高靈敏食物過敏原檢測方法及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高靈敏食物過敏原檢測方法及其試劑盒。1)食物過敏原蛋白偶聯(lián)磁珠,所述的食物過敏原包括但不限于水產(chǎn)類、奶類、蛋類、肉類、谷物類、堅果類、水果類、蔬菜類、豆類食物過敏原蛋白;2)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線:梯度稀釋抗食物過敏原的IgG抗體標(biāo)準(zhǔn)品與食物過敏原蛋白偶聯(lián)磁珠進(jìn)行免疫反應(yīng),然后利用抗人IgG二抗進(jìn)行信號放大反應(yīng),根據(jù)平均吸光度值和相應(yīng)的濃度進(jìn)行線性回歸,構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線;3)篩查食物過敏原,利用食物過敏原蛋白偶聯(lián)磁珠與過敏患者的血清進(jìn)行免疫反應(yīng),然后利用抗人IgG二抗進(jìn)行信號放大反應(yīng),然后確定食物過敏原的種類及對應(yīng)的抗體的濃度。本發(fā)明靈敏度范圍不高于2pg/mL,可適用于轉(zhuǎn)基因食品的過敏原檢測。
【專利說明】高靈敏食物過敏原檢測方法及其試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及食物安全及過敏檢測領(lǐng)域,尤其涉及一種高靈敏食物過敏原檢測方法及其試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]過敏性疾病影響全世界近四分之一的人口,被世界衛(wèi)生組織列為21世紀(jì)重點防治的三大疾病之一。食物過敏醫(yī)學(xué)上也稱變態(tài)反應(yīng),是指機體受抗原(包括半抗原)刺激后,產(chǎn)生相應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞,當(dāng)再次接觸同一種抗原后在體內(nèi)引起體液或細(xì)胞免疫反應(yīng),由此導(dǎo)致組織損傷或機體生理機能障礙。它是一種復(fù)發(fā)率很高的疾病。據(jù)食品過敏或過敏性反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)統(tǒng)計,約有90%的過敏反應(yīng)是由花生、果仁、魚、貝類、雞蛋、牛奶、大豆、魚蝦、蘑菇和小麥等食物引起(以花生引起的過敏最為嚴(yán)重),10%的過敏是由170多種其他食物引起。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查,近年來過敏癥發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。據(jù)調(diào)查西方大概有20-25%的人受過過敏原的襲擾,我國大約有5-10%的人受過敏原的襲擾。上海、浙江、廣東等沿海地區(qū)收過敏原襲擾的人群已超過10%,隨著工業(yè)的快速發(fā)展,生活水平的提高,飲食的改善,受過敏原襲擾的人群每年以1.5%的速度增加。美國每年約有29T2.5%的人發(fā)生食物過敏,兒童及嬰幼兒的發(fā)病率約59T8%。據(jù)不完全統(tǒng)計,我國的發(fā)病率高于發(fā)達(dá)國家。目前,隨著科技進(jìn)步和經(jīng)濟的發(fā)展,產(chǎn)生了諸多新的食品資源,以及食品生產(chǎn)、流通、消費方式的改變,傳統(tǒng)的食物過敏的地域性打破,并且隨著轉(zhuǎn)基因作物的大量出現(xiàn),許多新的轉(zhuǎn)基因食品大量涌現(xiàn),也使得食物過敏更具備了潛在的危險性。食物過敏在相當(dāng)大的程度上危害著過敏人群的健康,保護(hù)消費者食品安全已經(jīng)成為食品安全管理部門及食品生產(chǎn)企業(yè)所面臨的重要問題。
[0003]許多人在直接或者間接接觸這些過敏原之后,會因過敏而患上支氣管哮喘、上呼吸道結(jié)膜炎、濕疹、皮炎等癥,有時甚至產(chǎn)生危及生命的過敏性休克。因此迫切需要從眾多食物中篩查出隱藏的過敏原,讓易敏者避開含有致敏成分的食物以及治療過敏反應(yīng),同時排除類似過敏癥狀慢性疾病的誤診。過敏患者由于攝入引發(fā)過敏反應(yīng)的食物過敏原蛋白后,體內(nèi)嗜堿粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞脫顆?;鹛禺愋缘腎gG沉淀抗體進(jìn)入血液,使血液中這種特異性IgG抗體水平提高。該特異性IgG抗體在體外能識別其對應(yīng)的抗原,即食物過敏原蛋白,并與之結(jié)合。
