPSI基因的某些區(qū)域，而不應用完整的野生型CPSI基因或其完整的等位基因變體。在一些實施方案中，應用調(diào)節(jié)尿素循環(huán)需要的最小區(qū)域，以便不將非必需DNA導入接收CPSI基因構建體的細胞中。本領域技術人員熟知的技術如限制酶的使用，可以產(chǎn)生示例的CPSI基因的小區(qū)域。這些區(qū)域調(diào)節(jié)尿素循環(huán)的能力可易于通過實施例中報道的分析而確定。通常，本領域已知評估調(diào)節(jié)尿素循環(huán)的技術。D.1.轉基因動物本發(fā)明還提供了制備轉基因非人動物，所述動物表達本發(fā)明的CPSI基因或者其中CPSI基因的表達被“敲除”。本發(fā)明提供的轉基因非人動物表達CPSI的T1405形式或者CPSI的N1405形式。轉基因動物的例子是小鼠。制備轉基因動物的技術為本領域所已知。例如美國專利No.5,489,742(轉基因大鼠)；美國專利No.4,736,866、5,550,316、5,614,396、5,625,125和5,648,061(轉基因小鼠)；美國專利No.5,573,933(轉基因豬)；美國專利No.5,162,215(轉基因鳥類)和美國專利No.5,741,957(轉基因牛類)，所述專利均并入本文作參考。關于制備轉基因小鼠的示例方法，是將克隆的重組或合成的編碼CPSI基因產(chǎn)物的DNA序列或者DNA節(jié)段注入小鼠受精卵中。將經(jīng)注射的受精卵植入假孕雌性小鼠中，使之生長一段時間以提供其細胞表達CPSI基因產(chǎn)物的轉基因小鼠。在一些實施方案中，注入的序列構建為具有連接的啟動子序列，以在轉基因小鼠的肝細胞中表達所需的蛋白質(zhì)。D.2.基因治療根據(jù)本發(fā)明，CPSI基因可用于基因治療?；蛑委煹姆椒ǖ睦影ê怂峤?jīng)脂質(zhì)體轉染進宿主細胞，在美國專利No.5,279,833；5,286,634；5,399,346；5,646,008；5,651,964；5,641,484和5,643,567中描述，所述專利均并入本文作參考。簡而言之，本發(fā)明描述了針對調(diào)節(jié)靶細胞中尿素循環(huán)的CPSI基因治療方法。靶細胞包括但不限于肝細胞和腸細胞。在一些實施方案中，本發(fā)明的治療方法提供了一種調(diào)節(jié)細胞中尿素循環(huán)的方法，包括如下步驟(a)給予細胞有效量的DNA分子，所述DNA分子包含編碼調(diào)節(jié)尿素循環(huán)的CPSI多肽的多核苷酸；及(b)在足以表達所述多肽的條件下維持細胞。在一些實施方案中通過將DNA分子注射進細胞中而實現(xiàn)輸送。細胞在對象中時，在一些實施方案中將DNA分子施用給對象的循環(huán)系統(tǒng)實現(xiàn)輸送。在一些實施方案中，施用包括如下步驟(a)提供含有所述DNA分子的載體；及(b)將所述載體施用給對象。在一些實施方案中，載體是用DNA分子轉化或轉染的細胞或者衍生自這種轉化或轉染細胞的轉染細胞。轉化或轉染的細胞例子是肝細胞。用本發(fā)明的DNA分子轉化或轉染細胞的手段如上所述?；蛘?，所述載體是與腫瘤抗原特異性感染或者免疫反應的病毒或者抗體。用于輸送構建體給宿主靶組織的逆轉錄病毒通常是其中3′-LTR(線性轉移區(qū))已經(jīng)失活的病毒。即這些是增強子較低3′-LTR，通常稱作SIN(自失活病毒(self-inactivatingvirus))，因為在感染進宿主細胞后，3′-LTR移至5’末端，病毒的兩個LTR的轉錄活性均失活。為本領域技術人員所熟知的這些病毒的應用是克隆基因，以將克隆基因的調(diào)節(jié)元件插入兩個LTR之間的間隔中。病毒感染系統(tǒng)的優(yōu)勢是可以非常高水平地感染進合適的受體細胞中。抗體已經(jīng)用于靶定和輸送DNA分子。N-末端修飾的聚L-賴氨酸(NPLL)抗體綴合物易于與質(zhì)粒DNA形成復合物。與NPLL綴合的細胞表面凝血調(diào)節(jié)蛋白的單克隆抗體復合物用于將外源質(zhì)粒DNA靶定表達抗原的小鼠肺內(nèi)皮細胞系和小鼠肺。這些靶定的內(nèi)皮細胞表達該外源DNA編碼的產(chǎn)物。也設想本發(fā)明的這個實施方案可以使用另外的病毒或噬菌體載體進行，包括其基因組已經(jīng)通過另外方式操縱以使得所述病毒是非病原性的逆轉錄病毒和痘苗病毒。產(chǎn)生這種病毒突變的方法在美國專利No.4,769,331中詳細描述，所述專利并入本文作參考。例如，將人CPSI編碼多核苷酸或者來另外的溫血脊椎動物的CPSI編碼多核苷酸同系物或者來自無脊椎動物(如細菌或酵母)的CPSI編碼多核苷酸同系物導入分離的肝細胞或者其它相關細胞中。將攜帶轉基因的細胞再次注射進肝臟或其它相關組織中提供了對于人和動物中高氨血癥或者其它相關疾病的易感性的治療。E.補充治療方法除了其在氮清除中的作用之外，尿素循環(huán)還是機體的精氨酸內(nèi)在來源，精氨酸是有效的血管擴張劑一氧化氮(NO)的前體。本發(fā)明提供了治療亞最佳尿素循環(huán)功能的方法，包括通過施用一氧化氮前體如瓜氨酸進行治療。典型地，亞最佳尿素循環(huán)功能與本發(fā)明揭示的多態(tài)性相關。亞最佳尿素循環(huán)功能可進一步包含高氨血癥或者降低的瓜氨酸和/或精氨酸產(chǎn)生。治療對象可患有與亞最佳尿素循環(huán)功能相關的疾病，例如但不限于與一氧化氮前體產(chǎn)生損傷相關的疾病。這種疾病包括但不限于肝和/或腸道組織損害或損傷的疾病。代表性疾病包括但不限于肝炎(包括甲型、乙型和丙型肝炎)、硬化、哮喘、肺動脈高壓(包括初級和二級)、經(jīng)歷骨髓移植對象中的骨髓移植物毒性及這些病變的組合。治療對象也可以暴露或者要暴露于與亞最佳尿素循環(huán)功能相關的環(huán)境刺激。這種環(huán)境刺激包括但不限于參與損害或者損傷肝和/或腸道組織的刺激。代表性的環(huán)境刺激包括但不限于化療或者其它藥物治療、心臟手術(在一些情況中表現(xiàn)為手術后肺部血管緊張度增加)、增加的氧化應激、骨髓移植、敗血癥、急性哮喘發(fā)作、缺氧、肝毒素暴露及這些刺激的組合。代表性心臟手術包括修復先天性心臟缺損，進一步包括用于校正先天性心臟缺損的心肺轉流術。代表性心臟缺損是與肺血流過量相關的心臟缺損，如房室隔缺損(AVSD)或者大的無限制性室間隔缺損(VSD)。持續(xù)的肺部過度循環(huán)可導致肺血管平滑肌肥大和高反應性。在手術前，這些患者通常具有充血性心力衰竭及體重增長緩慢。需要盡可能早地手術修復以降低這種術后并發(fā)癥。另外的心臟缺損校正方法是雙向Glenn和改良的Fontan方法。在這種方法中，具有單心室損傷的患者需要手術治療，手術的成功與否依賴于保持較低的術后肺血管緊張度。單心室損傷的階段性校正需要分離肺循環(huán)和體循環(huán)的一系列3個手術方法。此過程中的第一個手術通常在新生兒期進行，是對患有右心室發(fā)育不全的患者進行Blalock-Taussig分流或者對患有左心發(fā)育不全綜合征的患者進行NorwoodI方法。第二個手術是雙向Glenn分流，其中將上腔靜脈血流直接轉向至肺動脈。第三個也是最后的階段是修改的Fontan方法，其中將下腔靜脈血流轉向至肺動脈，從而完全分離肺循環(huán)和體循環(huán)。使用Glenn和Fontan方法，肺部血流完全被動并且依賴于靜脈系統(tǒng)(SVC和IVC壓力)與PA壓力之間足夠的壓力梯度。在術后即刻肺血管緊張度的任何增高均可導致肺血流減少及隨后心輸出量降低。在這些方法之后較長時期的肺血管緊張度增高可導致持續(xù)的胸膜滲出，延長胸膜或縱隔引流管的需要，延長通氣及延長ICU監(jiān)護時間。另外的心臟缺損校正方法是NorwoodI方法。經(jīng)歷了NorwoodI方法的左心發(fā)育不全綜合征(HLHS)嬰兒的術后照顧很大程度上依賴于肺循環(huán)和體循環(huán)血流的平衡。肺血管阻力的突然增加可導致明顯的低氧血癥和去飽和作用。在罕見的情況下，低肺血管阻力是有害的，因為血流分流于肺部，以至于使得體循環(huán)和冠狀血管循環(huán)受損。通過精確的手術技術和最佳的中央分流，這種并發(fā)癥比不足的肺血流的問題更少見。另外的心臟缺損校正方法是動脈轉接方法。大動脈的轉位(TGA)是一種復雜的心臟損傷，需要在新生兒期立即手術校正。確定TGA校正的動脈轉接方法的時間特別要考慮到肺血管緊張度的問題。通常，當圍產(chǎn)期肺血管緊張度部分降低時不進行手術，直至出生后5-7天。因為在手術校正之前右心室是體循環(huán)心室，因此通常良好耐受術后肺血管阻力增加，肺動脈壓力通常未測定。然而，如果術后肺血管緊張度增加，這可以部分解釋為什么一些具有滿意的解剖結構和短分流時間的嬰兒仍具有復雜的術后進程。本發(fā)明提供了一種治療或預防對象中與亞最佳尿素循環(huán)功能相關疾病的方法。所述方法包括給對象施用治療有效量的一氧化氮前體，從而實現(xiàn)治療或預防所述疾病。一氧化氮前體可包括但不限于瓜氨酸、精氨酸及其組合。在一些實施方案中，可以治療得自亞最佳尿素循環(huán)功能的亞最佳一氧化氮形成。本發(fā)明還揭示了一種治療或預防對象中選自如下疾病的方法肝炎、硬化、肺動脈高壓(初級和二級)、壞死性小腸結腸炎(NEC)、急性呼吸窘迫綜合征、人種特異性內(nèi)皮細胞功能失調(diào)、勃起功能障礙、哮喘及這些疾病的組合。在一些實施方案中，所述方法包括給需要治療的對象施用治療有效量的一氧化氮前體。所述施用可以是靜脈內(nèi)或者口服施用。一氧化氮前體可選自瓜氨酸、精氨酸及其組合。在一些實施方案中，所述疾病是壞死性小腸結腸炎(NEC)，所述對象是早產(chǎn)兒。本發(fā)明還揭示了一種提高需要其的對象中硝酸前體水平的方法。在一些實施方案中，所述方法包括給對象施用治療有效量的一氧化氮前體，從而提高對象中一氧化氮前體的水平。所述施用可以是靜脈內(nèi)或者口服施用。所述一氧化氮前體可選自瓜氨酸、精氨酸及其組合。任選地，本發(fā)明的補充治療方法進一步包括最初檢測對象中氨甲酰磷酸合成酶I(CPSI)基因的多態(tài)性的步驟。氨甲酰磷酸合成酶多肽的多態(tài)性包括在一些實施方案中CPSI外顯子36中C顛換為A，包括在一些實施方案中相應于CPSI基因的cDNA的第4340位核苷酸C顛換為A，及在一些實施方案中相應于CPSI基因的cDNA的第4340位核苷酸的C顛換為A進一步包括三聯(lián)體密碼子AAC改變?yōu)锳CC，所述密碼子編碼在第1405位氨基酸具有蘇氨酸部分的CPSI多肽。在經(jīng)歷于本發(fā)明揭示的T1405NCPSI多態(tài)性相關的BMT的對象中觀測到尿素循環(huán)中間體(瓜氨酸，精氨酸)明顯降低。根據(jù)本發(fā)明，提供了一種治療或者預防BMT毒性(如HVOD和/或急性肺損傷)的方法，包括給需要治療的對象施用治療有效量的NO前體，如瓜氨酸和/或精氨酸。在一些實施方案中，本發(fā)明揭示的T1405NCPSI多態(tài)性存在于對象中。在一些實施方案中，給對象施用治療有效量的瓜氨酸。根據(jù)本發(fā)明，因此提供了一種降低經(jīng)歷BMT的對象中HVOD毒性和/或發(fā)生的方法。這種方法包括給BMT對象施用有效量的精氨酸和/或瓜氨酸，在一些實施方案中為瓜氨酸，以支持對象中精氨酸和NO合成。支持對象中精氨酸和NO的合成將降低和/或基本上防止與BMT相關的HVOD發(fā)生。瓜氨酸是更易于轉變?yōu)镹O的一種代表性補充劑。另外，預期具有本發(fā)明揭示的CPSI多態(tài)性的對象是根據(jù)這種方法補充的候選者。本發(fā)明治療的對象在許多實施方案中是人，但應理解本發(fā)明原則上對于所有脊椎動物物種均有效，包括溫血脊椎動物如哺乳動物和鳥類，其包括在術語“對象”的范疇內(nèi)。在本文中，哺乳動物包括需要治療其高血氨癥、BMT毒性和與受損的尿素循環(huán)功能相關的其它疾病的任何哺乳動物物種，特別是農(nóng)業(yè)和家養(yǎng)哺乳動物物種。因此，預期本發(fā)明用于治療哺乳動物如人，以及那些重要的瀕危哺乳動物(如東北虎(Siberiantigers))，經(jīng)濟學重要的哺乳動物(用于人類消費的農(nóng)場飼養(yǎng)動物)和/或社會重要的動物(寵物或者動物園中的動物)，例如除了人之外的食肉動物(如貓和狗)、豬(家豬，公豬和野豬)、反芻動物(如牛、公牛、綿羊、長頸鹿、鹿、山羊、野牛和駱駝)和馬。預期本發(fā)明也可以治療鳥類，包括治療那些瀕危的、動物園中的那些種類的鳥類，以及禽類，更特別是馴養(yǎng)的禽類即家禽，如火雞、雞、鴨、鵝、珍珠雞等等，它們對于人類也是經(jīng)濟學重要的。因此，預期本發(fā)明用于治療家畜，包括但不限于馴養(yǎng)的豬(家豬和公豬)、反芻動物、馬、家禽等等?？梢耘c載體材料組合產(chǎn)生單一劑量形式的活性成分的量根據(jù)治療的宿主和施用的特殊模式而變化。例如，施用給人的制劑可含有0.5mg-5g活性劑，及適當及常規(guī)量的載體材料，其占總組合物的大約5％-95％。例如，在成人，每人每次施用的劑量通常為1mg-500mg，直至每天多次。因此，劑量單位形式通常含有大約1mg-500mg活性成分，典型為25mg、50mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、800mg或者1000mg。一氧化氮前體在一些實施方案中施用的劑量范圍是大約0.01mg-1000mg，在一些實施方案中為大約0.5mg-500mg，在一些實施方案中為大約1.0mg-250mg。一氧化氮前體在一些實施方案中施用的劑量范圍也可以是大約100mg-30000mg，在一些實施方案中為大約250mg-1000mg。代表性的劑量為3.8g/m2/天精氨酸或者瓜氨酸(摩爾當量，MWL-瓜氨酸175.2，MWL-精氨酸174.2)。代表性靜脈內(nèi)瓜氨酸溶液可包含100mg/ml(10％)溶液。代表性靜脈內(nèi)瓜氨酸劑量可包含200mg/kg、400mg/kg、600mg/kg和800mg/kg。在一些實施方案中，例如但不限于600或800mg/kg劑量，該劑量可減少50mg/kg-100mg/kg以減輕觀測到的對體循環(huán)血壓的非所需作用。在一些實施方案中，在暴露于環(huán)境刺激之前(例如在開始心臟手術如心肺轉流術之前30分鐘施用一個劑量和/或圍術期期間施用直至1、2、3、4、5、6或更多個劑量，如在手術之前每12小時施用一次)在暴露于環(huán)境刺激之后給對象施用劑量(例如在達到術后監(jiān)護室時施用、和/或在術后期間施用直至1、2、3、4、5、6或更多個劑量，如術后每12小時施用一次)。然而，應理解對于任何特定對象的特異劑量水平根據(jù)許多因素而定，包括年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、施用時間、施用途徑、排泄速度、藥物組合及治療的特定疾病的嚴重程度。F.藥物組合物在一些實施方案中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的多肽或多核苷酸及生理學可接受的載體的藥物組合物。