專利名稱：一種食物過敏原檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種食物過敏原檢測(cè)盒，尤其涉及一種半定量或定量檢測(cè)人血清中食物不耐受特異性IgG的免疫印記(Western Blot)檢測(cè)試劑盒,本發(fā)明還涉及一種食物過敏原檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
過敏性疾病是現(xiàn)代社會(huì)中最常見的一種疾病，其發(fā)病機(jī)理是機(jī)體受抗原物質(zhì)(也稱過敏原allergen或變應(yīng)原)刺激后引起的組織損傷或生理功能紊亂。食物不耐受性是過敏性疾病的一種，其為復(fù)雜的變態(tài)反應(yīng)性疾病，病變機(jī)理為人的免疫系統(tǒng)把進(jìn)入體內(nèi)的某種或多種食物當(dāng)作是有害物質(zhì)，從而針對(duì)這些物質(zhì)產(chǎn)生過度的保護(hù)性免疫反應(yīng)，產(chǎn)生食物特異性IgG抗體。 食物在進(jìn)入消化道后，理論上應(yīng)當(dāng)被消化分解為氨基酸、甘油和單糖，然后轉(zhuǎn)化為能量或者人體組織構(gòu)成。但事實(shí)并非如此，很多食物(包括我們最常食用的某些食物)因?yàn)槿狈ο鄳?yīng)的酶而無(wú)法被人體完全消化，從而以多肽或其它形式進(jìn)入腸道，其中一些會(huì)被機(jī)體作為外來(lái)物質(zhì)識(shí)別而產(chǎn)生免疫反應(yīng)，最后生成具有食物特異性的IgG抗體。當(dāng)該IgG抗體與再次食物顆粒接觸的時(shí)候，其將與食物顆粒形成免疫復(fù)合物(III型變態(tài)反應(yīng))，并被機(jī)體當(dāng)作廢物從腎臟排出。而并不是所有的免疫復(fù)合物都能通過腎小球?yàn)V膜，無(wú)法過濾的免疫復(fù)合物則會(huì)堵塞腎臟的濾過結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過壓升高，繼而導(dǎo)致血壓升高、血管壁擴(kuò)張和膽固醇沉積。人體廢液(尤其是脂肪細(xì)胞)不能正常通過腎臟排出而潴留在組織中，最終會(huì)導(dǎo)致水腫和肥胖。如果不及時(shí)改變飲食結(jié)構(gòu)，不耐受的食物會(huì)繼續(xù)形成復(fù)合物，加重原有的癥狀并不斷持續(xù)。從而導(dǎo)致免疫系統(tǒng)超負(fù)荷，致使人體各系統(tǒng)出現(xiàn)如高血壓、月巴胖、頭痛或偏頭痛、慢性腹瀉、疲勞、感染等一系列癥狀疾病。目前確定過敏原的方法主要皮內(nèi)試驗(yàn)和點(diǎn)刺試驗(yàn)，該方法一般半小時(shí)即可獲得檢測(cè)結(jié)果，具有簡(jiǎn)便、快速、價(jià)廉的優(yōu)點(diǎn)。但缺陷在于假陽(yáng)性高并受其他藥物的影響較大，試驗(yàn)前24小時(shí)內(nèi)服用抗過敏藥物會(huì)影響測(cè)定結(jié)果，甚至嚴(yán)重過敏反應(yīng)的患者進(jìn)行皮膚試驗(yàn)還會(huì)有一定的生命危險(xiǎn)。當(dāng)然也可以有通過體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出過敏原的種類，如通過抽取少量血清，然后檢測(cè)樣品中對(duì)某些過敏原產(chǎn)生的特異性IgG的含量，完成過敏原篩查及特異性過敏原的檢測(cè)。但該方法往往操作起來(lái)極為不便。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明第一方面提供一種靈敏度高，使用方便、安全的食物過敏原檢測(cè)試劑盒；第二方面提供了使用該檢測(cè)盒檢測(cè)食物過敏原的方法。為解決第一方面問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案一種食物過敏原檢測(cè)試劑盒，其特征在于食物過敏原檢測(cè)試劑盒包括包被有過敏原蛋白及人IgG標(biāo)準(zhǔn)品的硝酸纖維膜試紙條及反應(yīng)槽，所述試紙條位于反應(yīng)槽的底部。