[0004]對于過敏原性的檢測,體內(nèi)實驗方法可提供最為直接的證據(jù),如雙盲食物激發(fā)試驗和皮膚針刺試驗,但由于安全因素等方面的考慮,只有在不得已的情況下在醫(yī)院進(jìn)行,而且費用昂貴、風(fēng)險大;與此相比體外實驗方法具有方便、安全的優(yōu)點,但卻存在著準(zhǔn)確性差的缺點。隨著科技的發(fā)展,未來食品過敏原檢測將向準(zhǔn)確、安全、經(jīng)濟、快速、高通量、高靈敏度的體外檢測技術(shù)方向發(fā)展。
[0005]食物過敏原診斷試劑的種類很多,影響試劑質(zhì)量的因素也很多,為保證試劑質(zhì)量需要盡可能的提高技術(shù)指標(biāo)。靈敏度作為一項重要的技術(shù)指標(biāo),對試劑盒的評價具有重要的意義。因為極少量的分析物可能對界定疾病狀態(tài)、疾病篩查有重要意義。在食物過敏原檢測中體內(nèi)產(chǎn)生的抗體是十分微量的,而市場上現(xiàn)有技術(shù)大多只能達(dá)到納克級,在檢測低于此濃度時就變得比較困難,而難以達(dá)到預(yù)期目的。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,本發(fā)明的目的是提供一種高靈敏食物過敏原檢測方法及其試劑盒。
[0007]一種高靈敏食物過敏原檢測方法,步驟如下:
1)食物過敏原蛋白偶聯(lián)磁珠,所述的食物過敏原包括但不限于水產(chǎn)類、奶類、蛋類、肉類、谷物類、堅果類、水果類、蔬菜類、豆類食物過敏原蛋白;
2)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線:梯度稀釋抗食物過敏原的IgG抗體標(biāo)準(zhǔn)品與食物過敏原蛋白偶聯(lián)磁珠進(jìn)行免疫反應(yīng),然后利用抗人IgG 二抗進(jìn)行信號放大反應(yīng),根據(jù)平均吸光度值和相應(yīng)的濃度進(jìn)行線性回歸,構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線;
3)篩查食物過敏原,利用食物過敏原蛋白偶聯(lián)磁珠與過敏患者的血清進(jìn)行免疫反應(yīng),然后利用抗人IgG 二抗進(jìn)行信號放大反應(yīng),然后根據(jù)得到的信號與步驟2)所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定食物過敏原的種類及對應(yīng)的抗體的濃度。
[0008]所述的信號放大反應(yīng)為顯色反應(yīng)。
[0009]所述的步驟3)中確定食物過敏原的種類的cut-off值設(shè)定為抗體濃度Ing/mL的值在標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)的吸光度值。
[0010]所述的步驟I)中,具體方法如下: 1.1)取一只5mL的離心管向其中分別加入3.84mL 50mM pH4.0的磷酸鹽緩沖液、ImL5%的磁珠、60uL 50mg/mL的EDAC溶液和IOOuL 100mg/mL的NHS溶液,把離心管置于搖床上,室溫條件下活化30min ;
1.2)將離心管置于磁力架上吸住磁珠,棄掉清液,并向離心管中加入5mL50mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液;重復(fù)洗滌3次,最后一次加入4.499 mL 50mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液;
1.3)再向其中加入5ug/mL的食物過敏原蛋白500uL,1%牛血清蛋白luL,把離心管置于搖床上,40 °C條件下反應(yīng)45min ;
1.4)重復(fù)1.2)的洗滌步驟;
1.5)加入4.9901^ 50mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液與IOuL 1%BSA溶液,4°C條件下封閉保
存待用。
[0011]所述的步驟3)中,具體方法如下:
3.1)取若干只2mL的離心管,分別加入300uL偶聯(lián)食物過敏原蛋白的磁珠,用磁力架吸住磁珠,棄掉清液,然后加入300uL pH7.4的磷酸鹽緩沖液,如此洗滌3次。最后吸干;
3.2)向洗滌后的磁珠中加入120uL,含20%甘油,梯度稀釋的抗體,室溫條件下孵育40min ;
3.3)孵育結(jié)束后,用磁力架吸住磁珠,棄掉清液,再加入300uL的PBS洗滌液,漩渦震蕩,再用磁力架吸住磁珠,如此洗滌5次,最后吸干液體;
3.4)向洗滌后的磁珠中加入100ng/mL的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗120uL,含20%甘油,室溫條件下孵育40min ;
3.5)重復(fù)步驟3.3); 3.6)向洗滌后的磁珠中加入IOOuL的TMB顯色液,避光反應(yīng)15min ;
3.7)避光反應(yīng)后,向其中加入IOOuL ImoL/L的鹽酸溶液,終止反應(yīng),并把液體轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)板上;