在一些實施方案中，藥物組合物包含編碼生物學活性CPSI多肽的多核苷酸。或者，本發(fā)明提供了包含如上述劑量的瓜氨酸或精氨酸的藥物組合物。本發(fā)明的組合物典型以含有標準的、熟知的無毒性生理可接受的所需載體(carrier)、佐劑和載體(vehicle)的劑量單位制劑形式口服或胃腸外施用。如本文所用，術語“胃腸外施用”包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)注射或者灌注技術。可注射的制品，例如無菌可注射的含水或含油懸浮液，是根據(jù)本領域已知的技術使用合適的分散劑或者增濕劑和懸浮劑配制的。無菌可注射制品也可以是于無毒性胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸浮液，如于1，3-丁二醇中的溶液?？梢詰玫目山邮艿妮d體和溶劑是水、Ringer’s溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，無菌、固定油通常用作溶劑或者懸浮介質(zhì)。為此，可以應用任何無刺激性的固定油，包括合成的甘油單酯或甘油二酯。另外，在制備可注射的制品時使用脂肪酸如油酸。載體的例子包括中性磷酸鹽、乳酸鹽、Tris等緩沖鹽溶液。當然，在用于基因治療的藥物組合物的情況中，將所述載體純化以足以使其基本上沒有非所需的污染物，如缺陷的干擾腺病毒顆粒或者內(nèi)毒素及其它致熱原，由此在接受該載體構建體的個體中不引起任何不利的反應。純化載體的代表性方法包括使用浮力密度梯度，如氯化銫梯度離心。轉染的細胞也可以作為載體。例如，可以從機體中移出肝細胞，使用上述方法用本發(fā)明的多核苷酸轉染，然后將轉染的細胞再回輸機體(例如經(jīng)血管內(nèi)注射)。G.抗體的產(chǎn)生在一些實施方案中，本發(fā)明提供了與本發(fā)明的多肽或多核苷酸免疫反應的抗體。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體是單克隆抗體。制備和鑒定抗體的方法為本領域所熟知(見例如AntibodiesALaboratoryManual，E.HowellandD.Lane，ColdSpringHarborLaboratory，1988)。在一些實施方案中，抗體區(qū)別包含CPSI多態(tài)性的不同形式的CPSI。簡而言之，多克隆抗體是通過用包含本發(fā)明的多肽或多核苷酸的免疫原免疫動物，從免疫的動物中收集抗血清而制備。許多動物物種均可用于產(chǎn)生抗血清。典型地，用于產(chǎn)生抗血清的動物是兔、小鼠、大鼠、倉鼠或者豚鼠。由于兔的血液體積相對較大，因此例如選擇兔生產(chǎn)多克隆抗體。如本領域所熟知，本發(fā)明提供的多肽或多核苷酸的免疫原性可以不同。因此通常必需將本發(fā)明的免疫原(例如本發(fā)明的多肽或多核苷酸)與載體偶聯(lián)。載體的例子是匙孔血藍蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。其它白蛋白如卵清蛋白、小鼠血清白蛋白或者兔血清白蛋白也可以用作載體。將多肽或多核苷酸與載體蛋白綴合的方法為本領域所熟知，包括使用戊二醛、m-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯(m-maleimidobencoyl-N-hydroxysuccinimideester)、碳二亞胺和bis-biazotizedbenzidine。也如本領域所熟知，對特定免疫原的免疫原性可以通過使用稱作佐劑的免疫應答的非特異性刺激劑而增強。佐劑的例子包括完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑和氫氧化鋁佐劑。用于產(chǎn)生多克隆抗體的免疫原的量根據(jù)免疫原的性質(zhì)以及用于免疫的動物而有所不同。許多途徑可用于施用免疫原，例如皮下、肌內(nèi)、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi)。多克隆抗體的產(chǎn)生通過在免疫后的不同時間點取免疫動物的血樣進行監(jiān)測。當獲得所需水平的免疫原性時，給免疫動物放血，分離血清并貯存。另一方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生與CPSI多肽免疫反應的抗體的方法，所述方法包括如下步驟(a)用編碼所述多肽的多核苷酸轉染重組宿主細胞；(b)在足以使得所述多肽表達的條件下培養(yǎng)宿主細胞；(c)回收所述多肽；及(d)制備該多肽的抗體。在一些實施方案中，CPSI多肽能介導尿素循環(huán)的第一個步驟，與抗CPSI抗體交叉反應，或者具有本發(fā)明揭示的其它生物學活性。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)上述方法制備的抗體。本發(fā)明的單克隆抗體可易于通過使用熟知的技術制備，所述技術如美國專利No4,196,265所例證那些技術，該專利并入本文作參考。典型地，一種技術包括首先用選擇的抗原(例如本發(fā)明的多肽或多核苷酸)以足以提供免疫應答的方式免疫合適的動物。所述動物的例子如嚙齒動物如小鼠和大鼠。然后將免疫動物的脾細胞與無限增殖化的骨髓瘤細胞融合。免疫動物是小鼠時，代表性的骨髓瘤細胞是小鼠NS-1骨髓瘤細胞。將融合的脾/骨髓瘤細胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以從親代細胞中選擇融合的脾/骨髓瘤細胞。從未融合的親代細胞混合物中分離融合的細胞，例如通過加入阻斷核苷酸在組織培養(yǎng)基中從頭合成的制劑而分離。所述制劑的例子是氨基蝶呤、氨甲蝶呤和重氮絲氨酸。氨基蝶呤和氨甲蝶呤既阻斷嘌呤和嘧啶的從頭合成，而重氮絲氨酸僅阻斷嘌呤合成。使用氨基蝶呤或氨甲蝶呤時，培養(yǎng)基補加次黃嘌呤和胸苷作為核苷酸源。使用重氮絲氨酸時，培養(yǎng)基補加次黃嘌呤。這種培養(yǎng)提供了一群雜交瘤，從中選擇特異性雜交瘤。典型地，通過在微滴定平板中單一克隆稀釋培養(yǎng)細胞，隨后測試各個克隆上清與抗原多肽的反應性，從而選擇雜交瘤。然后將選擇的克隆無限期增殖，以提供單克隆抗體。例如，為了產(chǎn)生本發(fā)明的抗體，為小鼠腹膜內(nèi)注射大約1-200μg的包含本發(fā)明多肽的抗原。通過注射與佐劑締合的抗原刺激B淋巴細胞生長，所述佐劑例如是完全弗氏佐劑(含有滅活的結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的免疫應答非特異性刺激劑)。在第一次注射后一定時間(例如至少兩周)，為小鼠注射第二次劑量的與不完全弗氏佐劑混合的抗原以加強免疫。在第二次注射幾周后，將小鼠尾部放血，通過針對放射標記的抗原進行免疫沉淀而滴定血清。在一些實施方案中，重復加強和滴定步驟直至達到合適效價。移出最高效價小鼠脾，并將脾用注射器均質(zhì)獲得脾淋巴細胞。典型地，來自免疫小鼠的脾含有大約5×107至2×108個淋巴細胞。已知為骨髓瘤細胞的突變淋巴細胞得自實驗動物，其中這種細胞已經(jīng)通過許多熟知的方法誘導生長。骨髓瘤細胞缺少核苷酸生物合成的挽救途徑。由于骨髓瘤細胞是腫瘤細胞，因此它們可以在組織培養(yǎng)中無限增殖，并因此稱為無限增殖化。已經(jīng)從小鼠和大鼠中建立了骨髓瘤細胞的許多培養(yǎng)細胞系，如鼠NS-1骨髓瘤細胞。將骨髓瘤細胞在適于促進融合的條件下與來自注射了本發(fā)明的抗原/多肽的小鼠或大鼠脾的正?？贵w產(chǎn)生細胞組合。融合條件包括例如存在聚乙二醇。所得融合的細胞是雜交瘤細胞。與骨髓瘤細胞同樣，雜交瘤細胞在培養(yǎng)物中無限生長。雜交瘤細胞通過在選擇培養(yǎng)基如HAT培養(yǎng)基(次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)中培養(yǎng)而與未融合的骨髓瘤細胞分離。未融合的骨髓瘤細胞缺少從挽救途徑中合成核苷酸必需的酶，因為其在存在氨基蝶呤、氨甲蝶呤或者重氮絲氨酸的條件下被失活。未融合的淋巴細胞在組織培養(yǎng)物中也不持續(xù)生長。因此，只有成功融合的細胞(雜交瘤細胞)才可以在選擇培養(yǎng)基中生長。每個存活的雜交瘤細胞均產(chǎn)生單一抗體。然后篩選這些細胞產(chǎn)生與本發(fā)明的抗原/多肽免疫反應的特異性抗體。單一細胞雜交瘤通過限制性稀釋雜交瘤而分離。將雜交瘤系列稀釋多次，在使得所述稀釋物生長之后，測試上清中單克隆抗體的存在情況。然后將產(chǎn)生抗體的克隆大量培養(yǎng)以產(chǎn)生所需數(shù)量的本發(fā)明的抗體。通過使用本發(fā)明的單克隆抗體，可以將本發(fā)明的特異性多肽和多核苷酸識別作抗原，并因此鑒別。一旦鑒別，則那些多肽和多核苷酸可以通過如抗體親和層析技術而分離和純化。在抗體親和層析技術中，將單克隆抗體與固體底物結合并暴露于含有所需抗原的溶液。通過與結合抗體的免疫特異性反應從溶液中除去抗原。然后易于從底物中除去所述多肽或多核苷酸并純化。H.檢測本發(fā)明的多核苷酸或多肽另外，本發(fā)明提供了一種檢測本發(fā)明的多肽的方法，其中所述方法包括將多肽與根據(jù)上述方法制備的抗體免疫反應以形成抗體-多肽綴合物，及檢測所述綴合物。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了一種檢測編碼本發(fā)明多肽的信使RNA轉錄物的方法，其中所述方法包括將所述信使RNA轉錄物與編碼所述多肽的多核苷酸序列雜交形成雙鏈體，及檢測所述雙鏈體。或者，本發(fā)明提供了一種檢測編碼本發(fā)明多肽的DNA分子的方法，其中所述方法包括將DNA分子與編碼所述多肽的多核苷酸雜交形成雙鏈體，及檢測所述雙鏈體。本文揭示的檢測和篩選方法可用作預后工具。人CPSI編碼多核苷酸以及其蛋白質(zhì)產(chǎn)物可易于用于臨床中作為預后指示劑，以在人中篩選對于高氨血癥及對于其它遺傳的CPSI相關疾病的易感性。本文揭示的檢測和篩選方法也可以用作診斷方法的一部分。人CPSI編碼多核苷酸以及其蛋白質(zhì)產(chǎn)物可易于用于臨床中以在人中診斷對于高氨血癥及對于其它遺傳的CPSI相關疾病的易感性。H.1.本發(fā)明多肽的篩選分析本發(fā)明提供了一種篩選生物學樣品中CPSI多肽存在情況的方法。在一些實施方案中，CPSI多肽在尿素循環(huán)中具有活性，與抗CPSI抗體交叉反應，或者具有本發(fā)明的其它生物學活性。篩選的生物學樣品可以是生物學體液如細胞外或者細胞內(nèi)體液或者細胞或者組織提取液或勻漿。生物學樣品也可以是分離的細胞(例如于培養(yǎng)物中)或者細胞集合如在組織樣品或者組織學樣品中。組織樣品可以懸浮于液體培養(yǎng)基中或者固定在固體支持物如顯微鏡載玻片上。特別期望的組織是肝組織。在一些實施方案中，提供了區(qū)分N1405CPSI多肽和T1405CPSI多肽的抗體。這種抗體可包含多克隆抗體，但在一些實施方案中包含如上所述制備的單克隆抗體。根據(jù)篩選分析方法，將生物學樣品暴露于與要分析其存在情況的多肽免疫反應的抗體。典型地，暴露是通過在含有抗體和候選多肽的液體培養(yǎng)基中形成混合物而實現(xiàn)的?？贵w或者具有所述多肽的樣品可以固定在固體支持物上(例如柱或者微滴定平板)。將生物學樣品在生物學反應條件下暴露于所述抗體并持續(xù)足夠的時間以使得抗體-多肽綴合物形成。生物學反應條件包括離子成分和濃度、溫度、pH等等。離子成分和濃度的范圍是蒸餾水至2摩爾NaCl溶液。在一些實施方案中，重量摩爾滲透壓濃度范圍是大約100mosmols/l至大約400mosmols/l，在一些實施方案中為大約200mosmols/l至大約300mosmols/l。溫度在一些實施方案中為大約4℃至大約100℃，在一些實施方案中為大約15℃至大約50℃，在一些實施方案中為大約25℃至大約40℃。pH在一些實施方案中為大約4.0-9.0，在一些實施方案中為大約6.5-8.5，在一些實施方案中為大約7.0-7.5。對生物學反應條件的唯一限制是選擇使得抗體-多肽綴合形成的條件，及所述條件對所述抗體或多肽無不利影響。暴露時間隨著使用的生物學條件、抗體和多肽的濃度及樣品的性質(zhì)(例如體液或者組織樣品)而變化。確定暴露時間的方法為本領域技術人員所熟知。典型地，在樣品是體液及樣品中多肽的濃度為大約10-10M的情況中，暴露時間為大約10分鐘至大約200分鐘。樣品中多肽的存在通過檢測抗體-多肽綴合物的形成及存在情況而檢測。檢測這種抗體-抗原(例如受體多肽)綴合物或者復合物的方法為本領域所熟知，包括離心、親和層析等、二級抗體與抗體-候選受體復合物的結合等方法。在一些實施方案中，檢測是通過檢測固定于抗體的指示劑而實現(xiàn)。例如熟知的這種指示劑包括放射性標記(例如32P、125I、14C)、另一種抗體或者酶如辣根過氧化物酶。將指示劑固定于抗體的方法為本領域所熟知。可利用商業(yè)試劑盒。H.2.抗多肽抗體的篩選分析另一方面，本發(fā)明提供了一種篩選生物學樣品中與CPSI多肽免疫反應的抗體存在情況的方法。在一些實施方案中，CPSI多肽在尿素循環(huán)中具有活性，與抗CPSI抗體具有交叉反應性，或者具有本發(fā)明揭示的其它生物學活性。根據(jù)這種方法，將生物學樣品在生物學條件下暴露于CPSI多肽，并持續(xù)足夠的時間以使得抗體-多肽綴合物形成，并檢測形成的綴合物。H.3.編碼本發(fā)明的CPSI多肽的多核苷酸的篩選分析核酸分子、特別是探針分子可用作寡核苷酸探針以與懷疑編碼本發(fā)明的CPSI多肽的核酸源雜交。最佳地，所述CPSI多肽在尿素循環(huán)中具有活性，與抗CPSI抗體具有交叉反應性，或者具有本發(fā)明揭示的其它生物學活性。所述探查通常是通過將所述寡核苷酸與懷疑具有CPSI基因的DNA源雜交而實現(xiàn)。在一些情況中，所述探針僅是一種單一探針，在其它情況中所述探針基于某一氨基酸序列或者多肽序列并考慮其由于遺傳密碼固有的冗余性而有的多樣性而是探針集合。以這種方式探查的合適DNA源能表達本發(fā)明的多肽，并且可以是感興趣細胞系的基因組文庫。或者，DNA源包括感興趣細胞系的全部DNA。一旦本發(fā)明的雜交方法鑒別了一個候選DNA節(jié)段，則證實通過進一步雜交、限制酶作圖、測序和/或表達及測試獲得陽性克隆?；蛘?，這種DNA分子可用于許多技術中，包括用作(1)診斷工具以檢測衍生自對象細胞的DNA中正常和異常的DNA序列，如本文所述的CPSI多態(tài)性；(2)檢測和分離所述多肽家族的其它成員和潛在含有這種序列的DNA文庫的相關多肽的工具；(3)與相關序列雜交以擴增這些序列的引物；(4)改變天然CPSIDNA序列的引物；以及用于依賴于DNA序列與本文揭示的那些DNA節(jié)段的相似性的其它技術中。如上所示，在某些方面，本發(fā)明提供的DNA序列信息可以制備與選擇的CPSI基因編碼序列特異性雜交的相對短的DNA(或RNA)序列(例如探針)。在這些方面，基于本發(fā)明多肽的編碼序列制備合適長度的核酸探針。這種核酸探針與其它編碼序列特異性雜交的能力使得其可特別用于多種實施方案中。最重要的是所述探針可用于許多分析中以檢測給定樣品中互補序列的存在。然而，所述探針還具有其它方面的應用，包括使用該序列信息制備突變物種引物，或者用于制備其它遺傳構建體的引物。為了提供本發(fā)明的某些優(yōu)勢，用于雜交研究或者分析的代表性核酸序列包括探針序列，其與本發(fā)明的核酸序列(例如SEQIDNO1、3、11和13任一所示序列)的至少14-40個或者這樣長的一段核苷酸序列互補。長度為至少14個核苷酸的大小有助于保證該片段足夠長以形成既穩(wěn)定又具有選擇性的雙鏈體分子。在一些實施方案中可使用具有長度為14個堿基以上的互補序列的分子，以提高雜種的穩(wěn)定性和選擇性，從而改良獲得的特異性雜種分子的性質(zhì)和程度。在一些實施方案中，可以應用具有14-20個核苷酸或者更長的基因互補序列的核酸分子。這種片段可易于制備，例如通過化學方法直接合成該片段、通過應用核酸再生技術如美國專利No.4,683,202所述的PCR技術、或者通過將選擇的序列導入重組載體中重組產(chǎn)生。因此，本發(fā)明的核苷酸序列具有與所述基因的互補序列選擇性形成雙鏈體分子的能力，故可用于本發(fā)明。根據(jù)預期的應用，可以利用不同的雜交條件以達到探針對于靶序列的不同程度選擇性。對于需要高度選擇性的應用，典型地應用相對嚴格的條件以形成雜種。例如，選擇相對低的鹽濃度和/或高溫條件，如0.02M-0.15M鹽濃度和大約50-70℃的溫度，特別是大約55℃、大約60℃和大約65℃的溫度。這種條件是特別選擇性的，并且?guī)缀醪荒褪芴结樅湍０寤蛘甙墟溨g的錯配(如果有)。當然，對于一些應用而言，例如希望應用與基本模板雜交的突變引物鏈制備突變體的情況中，或者在試圖從相關物種、功能等價物等中分離多肽編碼序列的情況中，典型需要較低嚴格雜交條件，以使得異源雙鏈體形成。在這種情況中，應用的條件例如是0.15M-0.9M鹽濃度，溫度為大約20℃至大約55℃，特別是大約25℃、大約37℃、大約45℃及大約50℃。交叉雜交物種可因此易于鑒別為就對照雜交而言是陽性雜交信號。在任何情況中，通常意識到所述條件可以通過加入增加量的甲酰胺而使其更加嚴格，其使得雜種雙鏈體以如升高溫度同樣的方式去穩(wěn)定。因此，雜交條件可易于操縱，并因此通常根據(jù)所需結果加以選擇。在一些實施方案中，應用組合適當手段如標記的本發(fā)明的核酸序列確定雜交是有利的。本領域已知眾多的適當?shù)闹甘緞┦侄?，包括放射性標記、酶標記或其它配體，如抗生物素蛋白/生物素，其能提供可檢測的信號。在一些實施方案中，可以應用酶標記，如脲酶、堿性磷酸酶或過氧化物酶，代替放射性或者其它不合環(huán)境需要的試劑。在酶標記的情況中，已知量熱指示劑底物可用于提供人肉眼或者分光光度法可觀測到的手段，以鑒別與含有互補核酸的樣品的特異性雜交。通常，預期本文所述的雜交探針可在溶液雜交中作為試劑，在一些實施方案中也可以應用固相。在包含固相的一些實施方案中，含有測試DNA(或RNA)的樣品附著于或另外固定于選擇的基質(zhì)或表面上。然后將這個固定的、單鏈核酸與選擇的探針在所需條件下進行特異性雜交。選擇的條件依賴于特定的環(huán)境，基于特定的需要標準(例如依賴于G+C含量、靶核酸類型、核酸來源、雜交探針大小等等)。在洗滌雜交表面以除去非特異性結合的探針分子之后，檢測特異性雜交，或者利用標記進行量化。H.4.分析試劑盒另一方面，本發(fā)明提供了一種診斷試劑盒以檢測生物學樣品中本發(fā)明多肽的存在，其中所述試劑盒包含第一個容器，其含有能與所述多肽免疫反應的第一種抗體，所述第一種抗體的量足以進行至少一次分析。在一些實施方案中，本發(fā)明的分析試劑盒進一步包含第二個容器，其含有與第一種抗體免疫反應的第二種抗體。在一些實施方案中，本發(fā)明的分析試劑盒中使用的抗體是單克隆抗體。在一些實施方案中，第一種抗體固定于固體支持物上。在一些實施方案中，所述第一種和第二種抗體包含一種指示劑，及在一些實施方案中，所示指示劑是一種放射性標記或者酶。本發(fā)明還提供了一種診斷試劑盒以篩選制劑。這種試劑盒含有本發(fā)明的多肽。所述試劑盒可含有檢測制劑與本發(fā)明的受體之間相互作用的試劑。提供的試劑可以是放射性標記的。所述試劑盒可含有能結合或者與本發(fā)明的受體相互作用的一種已知放射性標記的制劑。另一方面，本發(fā)明提供了檢測生物學樣品中編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的存在的診斷分析試劑盒，所述試劑盒包含第一個容器，在一些實施方案中其含有與SEQIDNO1、3、11和13任一所示序列的至少10個連續(xù)核苷酸堿基的節(jié)段相同或互補的第二種多核苷酸。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了檢測生物學樣品中與本發(fā)明多肽免疫反應的抗體的存在的診斷分析試劑盒，所述試劑盒包含第一個容器，其中含有與所述抗體免疫反應的CPSI多肽，所述多肽的量足以進行至少一次分析。在一些實施方案中，所述CPSI多肽在尿素循環(huán)中具有活性，與抗CPSI抗體具有交叉反應性，或者具有本發(fā)明揭示的其它生物學活性。所述試劑盒的試劑可以是液體溶液形式、附著于固體支持物或者是干燥的粉末形式。在一些實施方案中，當所述試劑是液體溶液形式時，所述液體溶液是含水溶液。在一些實施方案中，當所述試劑附著于固體支持物時，所述固體支持物可以是層析介質(zhì)或者顯微鏡載玻片。當所述試劑是干燥的粉末時，所述粉末可以通過加入合適的溶劑而重建的(reconstituted)?？梢蕴峁┧鋈軇?。實施例如下實施例例證了本發(fā)明的代表模式。如下實施例的某些方面描述了本發(fā)明的技術和方法以更好地實踐本發(fā)明。這些實施例通過使用本發(fā)明人的標準實驗室操作得以例證。根據(jù)本發(fā)明的揭示及本領域的技術水平，技術人員意識到如下實施例只是例證了本發(fā)明，在不偏離本發(fā)明精神和范圍的前提下可對本發(fā)明進行各種變化、修改和改變。實施例1-3中使用的材料和方法如下材料和方法用于實施例1-3中。在每個實施例中還描述了另外的材料和方法。臨床/患者募集在VanderbiltUniversityMedicalCenter，Nashville，Tennessee進行BMT的200多名患者登記在BMT-LungInjuryFollowingEngraftment(LIFE)研究中，以研究移植后急性肺損傷和多臟器衰竭的機制。從經(jīng)歷BMT或者PBSCT治療惡性腫瘤的患者中得到同意。臟器衰竭(包括HVOD)及逆轉的定義是預先確定的，在住院治療期間同時收集數(shù)據(jù)。在進行研究登記時(接受化療之前)及在完成燒蝕化療-放療(ablativechemo-radiotherapy)之后進行移植當天(在灌注骨髓之前)收集血漿、細胞沉淀和尿液。氨基酸分析在收集血液和尿液后將其立即離心。所有樣品均置于冰上，然后在-70℃貯存直至進行分析。在這些貯存條件下，已知谷氨酰胺、半胱氨酸和高半胱氨酸減少，因此這些氨基酸不用于分析中。血漿氨基酸在VanderbiltDiagnosticLaboratories，VanderbiltUniversity，Nashville，Tennessee測定。簡而言之，血漿的無蛋白質(zhì)提取物通過使用磺基水楊酸沉淀蛋白質(zhì)及經(jīng)過0.45μmACRODISCTM4濾膜(GelmanSciences，AnnArbor，Michigan)過濾而制備。氨基酸通過陽離子交換層析使用4-成分(four-component)ph-和離子強度-梯度的檸檬酸鋰緩沖系統(tǒng)于Beckmann7300氨基酸分析儀(Beckmann，PaloAlto，California)上分離。氨基酸與茚三酮的柱后衍生化可以在570nm檢測伯胺氨基酸，在440nm檢測仲胺。通過標準參考物質(zhì)設備標準進行量化(Sigma，St.Louis，Missouri)。統(tǒng)計學血漿氨基酸值以平均值±SEM表示?；€與化療后氨基酸值之間的對比使用Student’st-Test進行。使用卡方分析(Chisquareanalysis)對比有和無HVOD患者之間的等位基因出現(xiàn)頻率?；颊呋颊呤菑脑赩anderbiltUniversity的BMTLift研究中登記的那些患者中確定的。從移植前血液或離心尿液樣品中分離DNA。HVOD狀態(tài)使用Baltimore標準確定-膽紅素＞2.0mg/dl-肝腫大-2％突然體重增加基因定型使用QIAMPTM血液試劑盒(Qiagen)分離DNA。如下所示，T1405N多態(tài)性改變DNA序列CCT-GCC-ACC-CCA-GTG正常CCT-GCC-AAC-CCA-GTG改變C顛換為A是嘌呤A置換嘧啶C，這樣破壞了Msl1位點。使用CPSI的第35內(nèi)含子中的引物和CPSI基因的外顯子36的外來引物通過PCR擴增了包括含有所述改變的區(qū)域的387bp片段。這種組合提供了有力的擴增。PCRReady-to-GoTM珠也用于擴增中(Pharmacia)。使用非變性凝膠，利用通過C顛換為A產(chǎn)生的二級結構檢測多態(tài)性。這種改變產(chǎn)生足夠的二級結構以防止限制酶(MslI)的可信消化以檢測多態(tài)性。這種改變還干擾直接的序列分析，除非在反應中用ITP代替GTP。非變性凝膠利用通過這種改變產(chǎn)生的二級結構。通過這種方法和序列分析對比15個個體。為了檢測凝膠中的DNA片段，采用銀染技術。這種便宜的快速方法可以在電泳后立刻觀測條帶。統(tǒng)計學分析獲得足夠的樣品大小以對結果進行卡方分析。使用Hardy-Weinburg等式計算基因型的預期頻率(p2+2pq+q2)。從標準卡方表中使用2度自由度獲得P值。實施例1在有或無HVOD的情況中CPSI外顯子多態(tài)性(T1405N)的等位基因不在Hardy-Weinburg平衡中根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)鑒別了在CPSImRNA的3’末端附近的共同多態(tài)性(大約.44雜合性)。對這種改變進行的序列分析表明在4340位堿基C顛換為A將三聯(lián)體密碼子ACC改變?yōu)锳AC。這樣導致了第1405位氨基酸由天冬酰胺取代蘇氨酸(在本文稱作T1405N)。蘇氨酸在變構結構域中，在特征序列PV(A/S)WP(T/S)(A/Q)E之前，所述特征序列對于輔因子n-乙酰-谷氨酸(NAG)的結合是重要的。在所有已知的由NAG激活的CPSI中，蘇氨酸殘基在特征序列之前的兩個殘基之中(Rubio，BiochemicalSocietyTransactions21198-202(1998))?；诮Y構-功能研究，感覺與NAG的乙酰氨基基團的羰基氧形成的氫鍵在這種激活物的結合中起作用(Stapletonetal.，Biochemistry3514352-14361(1996)；Javid-Majdetal.，Biochemistry3514362-14369(1996))。預期天冬酰胺對蘇氨酸側鏈的取代改變與NAG形成氫鍵，導致CPSI酶功能及對NAG可利用集合的敏感性在性質(zhì)上的改變。盡管申請人不希望受到任何特定實施理論的約束，基于其它異生素作用的先例，在逐步增高劑量化療之后NAG的有限可利用性是促進尿素循環(huán)功能失調(diào)的機制之一。從BMTLifeStudy研究組中對126個個體確定基因型。這個組中30個個體出現(xiàn)HVOD跡象(24％)。70名患者通過血液樣品確定基因型，56名患者通過尿液細胞沉淀中確定基因型。將15名患者的樣品通過PCR再次擴增及測序，以證實結果的一致性。表2和3示出了HVOD+和HVOD-患者之間T1405N多態(tài)性的基因型分析結果。C等位基因，在本文也稱作CPSIa等位基因或者蘇氨酸編碼等位基因，在檢測的群體中的出現(xiàn)頻率為0.62；A等位基因，在本文也稱作CPSIb等位基因或者天冬酰胺編碼等位基因，出現(xiàn)頻率為0.38。該表的卡方值為4.3(P＝0.1)，表明多態(tài)性在存在HVOD的情況中可能不在Hardy-Weinburg平衡中。因此，這些結果提供了具有HVOD的BMT患者中T1405N等位基因分布的不平衡跡象，表明所述多態(tài)性可用于鑒別對BMT毒性易感的對象。表2基因型HVOD+HVOD-CC13(預期11.4)32(預期36.5)AC16(預期14.1)50(預期45.1)AA1(預期4.5)14(預期14.4)表3全部等位基因預期頻率A96AA0.15C62AC0.47CC0.38從對大約200名患者進行的研究中收集的另外的數(shù)據(jù)提供了另外的統(tǒng)計學證據(jù)，支持了可以使用多態(tài)性檢測對亞最佳尿素循環(huán)功能的易感性。將這個數(shù)據(jù)進行上述統(tǒng)計學方法分析。骨髓移植物毒性導致明顯的發(fā)病率和死亡率。HVOD與BMT患者預后不佳相關。進行這項研究以評定CPSI酶與HVOD的發(fā)生之間的聯(lián)系。T1405N多態(tài)性影響CPSI功能。其在群體中的廣泛分布提示這兩種形式在正常條件下均提供足夠的尿素循環(huán)功能。加入代謝應激物(如高劑量化療)以使CPSI效力降低于有效閾值之下。因此數(shù)據(jù)分析提示HVOD更可能出現(xiàn)在具有蘇氨酸而不是天冬酰胺編碼等位基因的患者中。蘇氨酸編碼等位基因是嚙齒動物CPSI形式共有的。實施例2骨髓移植后并發(fā)癥患者中氨甲酰磷酸合成酶I的生物化學和遺傳改變骨髓移植(BMT)和外周血干細胞移植(PBSCT)越來越多地用作治療經(jīng)選擇的惡性腫瘤的主要治療方法。干細胞的使用支持造血重建，可以實質(zhì)增加化療劑量以嘗試根除潛在的致死癌癥。盡管感染的預防和移植物抗宿主病的預防均有改觀，但化療誘導的臟器障礙仍是這種治療方法更廣泛應用的明顯障礙。肝靜脈梗阻癥(HVOD)，一種在BMT后早期出現(xiàn)高膽紅素血癥(血清膽紅素＞2.0mg/dL)、肝腫大及體液滯留(fluidretention)的臨床綜合征是在BMT后一種主要的劑量限制毒性，使得接近54％的患者處于痛苦之中。許多患者在BMT后產(chǎn)生HVOD也符合急性肺損傷(ALI)的標準。接近一半的具有嚴重HVOD的患者需要機械性換氣，護理死亡率(attendantmortality)超過90％。這種數(shù)據(jù)強調(diào)了對相繼的臟器障礙、甚至在年輕患者群中引起的死亡率的重大影響，并且強化了患者急性肺損傷后預后不佳與肝功能損害之間的臨床重要聯(lián)系。造成這種器官相互作用的機制還不完全了解。在這個實施例中，分析了在BMT之前施用的條件化化療是否可以影響UC中的早期酶及其次使患者傾向于肝功能損害和多臟器衰竭。血漿氨基酸分析支持了受損的UC功能和降低的一氧化氮(NOx)產(chǎn)生的觀點。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，篩選患者本發(fā)明揭示的CPSI中的外顯子單核苷酸多態(tài)性(SNP)。發(fā)現(xiàn)SNP純合性與BMT后HVOD降低及早期存活力增強相關，與明顯的藥物遺傳學相互作用一致。