3.8)用酶標(biāo)儀讀取吸光度值;
3.9)結(jié)果計算。
[0012]所述的磁珠的表面具有羧基、氨基或者無基團(tuán),粒徑大小在100nnT3um。
[0013]食物過敏原檢測試劑盒,它包括但不限于已包被的水產(chǎn)類、奶類、蛋類、肉類、谷物類、堅果類、水果類、蔬菜類、豆類食物過敏原蛋白中的一種或多種的磁性納米微球、人IgG標(biāo)準(zhǔn)液、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗、TMB、樣品稀釋液、洗滌液和終止液,靈敏度范圍不高于2pg/mL。
[0014]所述的試劑盒,適用于轉(zhuǎn)基因食品的過敏原檢測。
[0015]本發(fā)明的有益效果:將磁珠作為固相載體,來代替ELISA檢測中的酶標(biāo)板微孔。此固相載體相比于普通ELISA的酶標(biāo)板微孔擁有更大的表面負(fù)載量,并且可以對目標(biāo)物質(zhì)具有更強的富集作用,通過外加磁場和洗滌的過程可以對目標(biāo)物起到一個濃縮的作用,最終提高食物過敏原檢測的靈敏度、準(zhǔn)確性和線性范圍。靈敏度范圍不高于2pg/mL,可適用于轉(zhuǎn)基因食品的過敏原檢測。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1是實施例四中試劑線性實驗的結(jié)果示意圖;
圖2是實施例試劑線性實驗的結(jié)果示意圖。
【具體實施方式】
[0017]以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
[0018]本發(fā)明的食物過敏原檢測試劑盒,其組成包括已包被的水產(chǎn)類、奶類、蛋類、肉類、谷物類、堅果類、水果類、蔬菜類、豆類食物過敏原蛋白的磁性納米微球,人IgG標(biāo)準(zhǔn)液、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗,TMB,樣品稀釋液,洗滌液和終止液。
[0019]1、食物過敏原蛋白偶聯(lián)磁珠
①取一只5mL的離心管向其中分別加入3.84mL 50mM pH4.0的磷酸鹽緩沖液、ImL5%的磁珠、60uL 50mg/mL的EDAC溶液和IOOuL 100mg/mL的NHS溶液,把離心管置于搖床上,室溫條件下活化30min。
[0020]②將離心管置于磁力架上吸住磁珠,棄掉清液,并向離心管中加入5mL 50mMpH6.5的磷酸鹽緩沖液;如此重復(fù)洗滌3次,最后一次加入4.499mL 50mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液。
[0021]③再向其中加入5ug/mL的食物過敏原蛋白500uL,l%牛血清蛋白luL,把離心管置于搖床上,40°C條件下反應(yīng)45min。
[0022]④重復(fù)②的洗滌步驟。
[0023]⑤加入4.990mL 50mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液與IOuL 1%BSA溶液,4°C條件下封閉保存。待用。
[0024]2、食物過敏原檢測試劑盒的使用方法①取若干只2mL的離心管,分別加入300uL偶聯(lián)食物過敏原蛋白的磁珠,用磁力架吸住磁珠,棄掉清液,然后加入300uL pH7.4的磷酸鹽緩沖液,如此洗滌3次。最后吸干。
[0025]②向洗滌后的磁珠中加入120uL (含20%甘油)梯度稀釋的抗體,室溫條件下孵育 40min。
[0026]③孵育結(jié)束后,用磁力架吸住磁珠,棄掉清液,再加入300uL的PBS洗滌液,漩渦震蕩,再用磁力架吸住磁珠,如此洗滌5次,最后吸干液體。
[0027]④向洗滌后的磁珠中加入100ng/mL的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗120uL (含20%甘油),室溫條件下孵育40min。
[0028]⑤重復(fù)步驟③。
[0029]⑥向洗滌后的磁珠中加入1OOuL的TMB顯色液,避光反應(yīng)15min。
[0030]⑦避光反應(yīng)后,向其中加入IOOuL ImoL/L的鹽酸溶液,終止反應(yīng)。并把液體轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)板上。
[0031]⑧用酶標(biāo)儀讀取吸光度值。
[0032]⑨結(jié)果計算 取重復(fù)孔平行三次的吸光度平均值;以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值和相應(yīng)的濃度進(jìn)行線性回歸,構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線;計算樣品重復(fù)孔的平均吸光度值大于CUt-Off值(Ing/mL對應(yīng)的吸光度)的那個吸光度值從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算出食物過敏原抗體的含量,此含量反應(yīng)了患者的過敏程度。