方法臨床/患者募集在過去的三年里，將200名在VanderbiltUniversityMedicalCenter接受BMT的患者相繼登記在MarrowTransplant-LungInjuryFollowingEngraftment(BMT-LIFE)研究中，這項研究是針對于了解移植后急性肺損傷和多臟器衰竭機制的一種臨床-生物化學配合研究。關于臟器衰竭和逆轉的定義如預先所定義，在住院期間和直至BMT后60天同時收集數(shù)據(jù)。除外標準包括活性病毒和先前增加劑量的造血干細胞支持治療(PBSCT或BMT)。肝靜脈梗阻癥(HVOD)在移植后21天之前膽紅素＞2mg/dL的患者中鑒別，相對于基線患者體重增加＞5％或者新發(fā)生輕度肝腫大。急性肺損傷(ALI)定義為在無臨床心臟功能障礙的情況中，連續(xù)3天在胸部X射線發(fā)現(xiàn)雙側浸潤，并且動脈血中氧分壓與吸入的氧濃度分數(shù)的比率(PaO2/FiO2)低于300。在移植后存活60天的患者定義為存活者。在登記研究時(接受化療之前)和在BMT當天及在完成高劑量化療后幾天但在骨髓灌注之前收集血漿、循環(huán)細胞沉淀和尿液。將樣品等分，立即置于冰上，之后在-80℃貯存直至進行分析。氨基酸分析對60名患者的在前8天和0天(處理前和移植當天)的冷藏血漿樣品進行氨基酸分析。首先隨機選擇患者樣品進行試驗性研究；隨后特異富集分析樣品以包括額外的具有CPS-I的SNPAA基因型的患者(如下所示)及額外的具有BMT后HVOD和ALI并發(fā)癥的患者。無蛋白質(zhì)的血漿提取物通過用磺基水楊酸進行蛋白質(zhì)沉淀及通過0.45μmAcrodisc4(GelmanSciences，AnnArbor，Michigan)過濾而制備。氨基酸通過陽離子交換層析分離，使用4-成分pH-和離子強度-梯度的檸檬酸鋰緩沖系統(tǒng)在Beckmann7300氨基酸分析儀(Beckmann，PaloAlto，California)上進行。與茚三酮的氨基酸柱后衍生化可以在570nm檢測伯胺及在440nm檢測仲胺氨基酸。通過標準參考物質(zhì)的設備標準進行量化(Sigma，St.Louis，Missouri)。瓜氨酸、精氨酸和鳥氨酸作為尿素循環(huán)中間體的流量的可測定指數(shù)。血漿一氧化氮代謝物(NOx)的測定在對樣品進行去蛋白質(zhì)及與鎘珠保溫以將硝酸鹽轉變?yōu)閬喯跛猁}之后，在患者小組中使用修改的Griess試劑測定血漿NOx。T1405N多態(tài)性的檢測CPSI的第36外顯子寡核苷酸引物(CGGAAGCCACATCAGACTGG(SEQIDNO15)和內(nèi)含子寡核苷酸引物(GGAGAGTGAAACTTGACAATCATC(SEQIDNO16))及聚合酶鏈式反應(PCR)可靠地擴增一個251bp的片段，該片段包括含有得自淡黃色層制品(buffycoatpreparation)或者尿液沉淀物的基因組DNA改變的區(qū)域。這種引物組合提供了可再生的擴增，使用PCRReady-to-Go珠(Pharmacia)進行，PCR循環(huán)條件如下35次循環(huán)55℃1分鐘退火，72℃1分鐘延伸，及94℃1分鐘變性。在經(jīng)甲酰胺處理后，將樣品在4℃在非變性MDETM凝膠(FMC，Rockland，Maine)中電泳4小時，然后用硝酸銀染色以檢測DNA片段。使用非變性凝膠電泳和直接序列分析，對17個個體確定基因型產(chǎn)生相同的結果。將患者分類為具有純合SNP基因型CC或AA，或者是雜合基因型(AC)。為對比，使用相同方法分析一群100名阿爾茨海默氏病患者以評估CPSISNP基因型的分布。統(tǒng)計學分析使用Student’sT-test或者Wilcoxon’sRankSumTest(如果數(shù)據(jù)非正態(tài)分布)比較在化療之前和之后的血漿氨基酸水平及患者組間的水平。通過使用P2分析計算所有組的等位基因頻率及搜索特別選擇的組中Hardy-Weinberg不均衡跡象，對比組間的CPSI基因型的分布。敏感性、特異性、推測值及相對危險估定從使用通過特異性臨床結果(例如HVOD、ALI和死亡)的存在與否而分開的患者組中特異的氨基酸數(shù)值構建的2*2列聯(lián)表(two-by-twocontingencytable)中產(chǎn)生。結果BMT-LIFE研究中登記了200名患者。52％的患者經(jīng)歷自體移植(平均年齡46±1歲)；48％的患者接受同種異體移植(平均年齡40±1歲)。經(jīng)歷同種異體移植的患者中24％接受HLA匹配的不相關供體的移植物。自體移植組中接近2/3的患者是女性，反映出這個群體中乳腺癌流行增加。移植跡象是多樣的，但79％的患者是由于乳腺癌、白血病或者非何杰金氏淋巴瘤而進行移植。在BMT之前使用的不同準備方案包括CTC(環(huán)磷酰胺、三胺硫磷、碳鉑)、BuCy(白消安、環(huán)磷酰胺)、CVP16TBI(環(huán)磷酰胺、表鬼臼毒素吡喃葡糖苷、整體放射)、CBVP16(環(huán)磷酰胺、亞硝脲氮芥、表鬼臼毒素吡喃葡糖苷)和TC(三胺硫磷、環(huán)磷酰胺)。在BMT后，發(fā)病率和死亡率均非同尋常。這項研究中全部60天死亡率為14％，接受同種異體移植的患者中是20％。并發(fā)癥急性肺損傷(ALI)和肝靜脈梗阻癥(HVOD)均在19％的患者中發(fā)生。這些并發(fā)癥是接受同種異體移植的患者中發(fā)生的2倍以上。在發(fā)生HVOD的患者組中，62％(24/38)的患者在住院期間也符合ALI標準。出現(xiàn)ALI的患者中只有38％(14/38)從未符合HVOD標準。對具有CPS-IAASNP基因型的額外患者及具有移植后并發(fā)癥的額外患者在選擇樣品期間特別聚集的一小組患者(60/200)，在施用化療之前及在移植當天確定血漿氨基酸。參與UC(瓜氨酸、鳥氨酸和精氨酸)的選擇的氨基酸水平的對比在化療之前和之后表明顯著差異。瓜氨酸水平在所有患者中均降低，平均從23.4±1.3μM降至9.1±0.7μM(P＜0.05)。精氨酸水平提高大約35％(P＜0.05)，鳥氨酸水平提高21％(P＜0.05)。鳥氨酸/瓜氨酸的比率(O/C比率)、UC早期步驟的流量指數(shù)(即較低數(shù)值表示較好的循環(huán)流量)從研究登記時的3.9±0.7提高至誘導化療后的11.8±1.8(P＜0.05)。也在不是UC的一部分的氨基酸中發(fā)生轉變。甘氨酸和丙氨酸這兩種脂肪族氨基酸分別顯著降低11％和19％，這與僅僅是由于蛋白質(zhì)攝取(急性或慢性)減少而導致的循環(huán)中間體流量降低是不一致的。苯丙氨酸和甲硫氨酸水平分別提高43％和23％，提示亞臨床肝功能損傷。瓜氨酸的基線血漿水平和O/C比率具有預后重要性。BMT的60天存活者與未存活者相比具有較高的瓜氨酸基線水平(24.4±1.3對17.7±2.9μM，P＜0.05)。登記時瓜氨酸水平低于20的患者在BMT后60天之前死亡的相對危險性為2.92。血漿瓜氨酸水平高于20μM的死亡陰性預測值為90％。在登記時O/C比率顯著較低的患者當與隨后產(chǎn)生這些并發(fā)癥的患者(分別為5.8±1.9和6.5±2.7，P＜0.05)相比時，從不發(fā)生HVOD(2.8±0.2)或者ALI(2.9±0.2)。對比在研究登記時BMT的60天存活者和非存活者之間的O/C比率示出存活者中數(shù)值較低的傾向(3.3±0.2對6.9±3.9；P＝0.06)?；€O/C比率低于2.5的BMT后60天中死亡的陰性預測值為92％。一些尿素循環(huán)氨基酸中間體水平在準備治療后、在BMT當天也有重要性。血漿精氨酸水平在存活者(114.5±5.9μM)中高于未存活者(92.3±10.4μM)(P＜0.05)。在與從未發(fā)生嚴重肺功能障礙的那些患者相比較晚發(fā)生ALI(18.4±5.9對9.5±0.7；P＜0.05)的患者中，O/C比率顯著較高，提示更受損的UCF。盡管化療后O/C比率低于10產(chǎn)生ALI的陰性預測值高(86％)，但是與這個閾值相關的死亡率的相對危險僅為1.44。在隨后產(chǎn)生HVOD的患者中，在BMT當天患者的O/C比率傾向于更高(P＝0.09)。在62名患者中測定血漿中一氧化氮代謝物(NOx)的水平。血漿NOx水平在誘導治療后降低20％，從研究登記時的40±2μM至BMT當天的32±2μM(P＜0.05)。在產(chǎn)生HVOD或ALI的20名患者中在BMT當天NOx中位數(shù)為28μM；沒有這種并發(fā)癥的患者的血漿NOx為35μM。當對比不同CPSISNP基因型的患者時，血漿NOx之間無明顯差異。為了評定某些患者在進行誘導治療和BMT后是否具有產(chǎn)生疾病并發(fā)癥的遺傳傾向，對研究的所有患者均針對CPSISNP確定基因型。在200名患者中，分析了196名患者(即2名患者臨床排除，2名患者未成功PCR擴增)的數(shù)據(jù)，以確定CPS-IC4340ASNP是否在HVOD產(chǎn)生的Hardy-Weinberg平衡中。CPSISNP基因型在經(jīng)歷BMT的患者中的分布與對照組(患有阿爾茨海默氏病的100名患者)相同44％CC(野生型)、45％AC(雜合的)及11％AA(純合顛換)。具有CC或者AC基因型的那些患者中HVOD的發(fā)生率分別為18％和24％。在具有AA基因型的患者中無HVOD情況。發(fā)現(xiàn)這種等位基因分布不在HVOD發(fā)生的Hardy-Weinburg平衡中(P2＝5.06，P＜0.05)，提示SNPAA基因型改變了在誘導化療后對于肝毒性的易感性。在SNP基因型之間在BMT后60天死亡率也趨于不同。AC和CC基因型組分別有15％和20％的未存活者。令人感興趣地，所有AA基因型患者在BMT后60天均存活(P2＝3.36；P＝0.06)。注意，幾乎所有P2分值均來自AA/存活者細胞。具有不同SNPC4340A基因型的患者中在ALI發(fā)生率方面無顯著差異(在AA、AC和CC組中分別為16％、15％和25％)。盡管在AC或者CC基因型患者中，ALI與顯著死亡率相關(分別為71％和66％)，但所有產(chǎn)生ALI的AA基因型患者的CXR上的雙側肺侵潤和削弱的氣體交換最終均緩解，及在BMT后存活60天。討論這個實施例中的數(shù)據(jù)反映了BMT后患者中HVOD和ALI之間的密切關聯(lián)，接近2/3的HVOD患者符合ALI標準。在這項研究中，68％(26/38)的產(chǎn)生ALI的患者需要機械性換氣。Rubenfelt和Crawford已經(jīng)報道了有意義的存活，闡述了拔管后出院存活30天，只有6％的患者在BMT后需要機械性換氣。見Rubenfeld，G.D.andCrawford，S.W.，AnnalsofInternalMedicine(1996)125625-33所述。HVOD是逐步增加劑量化療的主要劑量限制毒性。其臨床特征在于在BMT后3周內(nèi)發(fā)生的體液滯留、黃疸、腹水和疼痛性肝腫大。對那些未存活的患者進行尸檢研究證實這些臨床標準，在＞80％的情況中提供了組織學確認，并且與增強的局部血栓形成也許是HVOD發(fā)病機理的始發(fā)事件的觀點一致。經(jīng)歷BMT的患者中瓜氨酸水平顯著降低及血漿鳥氨酸水平升高，這一點提示在誘導化療后的患者中經(jīng)過肝UC的碳中間體的流量存在明顯紊亂。對其它氨基酸模式進行分析論證了這種作用不單純是由于蛋白質(zhì)攝取降低所致。與在饑餓患者中觀測到的甘氨酸和支鏈氨基酸(BCAA)水平通常明顯升高的模式相反，我們觀測到甘氨酸降低，BCAA水平無顯著變化。另外，饑餓趨于增加肝臟中CPSI活性，不應引起血漿鳥氨酸增加。經(jīng)歷BMT的患者治療前保持UC中間體流的能力對預后具有特別重要的意義。在BMT后60天未存活者及那些產(chǎn)生HVOD或者ALI的患者與未產(chǎn)生這些并發(fā)癥的患者相比具有顯著較低水平的瓜氨酸及較高的O/C比率。令人感興趣的是觀測到在誘導治療后，與存活患者相比，BMT的未存活者具有較低水平的血漿精氨酸。根據(jù)末端肝小靜脈附近含有早期UC酶的細胞簇，精氨酸和一氧化氮(NO)的局部濃度可以更高并且在保持這些血管開放和調(diào)節(jié)區(qū)域性肝血流中起重要作用。示出在誘導化療后血漿NOx水平顯著降低的研究支持了在BMT期間NO產(chǎn)生被改變的觀點。在移植當天精氨酸的明顯正常血漿水平與明顯降低的血漿NOx之間的明顯差異強調(diào)了精氨酸和瓜氨酸流經(jīng)不同器官床(organbed)的體內(nèi)動力學的復雜性。對整體精氨酸穩(wěn)態(tài)的穩(wěn)定同位素研究表明僅大約15％的血漿精氨酸轉換與尿素形成相關，僅1.2％的血漿精氨酸轉換與NO形成相關。另外，體外研究論證了尿素循環(huán)中間體從瓜氨酸至精氨酸的實際流通，其不受外源提供底物的影響。在誘導化療刺激期間各個患者保持尿素循環(huán)功能及肝NO產(chǎn)生的能力可部分影響其對BMT后并發(fā)癥的抗性。由于在HVOD的發(fā)生中無性別差異，我們專注于常染色體編碼基因，CPSI相關的潛在藥物遺傳學問題，而不是X-連鎖的鳥氨酸轉氨甲酰酶基因。當鑒別導致新生兒和晚期發(fā)作的CPSI缺陷的分子學改變時，鑒別了CPSImRNA(0.44雜合性)的3’末端附近的一個共有SNP。這個C4340A顛換編碼在第1405位氨基酸一個預定的天冬酰胺(AAC)取代蘇氨酸(ACC)(T1405N)。這個蘇氨酸在變構結構域中，在結合增加酶活性的輔因子n-乙酰-谷氨酸(NAG)中是重要的序列PV(A/S)WP(T/S)(A/Q)E之前。盡管申請人不希望受到任何特定運行理論的約束，基于其它異生素作用的先例，推測在逐步提高劑量的化療之后NAG有限的可利用性是促進尿素循環(huán)功能失調(diào)的機制之一。雖然如此，看起來CPS-ISNPAA基因型的存在與針對HVOD產(chǎn)生的保護作用相關，解決了如果發(fā)生ALI的問題，并且改良了在BMT后60天存活力。因此，數(shù)據(jù)提示UC功能的改變在敗血癥和急性肺損傷期間修飾肝-肺相互作用中起作用。概括而言，這個實施例論證了在BMT之前接受逐步增高劑量的化療的患者中肝UC功能明顯損害。循環(huán)功能更嚴重擾亂的患者在BMT后更可能產(chǎn)生疾病并發(fā)癥。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了CPS-IC4340ASNP與BMT后并發(fā)癥和短期存活力之間的明顯關聯(lián)。這種數(shù)據(jù)用于評估患者進行BMT的危險性，并提供了一種試圖在高劑量化療期間支持UC功能的治療的基本原理。實施例3精氨酸/瓜氨酸補充治療得自多態(tài)性的尿素循環(huán)產(chǎn)物(精氨酸和瓜氨酸)減少及前體(氨、谷氨酰胺等等)增加有助于BMT相關毒性。作為BMTLife研究的一部分，在經(jīng)歷BMT的10名患者中測定瓜氨酸和精氨酸水平。用于BMT中的高劑量化療破壞了尿素循環(huán)酶的正常功能，并且導致HVOD發(fā)生或者與之相關的毒性。為了進一步評價這種信息，對經(jīng)歷BMT的10名患者在治療之前和完成誘導化療之后的貯存的血漿進行分析。從所有樣品中確定氨基酸圖譜(profile)。特別注意尿素循環(huán)中間體瓜氨酸、精氨酸和鳥氨酸。如表4所示，所有患者的瓜氨酸水平均從處理前的基線平均值24±3μmol/L明顯降低至治療后平均值8±1μmol./L(P＜0.001)。血漿精氨酸水平從平均值91±6μmol./L降低至70±6μmol./L(P＜0.05)，盡管在一些患者中使用了含有精氨酸的胃腸外營養(yǎng)物表4氨基酸化療前.化療后P值瓜氨酸24±3μM8±1μM＜0.001精氨酸91±6μM70±6μM0.03瓜氨酸和精氨酸的降低在接受和未接受全部胃腸外營養(yǎng)物的患者中是相似的，在男性和女性中是相同的。瓜氨酸的降低提示尿素循環(huán)第一個步驟的流量降低(圖1)。因此，本發(fā)明提供了一種降低經(jīng)歷BMT的患者中HVOD毒性和/或發(fā)生的方法。這種方法包括給BMT患者施用有效量的精氨酸和/或瓜氨酸，在一些實施方案中施用瓜氨酸，以支持患者中精氨酸和NO合成。支持患者中精氨酸和NO合成降低和/或基本上預防與BMT相關的HVOD的發(fā)生。瓜氨酸是更容易轉變?yōu)镹O的一種示例性補充劑。實施例4功能性全長CPSI表達克隆的構建在嘗試許多策略后，構建了含有完整編碼區(qū)的人CPSIcDNA表達克隆。圖6和7示出用于構建所述表達克隆的示意圖。這個克隆已經(jīng)被完全測序，不含有本領域已經(jīng)鑒別的共有CPSI序列的任何改變。在COS-7細胞中測試所述克隆產(chǎn)生CPSI蛋白質(zhì)的能力。選擇沒有天然CPSI活性或者產(chǎn)生的COS-7細胞。對用flCPSI-PCDNA3.1構建體轉染的COS-7細胞進行Western印跡分析。HepG2細胞提取物用作對照，因為這些衍生自肝臟的細胞保留CPSI活性。未轉染的COS-7細胞用作陰性對照。與未轉染的COS-7細胞不同，使用兔抗大鼠CPSI抗體證實了HepG2和COS-7-flCPSI細胞具有預期的160kD條帶。另外，進行比色分析以檢測從氨中氨甲酰磷酸鹽的產(chǎn)生。如圖8所示，表明轉染的細胞具有與HepG2細胞相似的活性，而未轉染的COS-7細胞則沒有。對含有CPSI插入體的T1405進行定點誘變，產(chǎn)生具有N1405多態(tài)性密碼子的拷貝。對N1405多態(tài)性密碼子全長測序，未檢測到其它改變。QUIKCHANGETM(Stratagene)系統(tǒng)利用通過宿主細菌在DNA中導入甲基化，使用該系統(tǒng)制備這個構建體。這些構建體用于穩(wěn)定提供這兩種等位基因(T1405，N1405)編碼的重組CPSI蛋白質(zhì)，使用COS細胞和各自的CPSI/PCDNA3.1構建體作為表達系統(tǒng)。使用這個系統(tǒng)產(chǎn)生酶活性的CPSI，如圖8所示。這些實驗用于確定T1405N多態(tài)性對于CPSI功能的體外作用。如實施例1和2所述，這種改變影響酶對于NAG濃度的敏感性。對20個個體針對C-A變化進行篩選示出50％的雜合性及組25％是純合AA。這提示大部分一般群體在CPSI功能方面具有潛在性質(zhì)異常性。這種異常性在正常條件下沉默，通過應激條件和毒素如高劑量化療或者施用丙戊酸而揭示。然后分階段進行蛋白質(zhì)產(chǎn)物對比。第一階段檢驗表達的mRNA和蛋白質(zhì)的物理特性。使用flCPSI插入體作為探針，對從表達的COS-7細胞系中制備的信息進行Northern印跡探查。陽性對照包括HepG2和人肝臟信息。陰性對照使用空白盒pcDNA3.1轉染的COS-7細胞。表達的flCPSI衍生的信息有時小于天然CPSI(4.9kb對5.7kb)，因為該克隆不含有1kb的3’未翻譯區(qū)。使用相同對照，通過SDS-PAGE對細胞裂解物進行Western印跡分析。使用考馬斯藍染色以檢測全部的蛋白質(zhì)產(chǎn)生。對于特異性CPSI檢測，使用多克隆兔抗大鼠CPSI抗體。這個抗體檢測從COS-7細胞以及對照樣本中表達的CPSI。最后，蛋白質(zhì)結構中的變化通過2-D電泳檢測遷移率模式而確定，所述2-D電泳是檢測構象變化的一種有用工具。構象中任何大的變化可以解釋由于突變而改變的CPSI功能。下一階段包括測定表達的酶的功能特征。為此對一種敏感性比色分析進行修改(Pierson，D.L.，J.Biochem.Biophys.Methods，331-37(1980))。經(jīng)修改的分析方法可以分析來自20-50mg組織或細胞的4-5種分析物。首先將組織在0.75MKCl中均質(zhì)化。通過SEPHADEXTMG25柱(Boehringer)除去小分子，包括ATP和NAG。所述反應混合物含有碳酸氫銨、ATP、鎂DTT、n-乙酰谷氨酸(NAG)和三乙醇胺。任何試劑的濃度均可以變化，對HepG2細胞進行的實驗示出低和高濃度的NAG(0.50mM)均降低活性。初步的COS-7細胞表達實驗中沒有NAG不產(chǎn)生可測量的酶活性。由于CPSI是一種變構酶，因此其在變化的NAG濃度下不符合米-曼動力學；然而當NAG的量是固定的，則氨甲酰磷酸鹽的產(chǎn)生是穩(wěn)定的。如圖8所示，氨甲酰磷酸鹽的產(chǎn)生通過向溶液中加入羥胺在37℃保溫不同時間(0、5、10、20、25、30分鐘)后測定。這個步驟在95℃進行，也可以使所述酶失活及防止氨甲酰磷酸鹽的進一步產(chǎn)生。羥胺將氨甲酰磷酸鹽轉變?yōu)榱u基脲，隨后用具有丁二酮的硫酸/乙酸溶液處理以產(chǎn)生在458nm具有峰吸收的化合物。然后將反應在12,000×g離心15分鐘以除去沉淀的蛋白質(zhì)。接下來，測定每個反應的458nm吸收。在反應20-30分鐘后，活性典型開始降低。集合許多表達細胞沉淀以進行分析。為保證活性測定基于一致量的酶，將表達的CPSI通過對集合樣本進行Western印跡分析而量化，使用CPSI抗體如上述兔抗大鼠CPSI抗體。首先使用固定量的底物和輔因子及時程分析測定基本活性。然后使用不同量的碳酸氫銨、ATP和NAG確定這些元件的結合效力。這些元件在正常量的0-10倍之間變化。在對勻漿進行熱處理后也測定酶活性。進行蛋白質(zhì)標記(脈沖追蹤)實驗以確定蛋白質(zhì)隨時間的穩(wěn)定性。使用上述方法獲得穩(wěn)定的CPSI蛋白質(zhì)表達。穩(wěn)定轉染的細胞系的確立可以產(chǎn)生足夠量的兩種CPSI變體以進行這些研究。在活性研究中，注意到與T1405類型CPSI相比較的N1405活性中的改變。也注意到不同濃度的NAG下酶活性的改變。這些結果支持了本發(fā)明揭示的多態(tài)性在預測對于亞最佳尿素循環(huán)功能和與之相關的高氨血癥的易感性及降低的精氨酸產(chǎn)生中的作用。實施例5T1405N多態(tài)性和尿素循環(huán)中間體與在丙戊酸治療的患者中觀測到的氨增高之間的關系丙戊酸(VPA)是一種常用的癲癇藥物，特別用于治療癲癇小發(fā)作或者作為其它癲癇疾病的輔助治療。VPA治療的毒性是一種復雜的多變量過程，可能反映出一些代謝破壞。高血氨癥和肝微泡脂肪變性(hepaticmicro-vesicularsteatosis)和壞死是最常報道的嚴重并發(fā)癥。盡管毒性高血氨癥的產(chǎn)生僅涉及少數(shù)患者，但是其導致顯著的發(fā)病率和死亡率，一些死亡規(guī)因于這種并發(fā)癥。然而，相對常見的是無癥狀高氨血癥(血漿氨水平高于60μmol/L)產(chǎn)生在施用VPA后1小時內(nèi)。VPA誘導的高氨血癥的機制VPA導致高氨血癥的機制有一些爭論，在本領域中有許多不同的理論。腎臟模型提出谷氨酰胺代謝的變化導致肝臟荷載的氨增加，而大多數(shù)理論專注于尿素循環(huán)功能的不同方面。見例如Warteretal.，RevueNeurologique，139753-757(1983)所述。由于尿素循環(huán)是除去人體中氨的主要機制，因此認為高血氨癥是由于VPA和/或其代謝物與尿素循環(huán)功能和能力的抑制性相互作用而產(chǎn)生的。VPA治療中尿素循環(huán)功能失調(diào)的跡象來自于除了上述血漿氨升高之外的許多實驗和臨床觀測。例如Marrini等測定了未進行腎切除手術的動物在給予氨基酸和VPA后基礎的和經(jīng)刺激的CPSI活性均降低(Marrinietal.，Neurology38365-371(1988))。Marrini等還觀測到為進行腎切除手術的大鼠注射氨基酸和VPA也產(chǎn)生高血氨癥。另一研究小組Castro-Gago等測定了用VPA治療的22名癲癇兒童中血清氨基酸水平，發(fā)現(xiàn)天冬氨酸和鳥氨酸降低，提示尿素循環(huán)效力降低而不是前體增加(Castro-Gagoetal.，ChildsNeuronsSystem6434-436(1990))。氨甲酰磷酸合成酶I的意義VPA誘導的尿素循環(huán)缺陷的機制典型以線粒體氨甲酰磷酸合成酶I(CPSI)為中心。發(fā)現(xiàn)過量服用VPA而具有嚴重毒性的患者具有50％正常CPSI活性(Bourrieretal.，PreseMedicale172063-2066(1988))。本申請人已經(jīng)觀測到一些輕微CPSI缺陷患者當給予丙戊酸時惡化，當停止給予后迅速逆轉。NAG的作用N-乙酰谷氨酸(NAG)是CPSI必需的一種變構輔因子。NAGA在線粒體中從谷氨酸和乙酰CoA合成，細胞分布反映了CPSI的分布(Shigesadaetal.，JournalofBiologicalChemistry2465588-5595(1971))。其從谷氨酸(氨基酸分解代謝)和乙酰CoA合成。有一些其中NAG可利用度改變降低CPSI活性的方式。已經(jīng)觀測到NAG合成酶中的遺傳缺陷，已知這種酶被另外的底物如丙酰CoA或者琥珀酸鹽競爭性抑制(Bachmannetal.，NewEnglandJournalofMedicine304543(1981)；Kamounetal.，Lancet48(1987)；Coudeetal.，J.Clin.Invest.641544-1551(1979)；Rabieretal.，Biochem.AndBiophys.ResearchCormm.91456-460(1979)；Rabieretal.，Biochimie68639-647(1986))。通過實驗示出CPSI通過存在增加量的丙酰CoA而被競爭性抑制，VPA治療導致血液丙酸鹽濃度提高(Coulteretal.，Lancet1(8181)1310-1311(1980)；Gruskayetal.，Ped.Res.15475(1981)；Schmidt，R.D.，Clin.Chim.Acta.7439-42(1977))。已經(jīng)示出VPA暴露通過降低乙酰CoA和谷氨酰胺濃度而降低完整肝細胞中NAG濃度(Coudeetal.，Biochem.J.216233-236(1983))。谷氨酰胺濃度的降低的原因在于丙酮酸脫氫酶和丙酮酸羧化酶的抑制?；蛘?，已經(jīng)有提示在VPA治療中由于CoA被轉向產(chǎn)生valproylCoA而出現(xiàn)線粒體乙酰CoA的損耗(Beckeretal.，ArchivesofBiochemistry&Biophysics223381-392(1983))。本領域熟知由于乙酰CoA的減少而引起VPA也破壞脂肪酸β-氧化(Eadieetal.，Med.Toxicol.385-106(1998))。所有這些機制均可導致NAG不足，因為其是從乙酰CoA中合成的。鑒于VPA對NAG可利用度的作用，CPSI對于NAG的結合性質(zhì)中的任何改變均影響其活性。因此，這個實施例闡述了確定CPSI基因中本發(fā)明的多態(tài)性存在與否與對于高氨血癥的易感性之間關系的實驗，使用VPA作為模型制劑以產(chǎn)生高氨血癥。首先，從開始丙戊酸治療的患者中分離基因組DNA，根據(jù)本發(fā)明所述方法對T1405N多態(tài)性確定基因型，如通過PCR擴增和使用非變性凝膠。在對這些患者確定基因型之后，對這些患者進行治療前和治療后氨基酸和氨水平確定。特別地，使用實施例1所述的QIAmpTM(Qiagen)試劑盒從全血中分離DNA。接著，通過酶介導的免疫吸附技術(EMITTMSyva-Behring，SanJose，California，Syva30RTM分析儀)確定血漿總VPA濃度。這種技術利用競爭性結合患者血漿中VPA及與酶G6PDH復合的VPA之間VPA抗體結合位點。VPA酶復合物從抗體中的釋放使所述酶恢復活性，其活性通過在加入底物的基礎上NADH的形成速度而評定。通過在340nm通過分光術監(jiān)測NADH產(chǎn)生。使用離心微間隔過濾設備(centrifugalmicropartitionfilterdevice)從血漿中分離游離(未結合蛋白質(zhì)的)VPA，截斷值為3000道爾頓(CENTRIFREE，Amicon，Beverley，Massachusetts)。如對于總VPA所述測定血漿超濾物中VPA濃度。對從VPA患者中收集的數(shù)據(jù)分析基因型與表型之間的關系。另外，比較游離的和綴合的VPA級分以評價對NAG產(chǎn)生和可利用度的作用。后者的比較提供了VPA對于NAG可利用度的已知作用。例如，已經(jīng)示出VPA暴露通過降低乙酰CoA和谷氨酰胺的濃度而降低完整肝細胞中NAG濃度。見Coudeetal.，Biochem.J.，216233-236(1983)所述。因此，這種比較反映了CPSI對于NAG的結合性質(zhì)中的變化影響CPSI的活性。實施例6CPSI中另外的多態(tài)性的檢測使用針對CPSI信息突變分析產(chǎn)生的技術，對10名非CPSI缺陷的不相關患者篩選編碼區(qū)中另外的多態(tài)性。這是使用來自類淋巴母細胞和成纖維細胞系的“不正常的”轉錄物進行的。對于群體具有普遍作用的多態(tài)性在這個大小的樣本中應該是明顯的。如本文和權利要求書中所用，術語“多態(tài)性”是指群體中發(fā)生兩或多個經(jīng)遺傳學確定的可選擇的序列或等位基因。多態(tài)性標記是出現(xiàn)趨異的基因座。標記的例子如具有至少兩個等位基因，每個出現(xiàn)頻率均高于1％。多態(tài)性基因座可小至只有一個堿基對。因此多態(tài)性標記包括限制片段長度多態(tài)性、可變數(shù)目的串聯(lián)重復(VNTR′s)、高可變區(qū)、小衛(wèi)星、二核苷酸重復和四核苷酸重復。已經(jīng)進行了許多“突變”檢測技術，所有這些技術均基于非變性單鏈DNA的遷移率中可檢測的改變，如Summar，M.，J.InheritedMetabolicDisease2130-39(1998)所述。通過這些技術鑒別的CPSI突變實例在圖3中揭示。由于CPSI信息較大(大約5,700個堿基)，可以應用一種在一些反應中篩選大量DNA的方法。限制性核酸內(nèi)切酶指紋法(REF)可以篩選大DNA片段，直至大約2000bp，具有極佳的靈敏性。使用1μg總RNA和寡-dT引物或者來自CPSI信息中點的反義引物進行逆轉錄酶反應(RT)。使用RT產(chǎn)物作為模板進行PCR反應，使用4種不同的引物組產(chǎn)生跨越4600堿基編碼區(qū)的4個重疊片段。