[0033]實施例一
I對蝦過敏原蛋白偶聯(lián)磁珠
①取一只5mL的離心管向其中分別加入3.84mL 50mM pH4.0的磷酸鹽緩沖液、ImL5%的磁珠、60uL 50mg/mL的EDAC溶液和IOOuL 100mg/mL的NHS溶液,把離心管置于搖床上,室溫條件下活化30min。
[0034]②將離心管置于磁力架上吸住磁珠,棄掉清液,并向離心管中加入5mL 50mMpH6.5的磷酸鹽緩沖液;如此重復(fù)洗滌3次,最后一次加入4.499mL 50mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液。
[0035]③再向其中加入5ug/mL的對奸過敏原蛋白500uL (對奸過敏原是一種相對分子質(zhì)量約36Kd的酸性糖蛋白,屬肌肉中的原肌球蛋白。蛋白濃度1.5mg/mL,溶于PBS,效價≥1:1000-5000。),1%牛血清蛋白luL,把離心管置于搖床上,40°C條件下反應(yīng)45min。
[0036]④重復(fù)②的洗滌步驟。
[0037]⑤加入4.990mL 50mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液與IOuL 1%BSA溶液,4°C條件下封閉保存。待用。
[0038]2對蝦過敏原抗體的檢測方法
①取3只2mL的離心管,分別加入300uL偶聯(lián)對蝦過敏原蛋白的磁珠,用磁力架吸住磁珠,棄掉清液,然后加入300uL pH7.4的磷酸鹽緩沖液,如此洗滌3次。最后吸干。
[0039]②向洗滌后的磁珠中加入120uL (含20%甘油)的小鼠抗對蝦過敏原蛋白單克隆抗體(溶于 PBS,pH7.4 中,蛋白濃度 lmg/mL,含 BSA 等穩(wěn)定劑,ELISA(1:500),IHC(1:200),IP (1:50), WB (1:300)。),室溫條件下孵育 40min。
[0040]③孵育結(jié)束后,用磁力架吸住磁珠,棄掉清液,再加入300uL的PBS洗滌液,漩渦震蕩,再用磁力架吸住磁珠,如此洗滌5次,最后吸干液體。
[0041]④向洗滌后的磁珠中加入100ng/mL的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗120uL (含20%甘油),室溫條件下孵育40min。
[0042]⑤重復(fù)步驟③。
[0043]⑥向洗滌后的磁珠中加入IOOuL的TMB顯色液,避光反應(yīng)15min。
[0044]⑦避光反應(yīng)后,向其中加入IOOuL ImoL/L的鹽酸溶液,終止反應(yīng)。并把液體轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)板上。
[0045]⑧用酶標(biāo)儀讀取吸光度值。
[0046]⑨結(jié)果計算
取重復(fù)孔平行三次的吸光度平均值;以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值和相應(yīng)的濃度進(jìn)行線性回歸,構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線;計算樣品重復(fù)孔的平均吸光度值大于CUt-Off值(Ing/mL對應(yīng)的吸光度)的那個吸光度值從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算出對蝦過敏原抗體的含量。特異性達(dá)91.3%。
[0047]實施例二:食物過敏原篩查試驗
對35例食物過敏患者抽取血液,將其制備血清,來篩查食物過敏原。檢測吸光度值,計算抗體濃度,其中值大于cut-off值(Ing/mL對應(yīng)的吸光度)的判斷為陽性。其檢測結(jié)果如下表1所示:
表1
【權(quán)利要求】
1.一種高靈敏食物過敏原檢測方法,其特征在于,步驟如下: 1)食物過敏原蛋白偶聯(lián)磁珠,所述的食物過敏原包括但不限于水產(chǎn)類、奶類、蛋類、肉類、谷物類、堅果類、水果類、蔬菜類、豆類食物過敏原蛋白; 2)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線:梯度稀釋抗食物過敏原的IgG抗體標(biāo)準(zhǔn)品與食物過敏原蛋白偶聯(lián)磁珠進(jìn)行免疫反應(yīng),然后利用抗人1gG 二抗進(jìn)行信號放大反應(yīng),根據(jù)平均吸光度值和相應(yīng)的濃度進(jìn)行線性回歸,構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線; 