對每個實驗組進行對照PCR反應，以保證污染模板未被擴增。因為基因的大小(80000+bp)、內(nèi)含子數(shù)目(36)及對CPSI內(nèi)含子外顯子邊界的測序還未完善，這項研究非優(yōu)選基因組DNA。然而，內(nèi)含子位置在圖9中繪圖表示。上述4個重疊RT/PCR產(chǎn)物用于突變篩選。認真分析限制圖可以針對每個片段選擇3種限制酶，將其切割為100-250bp的片段。這個大小的片段對于單鏈構象多態(tài)性(SSCP)分析是理想的。選擇酶，由此每個片段均可以均勻長度被評價。消化前，將PCR產(chǎn)物通過凝膠電泳純化并從瓊脂糖玻片中分離。在3小時后，將消化的片段乙醇沉淀。將這些片段在6％非變性聚丙烯酰胺凝膠中在4℃在恒定35瓦特運行分離。這些條件可以最大程度檢測單鏈片段中的構象變化，如Liu，Q.andSommer，S.S.，Biotechniques18(3)470-477(1995)所述。通過銀染進行DNA檢測及對凝膠遷移率變化賦分?；谌魏我苿悠蔚奈恢?，使用循環(huán)測序方案對RT/PCR產(chǎn)物進行直接序列分析。為了消除得自Taq聚合酶誤差的突變的可能性，擴增新鮮的RT產(chǎn)物并在每種情況中測序。以這種方式迅速篩選全部4600個堿基的編碼信息。對含有不清楚區(qū)域的任何區(qū)域均進行測序，尋找期望序列中的變化。分離每個RT/PCR片段的限制消化產(chǎn)物。然后將這些片段在如上述非變性凝膠中針對組合消化運行。通過以這種方式鑒定片段模式，易于鑒別參與任何觀測到的遷移率改變的CPSI信息部分。在這些實驗中檢測到的多態(tài)性針對Centred′EtudePolymorphsimHumanise(CEPH)親代組(panel)確定基因型以確定頻率。檢測所有變化對密碼子使用的作用及使用本文揭示的CPSI鑒定數(shù)據(jù)檢測導致錯義突變的那些變化。使用實施例3中描述的技術表達含有這些變化的定點突變體。使用這個系統(tǒng)觀測所述變化對于CPSI產(chǎn)生和活性的體外作用。在CPSI中檢測到T344A多態(tài)性。使用來自第10外顯子的寡核苷酸引物(U1119tactgctcagaatcatggc-SEQIDNO17)和來自內(nèi)含子的引物(LI10+37tcatcaccaactgaacagg-SEQIDNO18)擴增含有所述變化的一個91bp的片段。PCR循環(huán)條件如下35次循環(huán)在59℃退火1分鐘，在72℃延伸1分鐘，及在94℃變性1分鐘。將患者分類為具有純合SNP基因型AA或TT，或者是雜合基因型(AT)。這種多態(tài)性在成人群體中的分布為35％AA，44％AT和21％TT。在CPSI中還檢測到118-CTT多態(tài)性。使用來自5′未翻譯區(qū)的寡核苷酸引物(U5′-74ggttaagagaaggaggagctg-SEQIDNO19)和來自內(nèi)含子的引物(L175aaccagtcttcagtgtcctca-SEQIDNO20)擴增含有所述變化的一個249bp的片段。PCR循環(huán)條件如下35次循環(huán)在59℃退火1分鐘，在72℃延伸1分鐘，及在94℃變性1分鐘。將患者分類為在第118位具有三核苷酸插入或者缺失的純合基因型，或者是雜合的。這種多態(tài)性在成人群體中的分布是34％CTT-，43％雜合及23％CTT+。實施例7在具有持續(xù)性肺動脈高壓的新生兒患者中氨甲酰磷酸合成酶I中的生物化學和遺傳學改變這個實施例研究了在新生兒持續(xù)性肺動脈高壓(PPHN)發(fā)病機制中限制內(nèi)源NO產(chǎn)生的作用。內(nèi)源NO是尿素循環(huán)中間體精氨酸的產(chǎn)物。精氨酸的產(chǎn)生依賴于尿素循環(huán)的限速酶，氨甲酰磷酸合成酶(CPSI)。新生兒具有低于一半的正常尿素循環(huán)功能，使其對酶形式和功能中的微小變化特別易感。在CPSI中已經(jīng)觀測到一種普遍的外顯子多態(tài)性(T1405N)，其影響尿素循環(huán)第一個步驟的流量。在這個實施例中，測試了產(chǎn)生PPHN的新生兒與匹配對照相比是否具有較低的NO前體(精氨酸和瓜氨酸)。還分析了PPHN患者是否主要具有CC(蘇氨酸/蘇氨酸)或者AC(天冬酰胺/蘇氨酸)CPSI基因型，這種基因型與AA(天冬酰胺/天冬酰胺)CPSI基因型相比具有較低的功能。方法登記在VanderbiltNeonatalIntensiveCareUnit有(n＝22)和無(n＝25)經(jīng)超聲心動描記術證明肺動脈高壓的40名＞2kg、＞35周及＜72小時新生兒。記錄呼吸窘迫嚴重程度的臨床重要測量值。獲得氨水平和血漿氨基酸圖。通過在非變性MDETM凝膠上進行PCR擴增DNA確定基因型。結果產(chǎn)生PPHN的患者平均精氨酸水平為21.5μmol/l，而未產(chǎn)生PPHN的患者平均水平為38.3μmol/l(p＝0.0004)。瓜氨酸平均水平分別為6.1μmol/l和10.3μmol/l(p＝0.02)。精氨酸和瓜氨酸的水平與低氧血癥的嚴重程度成反比，這是通過氧合指數(shù)、機械性換氣天數(shù)及需要補充O2的天數(shù)而測定的。對PPHN患者對于T1405N的基因型分析示出5CC、17AC和0AA，而對照組具有7CC、16AC和2AA(卡方p＝0.005，使用期望的群體等位基因頻率)。具有CC基因型的嬰兒的精氨酸和瓜氨酸平均值(21.5μmol/l和5.8μmol/l)低于具有AA基因型的嬰兒(31.5μmol/l和13.5μmol/l)，與兩種形式酶之間的功能差異一致。結論這個實施例示出新生兒中發(fā)生PPHN與尿素循環(huán)中間體精氨酸和瓜氨酸的不充分可用利度相關。CPSIDNA中T1405N多態(tài)性導致酶功能被降低及隨后降低NO前體的水平。討論氨甲酰磷酸合成酶(CPSI)催化尿素循環(huán)中限速步驟，從而決定了尿素循環(huán)中間體包括精氨酸和瓜氨酸的組織水平。如本文所揭示，CPSI基因中廣泛分布的C-A外顯子多態(tài)性將鄰近關鍵的N-乙酰谷氨酸結合結構域的第1405位保守的蘇氨酸轉變?yōu)樘於０?。?shù)據(jù)表明含有天冬酰胺形式的CPSI在酶功能研究中顯示更有效的動力學。T1405N等位基因呈現(xiàn)50％的雜合性，并且看起來在正常健康成人中是沉默變體。然而，性質(zhì)改變的結果可以通過應激條件而揭示。如實施例1-3所述，在預備骨髓移植時成人暴露于高劑量化療的情況中，含有蘇氨酸的酶產(chǎn)生不足水平的精氨酸和瓜氨酸，并且與肝靜脈梗阻癥、急性肺損傷和死亡的增加相關。因為一氧化氮(NO)是在內(nèi)皮細胞中通過一氧化氮合成酶(NOS)從L-精氨酸產(chǎn)生的，因此尿素循環(huán)中間體水平降低可通過限制內(nèi)源NO產(chǎn)生而導致血管緊張度紊亂。在這個實施例的前瞻性群組研究中，研究了一種相似過程可參與新生兒持續(xù)性肺動脈高壓(PPHN)發(fā)病機制的可能性。內(nèi)源產(chǎn)生的NO在調(diào)節(jié)肺血管阻力和從胎兒轉變?yōu)樾律鷥貉貉h(huán)中起作用。Lipsitz，E.C.，etal.JPediatrSurg(1996)31137-140；Abman，S.H.，etal.AmJPhysiol(1990)259H1921-H1927。在妊娠20周和足月分娩之間，CPSI產(chǎn)生和功能低于50％成人水平。這種生理缺陷可以揭示T1405N基因突變的作用，特別是如果結合其它影響肝功能的新生兒應激例如窒息或者敗血癥則更明顯。符合這項研究條件的患者包括妊娠≥35周及出生體重≥2kg的適當生長的新生兒，其是VanderbiltUniversityMedicalCenter新生兒監(jiān)護室(NICU)在1999年7月1日至2000年2月29日之間收治的呼吸窘迫綜合征患者。除外具有多發(fā)性先天性異常、已知的遺傳綜合病癥及解剖學因素導致肺動脈高壓(先天性膈疝、Potter’s綜合征、窒息性胸腔營養(yǎng)不良等等)的嬰兒。對所有進行研究的患者均獲得其雙親同意。對51名新生兒在出生后最初的72小時抽取3cc血液繪制血漿氨基酸圖、確定氨和BUN水平、一氧化氮代謝物和確定CPSI基因型。在輸血、腸道或胃腸外蛋白質(zhì)攝取、給予吸入一氧化氮或者插入ECMO套管之前抽取血液。對研究組中登記的人員收集的數(shù)據(jù)包括(1)基本特征(出生體重、孕齡、性別、種族、Apgar得分、初步診斷、任何肺部并發(fā)癥、及在抽取血液時的出生后年齡)及(2)測定呼吸支持(FiO2，MAP，iNO，ECMO)和臨床反應(ABGs，機械通氣和補充O2的持續(xù)時間，存活)。最大氧合指數(shù)[OI＝FiO2×MAP/PaO2]用作呼吸窘迫嚴重程度的測量指標。主要的初步診斷包括(1)出生窒息，5分鐘Apgar得分＜5，第一次ABG或者臍帶血氣分析呈現(xiàn)混合的酸中毒或者神經(jīng)功能失調(diào)及其它終末器官損傷，(2)呼吸窘迫綜合征(RDS)，呼吸窘迫臨床癥狀及胸部X光毛玻璃肺部區(qū)域和空氣支氣管相加上ABG上合并高碳酸血癥/低氧血癥(注意考慮到這些新生兒的妊娠年齡，具有這一照片的嬰兒可能患有表面活性劑缺陷或先天性肺炎；然而，在任一情況下均沒有獲得氣管抽吸物的陽性培養(yǎng)物)，及(3)胎糞吸入綜合征(MAS)，分娩時有胎糞沾染史加上呼吸窘迫臨床癥狀、低氧血癥和粗大浸潤胸部X-光。如果嬰兒產(chǎn)生明顯的低氧血癥(100％O2＞6小時基礎上PaO2＜100)且其心臟解剖學是正常的，而具有肺動脈壓增高的超聲心動圖表現(xiàn)，則認為其具有肺動脈高壓(PPHN)。后者的定義為(1)從右至左或者卵圓孔雙向導管血液流動或者(2)基于不知情的第三者讀取的三尖瓣反流的Doppler評估增高的(＞35mmHg)肺動脈壓。對47名患者的新鮮血漿樣本進行氨基酸分析。無蛋白質(zhì)的血漿提取物通過用磺基水楊酸沉淀蛋白質(zhì)并通過0.45μmAcrodisc4(GelmanSciences，AnnArbor，Michigan)過濾而制備。氨基酸通過陽離子交換層析而分離，使用4-成分pH-和離子強度-梯度檸檬酸鋰緩沖系統(tǒng)在Beckmann7300氨基酸分析儀(Beckmann，PaloAlto，California)上進行。與茚三酮的氨基酸柱后衍生化可以在570nm檢測伯胺氨基酸，在440nm檢測仲胺氨基酸。通過具有標準參考物質(zhì)(Sigma，St.Louis，Missouri)的設備標準進行量化。瓜氨酸和精氨酸作為尿素循環(huán)中間體流量的測定指數(shù)進行檢測。血漿一氧化氮代謝物(NOx)的測定在將樣本除去蛋白質(zhì)并與鎘珠保溫以將硝酸鹽轉變?yōu)閬喯跛猁}之后，在一亞組患者中使用修飾的Griess試劑測定血漿NOx。SNP檢測來自CPSI的36th外顯子寡核苷酸引物(U4295-SEQIDNO15)和內(nèi)含子寡核苷酸引物(LI36-SEQIDNO16)及聚合酶鏈反應(PCR)可靠地擴增包含含有得自全血制品基因組DNA中變化的區(qū)域的一個251bp的片段。這種引物組合提供了可再生的擴增，使用Taq聚合酶(Promega)，PCR循環(huán)條件如下35次循環(huán)，在67℃退火1分鐘，在72℃延伸1分鐘，在94℃變性1分鐘。在經(jīng)甲酰胺處理后，將樣本在4℃在非變性MDETM凝膠(FMC，Rockland，Maine)中電泳5小時，然后用硝酸銀染色以檢測DNA片段。將患者分類為具有純合SNP基因型CC或者AA，或者是雜合基因型(AC)。使用非變性凝膠電泳和直接序列分析確定基因型產(chǎn)生與上述那些相同的結果。因此，確定T1405N多態(tài)性在成人群體中的分布是45％CC，44％AC，及11％AA。使用與上述相同的技術檢測T344A多態(tài)性。使用來自10th外顯子的寡核苷酸引物(U1119tactgctcagaatcatggc-SEQIDNO17)和內(nèi)含子的寡核苷酸引物(LI10+37tcatcaccaactgaacagg-SEQIDNO18)擴增含有所述變化的一個91bp片段。PCR循環(huán)條件是35次循環(huán)，在59℃退火1分鐘，在72℃延伸1分鐘及在94℃變性1分鐘。將患者分類為具有純合SNP基因型AA或者TT，或者是雜合基因型(AT)。這個多態(tài)性在成人群體中的分布是35％AA，44％AT和21％TT。使用與上述相同的技術檢測118-CTT多態(tài)性。使用來自5’未翻譯區(qū)的寡核苷酸引物(U5′-74ggttaagagaaggaggagctg-SEQIDNO19)和內(nèi)含子的寡核苷酸引物(L175aaccagtcttcagtgtcctca-SEQIDNO20)擴增含有所述變化的一個249bp片段。PCR循環(huán)條件是35次循環(huán)，在59℃退火1分鐘，在72℃延伸1分鐘，在94℃變性1分鐘。將患者分類為在第118位具有三核苷酸插入或者缺失的純合基因型，或者是雜合的。這種多態(tài)性在成人群體中的分布是34％CTT-，43％雜合的及23％CTT+。使用Student’sT-test對比患者群間的氨和血漿氨基酸水平。比較組間CPSI的基因型分布，通過計算全部群的等位基因頻率及使用卡方分析在特別選擇的亞組中搜索Hardy-Weinberg不平衡跡象。在51名最初登記的新生兒中，有25名產(chǎn)生PPHN，26名未產(chǎn)生。這兩組的基本特征無統(tǒng)計學顯著差異，包括產(chǎn)生體重、孕齡、種族或者在登記時嬰兒的出生后年齡。然而，對照組中男性略占優(yōu)勢。初步診斷的分布是均勻的。在PPHN組中，5名嬰兒具有出生窒息，9名嬰兒具有RDS，5名嬰兒具有胎糞吸入綜合征，6名嬰兒具有其它診斷，包括4名嬰兒具有原發(fā)PPHN。在對照組中，4名嬰兒具有出生窒息，8名嬰兒具有RDS，3名嬰兒具有MAS，11名嬰兒具有其它診斷。其它診斷包括室上性心動過速、貧血、產(chǎn)傷及病毒性敗血癥。研究中沒有嬰兒具有細菌血液培養(yǎng)陽性。正如所期望的，具有PPHN的嬰兒使其原來的病理學更加復雜，與對照組相比在一些臨床標準方面產(chǎn)生更嚴重的疾病。8名具有PPHN的嬰兒需要吸入NO(iNO)治療，2名需要ECMO，2名死亡(一名嬰兒在iNO上窒息及多系統(tǒng)衰竭；另一名肺泡毛細管發(fā)育異常的嬰兒取消ECMO)。顯然，對照組無一用iNO或者ECMO治療；對照組中無死亡率。PPHN組中有三名嬰兒從分析中除外。在肺組織活檢發(fā)現(xiàn)具有肺泡毛細管發(fā)育異常的嬰兒被認為具有肺動脈高壓的解剖學病因。另一名嬰兒錯誤地登記具有先天性膈疝，第三名嬰兒在已經(jīng)開始TPN之后119小時年齡登記。對照組中有一名嬰兒在核型分析后從分析中除外，核型分析表明其張力過低的病因是Prader-Willi綜合征。對產(chǎn)生PPHN的嬰兒進行氨基酸分析示出具有其明顯較低的血清精氨酸和瓜氨酸水平。在PPHN情況中平均精氨酸水平為21.5±9.2μmol/l，而對照組的平均精氨酸水平為38.3±18.4μmol/l(p＝0.0004)。在PPHN情況中平均瓜氨酸水平為6.1±3.6μmol/l，在對照組中為10.3±7μmol/l(p＝0.02)。這兩個組的其它氨基酸水平無明顯差異，包括谷氨酰胺、甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸、纈氨酸、鳥氨酸和亮氨酸。全部必需氨基酸(TEAA)的水平在PPHN情況中略低，為大約537μmol/l對大約654μmol/l，但這個差異無統(tǒng)計學意義(p＝0.08)。通過出生體重、孕齡或者出生后小時數(shù)。發(fā)現(xiàn)TEAA的水平在其血液是在出生后6小時之前抽取的4名嬰兒中明顯較高(大約1021.5μmol/l對大約542μmol/l，p＝0.0026)。推測這種差異反映了這些嬰兒中通過胎盤循環(huán)而來的胃腸外蛋白質(zhì)注入的近期停止。當單獨分析窒息、RDS、MAS、及其它診斷時，發(fā)現(xiàn)精氨酸和瓜氨酸水平無差異。每組中，具有肺動脈高壓的嬰兒趨于具有較低數(shù)值，但是每組中少數(shù)嬰兒提供的結果無統(tǒng)計學意義。例如，具有PPHN的窒息嬰兒的平均精氨酸為大約18.5μmol/l，窒息對照組為大約52.7μmol/l(p＝0.06)，平均瓜氨酸水平為大約6.8μmol/l，對照組為大約14.3μmol/l(p＝0.04)。血清精氨酸和瓜氨酸的水平與低氧血癥的嚴重程度成反比。精氨酸和瓜氨酸值隨著氧合指數(shù)的提高、機械性換氣天數(shù)增加、需要補充氧以增加出生體重的天數(shù)、孕齡、或者出生后小時數(shù)而逐漸降低。具有PPHN的嬰兒中NH3水平趨于略高于對照組(54±18.1μmol/l對45.6±12μmol/l)，但這些數(shù)值無統(tǒng)計學意義(p＝0.08)。在CPS1T1405N基因型分析中，發(fā)生PPHN的22名嬰兒中有5名是CC，17名是AC。在PPHN情況中無AA。在25名對照嬰兒中，有7名是CC，16名AC，2名AA。然后比較基因型的這些分布，通過計算全部群的預期等位基因頻率而進行，表明PPHN組中的Hardy-Weinberg不均衡跡象。在卡方分析中，這兩組彼此顯著不同，p值＝0.005。在具有AA基因型的兩名嬰兒中，一名具有RDS，另一名經(jīng)歷了出生窒息。無一嬰兒達到OI≥15；使用呼吸機＜1周及＜10天供氧。具有CC基因型的嬰兒平均精氨酸水平為21.9±7μmol/l，瓜氨酸水平為5.8±1.8μmol/l，而具有AA基因型的嬰兒平均精氨酸水平為31.5±3.5μmol/l，平均瓜氨酸水平為13.5±6.4μmol/l。再次，有少數(shù)AA提供的這個數(shù)據(jù)難以達到統(tǒng)計學意義，p值分別為0.1和0.006。實施例8在仔豬中靜脈內(nèi)瓜氨酸補充提高血漿精氨酸水平在臨床模型中未預先使用靜脈內(nèi)瓜氨酸。這個實施例在仔豬中評估了IV瓜氨酸的安全性及其對血清精氨酸水平的作用?？偣灿?只Duroc豬，年齡為5-21天，最小體重為4kg。對所有仔豬均進行麻醉誘導和氣管造口術。中央管路置于股動脈和股靜脈中，持續(xù)監(jiān)測血流動力學。給5只仔豬施用瓜氨酸(600mg/kg，IV)。給予對照動物鹽水。在施用瓜氨酸之前及之后每小時抽取血清氨基酸。血清精氨酸水平在IV施用瓜氨酸之后1-2小時達到峰值，隨后在基礎水平之上持續(xù)保持3小時，在所有時間點于對照組比較均達到統(tǒng)計學意義(p＜0.001)。未觀測到血流動力學不穩(wěn)定。IV瓜氨酸之后的精氨酸水平(μmol/L)IV瓜氨酸后的平均動脈血壓(mmHg)在所有時間點p＞0.05藥動學基于上述數(shù)據(jù)，在IV一劑瓜氨酸之后針對血漿瓜氨酸和精氨酸水平計算藥動學。藥動學數(shù)據(jù)包括血漿半衰期(t)，清除常數(shù)(Kel)，分布體積(Vd)，和血漿清除率(CLp)。血漿瓜氨酸水平迅速增加，表明t＝1.5小時，Kel＝0.462/小時，Vd＝2.25L，CLp＝1.05L/小時。然而，感興趣的是瓜氨酸對血漿精氨酸的作用，因為其是NO合成酶的底物。血漿精氨酸水平的濃度曲線示于圖13。基于這個曲線，血漿精氨酸的藥動學如下t＝18小時；Kel＝0.039/小時；Vd＝2.85L；CLp＝0.11L/小時。較長的半衰期和較低的清除率表明IV單一劑量的瓜氨酸即可有效保持血漿精氨酸提高相當長的時間，而對血流動力學無不利作用。實施例9在先天性心臟病手術中口服補充瓜氨酸這個實施例是關于評定補充瓜氨酸是否提高血清瓜氨酸水平，通過內(nèi)源NO出生而降低術后肺動脈高壓的風險。更特別地，這個實施例關于確定圍術期間口服補充瓜氨酸是否提高血清瓜氨酸水平，導致通過尿素循環(huán)產(chǎn)生更多的一氧化氮，從而降低術后肺動脈高壓的風險。進行隨機安慰劑對照雙盲研究。經(jīng)歷手術修復其先天性心臟病及處于發(fā)生術后肺動脈高壓危險中的40名嬰兒/兒童接受口服瓜氨酸或者安慰劑。在術前、術后即刻施用5劑量的瓜氨酸或者安慰劑(1.9g/m2/劑)，之后每12小時給予一次共三劑量。在5個時間點測定血清瓜氨酸的初步終點。獲得全身血壓、血清精氨酸和一氧化氮代謝物、CPSI基因型、及肺動脈高壓存在與否的二級測定結果。成功登記40名患者，隨機分成相等的兩組(20人/組)，給予瓜氨酸或者安慰劑。在48小時研究期間，在瓜氨酸和安慰劑組之間重復測定平均血壓無差異(P＝0.53)。在術后即刻(36umol/LIQR28-48umol/L對26umol/LIQR24-35umol/L，P＝0.012)及12小時后(37umol/LIQR18-83umol/L對20umol/LIQR15-29umol/L，P＝0.015)，瓜氨酸中位數(shù)水平在谷氨酸組中與安慰劑組比較明顯較高。在安慰劑組中，術后階段瓜氨酸水平明顯降低(P＝0.001)，而補充瓜氨酸后則明顯升高(P＝0.014)。平均血清精氨酸水平在術后12小時在瓜氨酸組中明顯較高(36umol/L+/-24umol/L對23umol/L+/-13umol/L，P＝0.037)。精氨酸水平在安慰劑組中在術后階段明顯降低(P＜0.001)，而補充瓜氨酸后水平保持在基礎水平(P＝0.533)。9名患者產(chǎn)生術后肺動脈高壓(6名安慰劑，3名瓜氨酸)，其血清瓜氨酸水平均低于補充瓜氨酸獲得的中位數(shù)水平(37umol/L)(P＝0.036)。具有肺動脈高壓的患者無一具有CPSI多態(tài)性的AA基因型(P＝0.743)。耐受瓜氨酸施用的患者無明顯副作用跡象。在心肺轉流術后口服補充瓜氨酸明顯提高血清瓜氨酸和精氨酸。高于正常的血清瓜氨酸水平與降低術后肺動脈高壓風險相關。方法患者登記在這項隨機對照雙盲研究中登記40名患者。所有嬰兒或兒童均小于6歲，經(jīng)歷6種手術方法之一以修復其先天性心臟缺損。合適的手術方法包括1)針對左心發(fā)育不全綜合征(HLHS)或者異型HLHS的NorwoodI方法，2)雙向Glenn，3)修改的Fontan方法，4)房室隔缺損(AVSD)修補，5)室間隔缺損(VSD)修補，或者6)動脈轉接方法。除外的標準包括1)明顯的肺動脈狹窄不能進行手術，2)先前置放肺動脈支架，3)先前肺動脈血管成形術，4)明顯的左側AV瓣膜反流，5)肺靜脈回流異常，或者6)肺靜脈狹窄。在心胸外科門診(門診病人)或者VanderbiltChildren’sHospital(住院病人)手術評估期間從登記的患者雙親獲得書面同意。VanderbiltChildren’sHospital的3名心臟外科醫(yī)生之一使用相同的心肺分流術和心臟麻痹準備進行手術。肺動脈高壓定義為平均肺壓力為至少體循環(huán)平均血壓，高于25mmHg。直接肺動脈血壓測量得自在經(jīng)過雙向Glenn或者修改的Fontan方法處理后患者上腔靜脈中央管路，或者得自所有患者(除了經(jīng)歷I期Norwood方法處理的患者)經(jīng)胸廓肺動脈導管。中央管路由心臟麻醉專家放置，肺部管路直接由心胸外科醫(yī)生放置。除了直接測量之外，在具有兩心室解剖的所有患者中肺動脈壓還可以通過超聲心動描記術而評估。在回聲上證實存在肺動脈高壓的跡象包括1)明顯的三尖瓣反流，2)擴大或肥大的右心室而無肺血管狹窄的跡象，和/或3)心室內(nèi)隔膜扁平。所有超聲心動描記術均由VanderbiltChildren’sHospital的小兒科心臟病專家解釋。所有醫(yī)生(外科醫(yī)生、心臟病專家、進修人員和PI)、調(diào)查護士、PCCU護理人員和患者對隨機方案和治療任務均不知情。臨床數(shù)據(jù)和患者特性在了解研究結果之前得自病歷。不利事件施用瓜氨酸在理論上具有體循環(huán)血壓過低的危險。在48小時研究期間監(jiān)測體循環(huán)血壓。不利事件定義為平均血壓與基礎水平相比下降25％以上。根據(jù)癥狀用補充血容量和/或收縮性/血管加壓劑治療患者。除非患者血壓過低而對干預無反應，否則不用從研究中排除該患者。研究方案將40名患者在進行手術之前即刻隨機化為接受安慰劑或者瓜氨酸。通過VanderbiltHospitalClinicalPharmacy的InvestigationalDrugService進行隨機化，使用計算機產(chǎn)生的隨機號碼，根據(jù)先前產(chǎn)生的4個隨機交換模塊。患者登記為意向治療(ITT)模型。施用使用蒸餾水作為懸浮劑的100mg/ml(10％)溶液的瓜氨酸。由InvestigationalDrugService將藥物與安慰劑混合及分布。瓜氨酸和安慰劑的體積和顏色相稱。瓜氨酸施用劑量為每12小時5劑量1.9g/m2，每日劑量為3.8g/m2，總劑量為9.5g/m2。這個劑量通過目前施用給尿素循環(huán)缺陷的嬰兒/兒童的瓜氨酸替代治療而確定，與施用給正在進行臨床實驗的處于產(chǎn)生急性肺損傷危險中的成人骨髓移植患者的劑量相同(VanderbiltUniversityMedicalCenter，BrianChristmanMD)。第一次劑量的安慰劑/瓜氨酸是通過由調(diào)查護士或者醫(yī)生放置的口胃飼管(orogastricfeedingtube)施用的，隨后進行麻醉及在手術室中插管。第二次劑量是在到達PediatricCriticalCareUnit(PCCU)立即給予的。第三、四和第五次劑量是分別在PCCU中手術后12小時、24小時和36小時施用的。手術后劑量是通過由PCCU中病房護士放置的鼻飼管(nasogastricfeedingtube)經(jīng)腸道給予，或者一旦患者拔管則經(jīng)口服給予。樣品收集從每個患者在5個時間點獲得3ml血液在手術前及手術后即刻，手術后12小時，24小時和48小時。手術前血樣在麻醉誘導和放置動脈或者中央靜脈導管后，但在手術切開之前收集。手術后即刻血樣在達到兒科重癥監(jiān)護室(PCCU)時收集，隨后的樣本分別在達到PCCU之后各自的時間收集。將樣本收集在含有檸檬酸鹽的試管中，置于冰上并在4℃貯存直至進行處理。在收集3小時內(nèi)將樣本離心以分離血漿和細胞成分。血漿樣本在-70℃冷凍直至進行進一步實驗室分析。確定結果數(shù)據(jù)的關鍵因素是中央靜脈(CVL)或者動脈管路(AL)的可達性。向登記患者的雙親保證血樣得自手術必需的管路，一旦中央血管路徑不再是醫(yī)療必需的，則不額外抽取血液。一旦難以獲得結果變量的測定，則不再繼續(xù)施用研究藥物。實驗室測定血清瓜氨酸、精氨酸及所有其它氨基酸的濃度通過對無蛋白質(zhì)提取物進行氨基酸分析而確定。氨基酸通過陽離子交換層析分離，使用7300氨基酸分析儀(Beckmann，PaloAlto，California，UnitedStatesofAmerica)進行。在測試患者樣本之前完成分析儀的標度。一氧化氮代謝物濃度通過非酶比色分析進行分析(OxfordBiomedicalResearch，Oxford，Michigan，UnitedStatesofAmerica)。血漿樣本首先用硫酸鋅溶液除去蛋白質(zhì)。然后通過與鎘珠保溫而將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。在離心后，向上清中相繼加入Griess試劑磺胺和N-(1-萘基)乙二胺(14)。然后測定每個樣本在540nm的吸收，一氧化氮代謝物濃度利用稀釋的亞硝酸鈉標準曲線作為對照確定。如上文所述針對T1405N多態(tài)性確定CPSI基因型。通過將手術前經(jīng)檸檬酸鹽化的血樣在1000g離心5分鐘分離淡黃色表層，然后在-70℃貯存。利用基因組DNA分離試劑盒從全血細胞中提取DNA(PromegaCorp，Madison，Wisconsin，UnitedStatesofAmerica)。然后使用如上文所述T1405N引物對分離的DNA樣本進行PCR擴增。將PCR產(chǎn)物通過突變檢測增強(MDE)電泳加以分類，利用MDE異源雙鏈體試劑盒(ATBiochem，Malvern，Pennsylvania，UnitedStatesofAmerica)。利用這種方法可以與對照精確比較觀測到單一堿基取代。統(tǒng)計學分析先前報道了嬰兒和兒童在心肺轉流術后12小時平均瓜氨酸水平為20.7+/-13.0umol/L。40名患者的樣本大小具有87％的power(1-β)檢測到瓜氨酸(20人)和安慰劑(20人)組之間13umol/L(1SD)的差異，使用雙側顯著性及α＝0.05。{樣本大小使用PSpower和樣本大小程序計算(DupontWDandPlummerWDPSpowerandsamplesizeprogramavailableforfreeontheInternet.ControlledClinTrials，1997；18274；Version2.1.30)。由在48小時研究期間平均血壓的多次連續(xù)測量結果說明的藥物安全性，通過多元ANCOVA確定。持續(xù)的結果變量，氨基酸水平和一氧化氮代謝物水平以對于非正態(tài)分布的四分位數(shù)間距(IQR)中位數(shù)或者在合適時以平均值+/-SD表示。使用Mann-WhitneyU檢驗比較組間的持續(xù)變量以說明無關數(shù)值，另外使用Student’sT-test。成對持續(xù)值分析使用Wilcoxonsigned-rank檢驗進行。隨機化的成功及肺動脈高壓的存在與否的分歧結果以百分比報導，并使用Fisher’s精確檢驗確定。所有分析都是雙側的，p值＜0.05時認為具有統(tǒng)計學意義。使用統(tǒng)計學軟件STATA(version6.0，STATACorporation，CollegeStation，Texas)和SPSS(Copyright2004，SPSSInc.)進行數(shù)據(jù)分析，由CenterforHumanGeneticsResearch的JeffCanter，MD領導。結果患者登記順利登記40名患者并隨機為接受瓜氨酸(n＝20)或安慰劑(n＝20)。隨機化達到瓜氨酸和安慰劑組之間在基礎水平無明顯差異(表1)。研究人群(n＝40)的年齡中位數(shù)是8.5月(IQR4-29mo)，55％男性，90％是高加索人。外科手術干預包括NorwoodstageI(8％)，BDG或者Fontan(53％)，VSD或者AVSD修復(25％)和動脈轉接修復(15％)。在研究組中CPSI基因型對于T1405N多態(tài)性的分布(5AA(12.5％)23AC(57.5％)12CC(30％))與普通群體所期望的相似。