3)篩查食物過敏原,利用食物過敏原蛋白偶聯(lián)磁珠與過敏患者的血清進(jìn)行免疫反應(yīng),然后利用抗人1gG 二抗進(jìn)行信號放大反應(yīng),然后根據(jù)得到的信號與步驟2)所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定食物過敏原的種類及對應(yīng)的抗體的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述的信號放大反應(yīng)為顯色反應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于,所述的步驟3)中確定食物過敏原的種類的cut-off值設(shè)定為抗體濃度1ng/mL的值在標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)的吸光度值。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述的步驟1)中,具體方法如下: .1.1)取一只5mL的離心管向其中分別加入3.84mL 50mM pH4.0的磷酸鹽緩沖液、1mL5%的磁珠、60uL 50mg/mL的EDAC溶液和1OOuL 100mg/mL的NHS溶液,把離心管置于搖床上,室溫條件下活化30min ; .1.2)將離心管置于磁力架上吸住磁珠,棄掉清液,并向離心管中加入5mL50mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液;重復(fù)洗滌3次,最后一次加入4.499 mL 50mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液; .1.3)再向其中加入5ug/mL的食物過敏原蛋白500uL,1%牛血清蛋白luL,把離心管置于搖床上,40 °C條件下反應(yīng)45min ; .1.4)重復(fù)1.2)的洗滌步驟; .1.5)加入4.990mL 50mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液與1OuL 1%BSA溶液,4°C條件下封閉保存待用。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于,所述的步驟3)中,具體方法如下: .3.1)取若干只2mL的離心管,分別加入300uL偶聯(lián)食物過敏原蛋白的磁珠,用磁力架吸住磁珠,棄掉清液,然后加入300uL pH7.4的磷酸鹽緩沖液,如此洗滌3次; 最后吸干; .3.2)向洗滌后的磁珠中加入120uL,含20%甘油,梯度稀釋的抗體,室溫條件下孵育40min ; .3.3)孵育結(jié)束后,用磁力架吸住磁珠,棄掉清液,再加入300uL的PBS洗滌液,漩渦震蕩,再用磁力架吸住磁珠,如此洗滌5次,最后吸干液體; .3.4)向洗滌后的磁珠中加入100ng/mL的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗120uL,含20%甘油,室溫條件下孵育40min ; .3.5)重復(fù)步驟3.3); .3.6)向洗滌后的磁珠中加入1OOuL的TMB顯色液,避光反應(yīng)15min ; .3.7)避光反應(yīng)后,向其中加入1OOuL 1moL/L的鹽酸溶液,終止反應(yīng),并把液體轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)板上; .3.8)用酶標(biāo)儀讀取吸光度值; .3.9)結(jié)果計算。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述的磁珠的表面具有羧基、氨基或者無基團(tuán),粒徑大小在100nnT3um。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法的食物過敏原檢測試劑盒,其特征在于,它包括但不限于已包被的水產(chǎn)類、奶類、蛋類、肉類、谷物類、堅果類、水果類、蔬菜類、豆類食物過敏原蛋白中的一種或多種的磁性納米微球、人IgG標(biāo)準(zhǔn)液、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗、TMB、樣品稀釋液、洗滌液和終止液,靈敏度范圍不高于2pg/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要 求7所述的試劑盒,其特征在于,適用于轉(zhuǎn)基因食品的過敏原檢測。
【文檔編號】G01N33/68GK103616520SQ201310645509
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
【發(fā)明者】沈曉亮, 錢兵, 劉意, 宋偉杰, 方序, 葉俊英, 董婧 申請人:浙江天科高新技術(shù)發(fā)展有限公司, 杭州賽恩生物技術(shù)有限公司