安全性在瓜氨酸組和安慰劑組中平均血壓無差異(P＝0.530)(圖14)。盡管在48小時研究期間無死亡發(fā)生，但是3名患者在手術修復30天內(nèi)死于術后并發(fā)癥，瓜氨酸和安慰劑組無顯著差異(2對1，P＝0.487)。發(fā)現(xiàn)所有死亡與施用研究藥物不相關。隨機接受瓜氨酸的一名患者在手術后立即排除，因為其具有明顯的手術并發(fā)癥，需要通過體外膜氧合(ECMO)并送回OR以在48小時研究期間進一步修復。保持意向治療。該患者屬于瓜氨酸組，具有數(shù)據(jù)分析中的手術前測量結果，然而由于沒有患者數(shù)據(jù)而不能進行手術后結果分析。血清瓜氨酸接受口服瓜氨酸的患者當與安慰劑組比較時，在手術后即刻(36umol/LIQR28-48umol/L對26umol/LIQR24-35umol/L，P＝0.012)和手術后12小時(37umol/LIQR18-83umol/L對20umol/LIQR15-29umol/L，P＝0.015)的血清瓜氨酸中位數(shù)水平顯著較高(圖15)。安慰劑組中血清瓜氨酸水平在手術后即刻和手術后12小時均顯著從基礎水平下降(32umol/LIQR25-44umol/L對26umol/LIQR24-35umol/L及20umol/LIQR15-29umol/L，P值分別為P＝0.020，P＜0.001)。然而，在手術后即刻補充瓜氨酸則血清瓜氨酸水平從基礎水平顯著升高，并在手術后12小時保持升高水平(29umol/LIQR25-34umol/L對36umol/LIQR28-48umol/L及37umol/LIQR18-83umol/L，P值分別為P＝0.014及P＝0.184)。手術后12小時外的測量結果通過錯過數(shù)據(jù)點而不明確。手術后24小時，9名患者恢復并移至普通兒科病房。精氨酸和一氧化氮代謝物在手術后12小時，接受口服瓜氨酸患者的平均血清精氨酸水平顯著高于接受安慰劑的患者(36+/-24umol/L對23+/-13umol/L，P＝0.037)(圖16)。在手術后12小時，安慰劑組的血清精氨酸水平從基礎水平顯著下降(38umol/LIQR30-52umol/L對34umol/LIQR15-45umol/L及22umol/LIQR13-33umol/L，P值分別為P＝0.077和P＜0.001)。然而，瓜氨酸組的血清精氨酸水平不從基礎水平明顯下降(33umol/LIQR25-54umol/L對33umol/LIQR22-41umol/L及30umol/LIQR15-56umol/L，P值分別為P＝0.533和P＝0.533)。在手術后即刻(42umol/LIQR27-72對40umol/LIQR27-55umol/L，P＝0.430)或者手術后12小時(45umol/LIQR28-81對43umol/LIQR20-68umol/L，P＝0.518)，一氧化氮代謝物的濃度在瓜氨酸和安慰劑組之間無差異。在手術后期間給5名患者施用吸入的一氧化氮，所有患者在手術后即刻均出現(xiàn)不飽和狀態(tài)和血壓過低。5名患者中有3名通過直接肺壓力測定而確定具有肺動脈高壓。5名患者有2名(1fontan，1Norwood)進行iNO實驗。經(jīng)歷fontan手術程序的患者在手術后立即探查兩次以緩解嚴重的血胸和心包壓塞，之后返回OR以進行穿孔擴大。在由于心肌抑制導致多次嘗試失敗后，給經(jīng)歷Norwood手術程序的患者進行iNO，以試圖在OR中使其自分流術中蘇醒。所有患者均在手術后12小時內(nèi)經(jīng)方案斷掉iNO。肺動脈高壓9名患者產(chǎn)生術后肺動脈高壓，安慰劑組有6名(67％)，治療組有3名(33％)(P＝0.451)。所有具有肺動脈高壓的患者的血清瓜氨酸水平均低于先前報道的6歲以下兒童瓜氨酸濃度標準(30umol/LIQR23-37umol/L)，并且低于由補充瓜氨酸而獲得的中位數(shù)濃度(37umol/L，P＝0.036)。具有肺動脈高壓的患者對于T1405N多態(tài)性不具有預期的CPSI基因型分布，0AA(0％)6AC(67％)3CC(33％)，但是由于具有肺動脈高壓的患者數(shù)量少而不是顯著的(P＝0.743)。隨著瓜氨酸的施用，防止了NO前體中這一顯著下降。已表明安慰劑組在分流術后繼續(xù)顯示明顯的瓜氨酸和精氨酸濃度降低。相反，在接受口服瓜氨酸的患者中，瓜氨酸濃度顯著升高并保持術前精氨酸濃度。如果采用內(nèi)源性NO產(chǎn)生來預防肺動脈高壓，則逆轉心肺轉流術對NO前體濃度的效應的能力是不相干的。產(chǎn)生手術后肺動脈高壓的患者的瓜氨酸濃度低于預期的標準值，并且低于補充瓜氨酸獲得的中位數(shù)濃度37umol/L。肺動脈高壓的產(chǎn)生依賴于通過補充瓜氨酸或者通過其它誘導因素(遺傳、手術、環(huán)境)而獲得的血清瓜氨酸濃度。總之，安慰劑組中20名患者中有18名患者(90％)的瓜氨酸水平低于37umol/L，治療組中20名患者中有9名患者如此(47％)。在瓜氨酸水平低的那些患者中，27名患者中有9名患者(33％)產(chǎn)生肺動脈高壓。具有肺動脈高壓的患者當與研究組手術后即刻相比較時具有最低水平的瓜氨酸(P＝0.03)。因此，影響瓜氨酸吸收或者內(nèi)源NO產(chǎn)生的因素增加產(chǎn)生肺動脈高壓的危險。特殊基因中的多態(tài)性可以在保留NO前體可利用度中起作用。一種這樣的酶，氨甲酰磷酸合成酶I，是尿素循環(huán)限速酶，并因此決定瓜氨酸和精氨酸的產(chǎn)生。尿素循環(huán)功能失調(diào)與新生兒持續(xù)性肺動脈高壓(PPHN)和上述嬰幼兒/兒童分流術后肺動脈高壓相關。CPSI的T1405N多態(tài)性與PPHN新生兒及先天性心臟病分流術后患者中較低的精氨酸和一氧化氮水平明顯相關。這種多態(tài)性的AA基因型在產(chǎn)生肺動脈高壓的這兩種兒科疾病患者群中未被充分代表。我們再次示出在這項研究中在產(chǎn)生肺動脈高壓的9名患者中無AA基因型。結論患者耐受瓜氨酸施用而無明顯副作用。與接受安慰劑的患者中NO前體顯著降低相比較，口服瓜氨酸補充劑顯著增加瓜氨酸濃度及保持手術前精氨酸濃度。通過施用瓜氨酸或者誘導因素(predisposedfactors)而保持血清瓜氨酸濃度高于正常水平的患者，不發(fā)生手術后肺動脈高壓。表1.瓜氨酸和安慰劑組特征的比較表2.當血清瓜氨酸升高時肺動脈高壓風險低參考文獻如下列出的參考文獻以及說明書中引用的參考文獻在此均并入作參考，提供了本發(fā)明應用的背景或教導方法學，技術和/或組合物。Abman，S.H.，etal.，AmJPhysiol(1990)259H1921-H1927.Adelmanetal.，DNA2183(1983).Alonso，E.andRubio，V.，EuropeanJournalofBiochemistry229377-384(1995).Artymiuk，P.J.etal.，NatureStruct.Biol.3128-132(1996).Bachmannetal.，NewEnglandJournalofMedicine304543(1981).BatshawML，BrusilowSW.AnnalsofNeurology1982；11319-21.BearmanSI，JournalofClinicalOncology1993；111729-36.Beaucageetal.，TetrahedronLetters221859-1862(1981).BeaumierL，Biomedical&EnvironmentalSciences1996；9296-315.Beckeretal.，ArchivesofBiochemistry&Biophysics223381-392(1983).BernardGR，ArtigasA，BrighamKL，etal.IntensiveCareMedicine1994；20225-32.BlauN，Duran，M.，andBlaskovics，M.E.Physician′sGuidetotheLaboratoryDiagnosisofMetabolicDiseasesLondonChapman&HallMedical，1996.Bourrieretal.，PreseMedicale172063-2066(1988).Castillo，L.，etal.，PediatrRes(1995)3817-24.CastilloL，etal.，JournalofBiologicalChemistry1989；2644038-44.Castro-Gagoetal.，ChildNeuroSystems6434-436(1990).Cervera，J.etal.，Biochemistry357247-7255(1996).CohenPP.CurrentTopicsinCellularRegulation1981；181-19.Coudeetal.，Biochem.J.216233-236(1983).Coudeetal.，J.Clin.Invest.641544-1551(1979).Coulteretal.，Lancet1(8181)1310-1311(1980).Creaetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA755765(1978).Daviesetal.，BoneMarrowTransplantation171119-1125(1996).deGroot，C.J.，etal.，Biochemical&BiophysicalResearchCommunications124882-888(1984).Eadieetal.，Med.Toxicol.385-106(1998).Eichenlaubetal.，J.Bacteriol.138559-566(1979).Faber-LangendoenK，etal.BoneMarrowTransplantation(1993)1212501-7.Gribskovetal.，Nucl.Acids.Res.146745(1986).Gr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0><221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>XisAorQ<400>23ProValXaaTrpProXaaXaaGlu1權利要求1.一種治療或預防對象中亞最佳的尿素循環(huán)功能所致一氧化氮形成降低的方法，所述方法包括給需要的對象施用治療有效量的一氧化氮前體，從而治療或預防亞最佳的尿素循環(huán)功能所致的一氧化氮形成降低。2.權利要求1的方法，其中所述施用是靜脈內(nèi)或口服施用。3.權利要求1的方法，其中亞最佳的尿素循環(huán)功能還包括尿素循環(huán)中間體產(chǎn)生降低。4.權利要求1的方法，其中所述對象患有與尿素循環(huán)中間體產(chǎn)生降低相關的疾病，或者其中所述對象暴露于或者將暴露于與尿素循環(huán)中間體產(chǎn)生降低相關的環(huán)境刺激。5.權利要求4的方法，其中所述疾病選自肝炎、肝硬化、肺動脈高壓、壞死性小腸結腸炎(NEC)、急性呼吸窘迫綜合征、人種特異性內(nèi)皮細胞功能失調(diào)、勃起功能障礙、經(jīng)歷骨髓移植的對象中骨髓移植物毒性、敗血癥、哮喘及其組合。6.權利要求4的方法，其中所述環(huán)境刺激選自化療、心臟手術、增加的氧化應激、骨髓移植物、敗血癥性休克、急性哮喘發(fā)作、缺氧、肝毒素暴露及其組合。7.權利要求1的方法，其中所述一氧化氮前體選自瓜氨酸、精氨酸及其組合。8.權利要求1的方法，其中所述一氧化氮前體以大約100mg至大約30000mg的劑量施用。9.權利要求8的方法，其中所述一氧化氮前體以大約250mg至大約1000mg的劑量施用。10.權利要求1的方法，其中所述對象是人。11.一種治療或預防經(jīng)歷骨髓移植的對象中骨髓移植物毒性的方法，所述方法包括給對象靜脈內(nèi)或者口服施用治療有效量的一氧化氮前體，從而治療或預防對象中的骨髓移植物毒性。12.權利要求11的方法，其中所述施用是靜脈內(nèi)或者口服施用。13.權利要求11的方法，其中所述一氧化氮前體選自瓜氨酸、精氨酸及其組合。14.權利要求11的方法，其中所述一氧化氮前體以大約100mg至大約30000mg劑量施用。15.權利要求14的方法，其中所述一氧化氮前體以大約250mg至大約1000mg的劑量施用。16.權利要求11的方法，其中所述骨髓移植物毒性包括肝靜脈梗阻癥和/或急性肺損傷。17.權利要求11的方法，其中所述對象是人。18.一種治療或預防對象中肝炎、肝硬化、肺動脈高壓、壞死性小腸結腸炎(NEC)、急性呼吸窘迫綜合征、人種特異性內(nèi)皮細胞功能失調(diào)、勃起功能障礙、哮喘及其組合的疾病的方法，所述方法包括給對象施用治療有效量的一氧化氮前體。19.權利要求18的方法，其中所述施用是靜脈內(nèi)或者口服施用。20.權利要求18的方法，其中所述一氧化氮前體選自瓜氨酸、精氨酸及其組合。21.權利要求18的方法，其中所述一氧化氮前體是以大約100mg至大約30000mg的劑量施用。22.權利要求21的方法，其中所述一氧化氮前體是以大約250mg至大約1000mg的劑量施用。23.權利要求18的方法，其中所述對象是人。24.權利要求18的方法，其中所述疾病是壞死性小腸結腸炎(NEC)，及所述對象是早產(chǎn)兒。25.一種提高有需要的對象中硝酸前體水平的方法，所述方法包括給對象施用治療有效量的一氧化氮前體，從而提高對象中一氧化氮前體的水平。26.權利要求25的方法，其中所述施用是經(jīng)靜脈內(nèi)或者口服施用。27.權利要求25的方法，其中所述一氧化氮前體選自瓜氨酸，精氨酸及其組合。28.權利要求25的方法，其中一氧化氮前體以大約100mg至大約30000mg的劑量施用。29.權利要求28的方法，其中所述一氧化氮前體以大約250mg至大約1000mg的劑量施用。30.一種包含藥物可接受載體和治療有效量的一氧化氮前體的藥物組合物，其中所述藥物組合物適于靜脈內(nèi)或口服施用。31.權利要求30的藥物組合物，其中所述一氧化氮前體選自瓜氨酸、精氨酸及其組合。32.權利要求30的藥物組合物，其中所述一氧化氮前體以大約100mg至大約30000mg的劑量存在。33.權利要求32的藥物組合物，其中所述一氧化氮前體以大約250mg至大約1000mg的劑量施用。全文摘要本發(fā)明提供了使用分離的多核苷酸分子和這些分子編碼的肽分析人氨甲酰磷酸合成酶I表型，以及涉及人氨甲酰磷酸合成酶I多態(tài)性的診斷和治療性應用。通過分析基因組DNA或者擴增的基因組DNA或者衍生自mRNA的擴增的cDNA，可以定型關于人氨甲酰磷酸合成酶I多態(tài)性的人氨甲酰磷酸合成酶I，例如用于診斷和治療與骨髓移植相關的肝靜脈梗阻癥(HVOD)。文檔編號C12N9/00GK1946388SQ200580012693公開日2007年4月11日申請日期2005年2月24日優(yōu)先權日2004年2月24日發(fā)明者馬歇爾·L.·薩默,布賴恩·克里斯特曼,弗雷德里克·E.·巴爾申請人:范德比爾特大學