進(jìn)一步,所述食物過敏原檢測(cè)試劑盒還包括生物素標(biāo)記的抗人IgG抗體試劑瓶，親和素-辣根過氧化物酶試劑瓶，TMB底物顯色瓶，樣本稀釋液瓶。進(jìn)一步，所述硝酸纖維膜試紙條不同位置包被有若干種食物過敏原蛋白，此不同位置區(qū)域定義為檢測(cè)區(qū)域。進(jìn)一步，所所述食物過敏原蛋白為奶類、蛋類、肉類、谷物類、堅(jiān)果類、水果類、蔬菜類、水產(chǎn)類、豆類的之中的若干種。進(jìn)一步，所述硝酸纖維膜試紙條在特定位置還包被有若干不同濃度的人IgG標(biāo)準(zhǔn)品，此特定位置區(qū)域定義為標(biāo)準(zhǔn)品區(qū)域。為解決第二方面問題，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案一種運(yùn)用如上所述試劑盒檢測(cè)食物過敏原方法，該方法包括以下步驟步驟一提取血清制備樣本液并加以稀釋，加入所述樣本液到帶有硝酸纖維膜試紙條的反應(yīng)槽中，使樣本液中的食物不耐受IgG抗體與試紙條上固相過敏原蛋白結(jié)合成 IgG抗體-過敏原蛋白復(fù)合物；步驟二 向反應(yīng)槽中加入生物素標(biāo)記的抗人IgG抗體，使IgG抗體-過敏原蛋白復(fù)合物與生物素標(biāo)記的抗人IgG抗體結(jié)合成生物素標(biāo)記的抗人IgG抗體-IgG抗體-過敏原蛋白復(fù)合物；同時(shí)，生物素標(biāo)記的抗人IgG抗體與試紙條上固相人IgG標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)合成生物素標(biāo)記的抗人IgG抗體-人IgG標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)合物；步驟三向反應(yīng)槽中加入親和素-HRP，使其與生物素標(biāo)記的抗人IgG抗體-IgG抗體-過敏原蛋白復(fù)合物及生物素標(biāo)記的抗人IgG抗體-人IgG標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)合物相結(jié)合；步驟四向反應(yīng)槽中加入TMB底物顯色液，根據(jù)試紙條標(biāo)準(zhǔn)品區(qū)域產(chǎn)生顏色的位置及顏色的深淺得到特定IgG濃度所對(duì)應(yīng)顏色的參考值；或使用適配生物信號(hào)分析儀得到食物不耐受IgG濃度-顏色標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)試紙條檢測(cè)區(qū)域產(chǎn)生顏色的位置判斷樣本液中食物不耐受IgG的種類；根據(jù)紙條檢測(cè)區(qū)域顏色的深淺結(jié)合特定IgG濃度所對(duì)應(yīng)顏色的參考值半定量判斷樣本液中食物不耐受IgG的濃度；或使用適配生物信號(hào)分析儀分析樣本液中食物不耐受IgG的種類及定量檢測(cè)樣本液中食物不耐受IgG的濃度。進(jìn)一步，所述步驟一前所述反應(yīng)槽在室溫下平衡10分鐘，用稀釋的清洗液快速濕潤(rùn)，在所述步驟一中所述樣本液在帶硝酸纖維膜試紙條的反應(yīng)槽中室溫下孵育45分鐘后清洗反應(yīng)槽除去雜質(zhì)蛋白。進(jìn)一步，在所述步驟二中反應(yīng)槽中加入生物素標(biāo)記的抗人IgG抗體在室溫中孵育45分鐘后清洗反應(yīng)槽除去多余抗人IgG抗體。進(jìn)一步，在所述步驟三中親和素-HRP在反應(yīng)槽中室溫孵育20分鐘，清洗反應(yīng)槽除去多余的親和素-HRP。進(jìn)一步，在所述步驟四中向反應(yīng)槽中加入TMB底物顯色液后避光反應(yīng)15分鐘。本發(fā)明的第一方面，由于反應(yīng)槽內(nèi)底部設(shè)硝酸纖維膜試紙條，該硝酸纖維膜試紙條被有若干種過敏原蛋白，試劑盒中還盛放有檢測(cè)所需的其他試劑組分，加入檢測(cè)者的血清樣本于反應(yīng)槽中，按照本發(fā)明第二方面的步驟檢測(cè)，即可方便的檢測(cè)出檢測(cè)者食物過敏原的種類及程度，靈敏度高，使用方便、安全。


下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，附圖中圖I是本發(fā)明中反應(yīng)槽結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。請(qǐng)參閱附圖1，本發(fā)明提供了一種食物過敏原檢測(cè)試劑盒，可用于對(duì)人體食物過敏原進(jìn)行檢測(cè)，包括包被有過敏原蛋白及人IgG標(biāo)準(zhǔn)品的硝酸纖維膜試紙條200及反應(yīng)槽100，所述試紙條位于反應(yīng)槽100的底部。該試劑盒還包括生物素標(biāo)記的抗人IgG抗體試劑瓶，親和素-辣根過氧化物酶試劑瓶，TMB底物顯色瓶，樣本稀釋液瓶，其在盒中的位置沒有特別要求。
該試紙條上檢測(cè)區(qū)域210包被有若干食物過敏原蛋白211，該食物過敏原蛋白211分居于硝酸纖維膜試紙條200的不同位置，即硝酸纖維膜試紙條不同位置包被有若干種食物過敏原蛋白，此不同位置區(qū)域定義為檢測(cè)區(qū)域。按照人體日常進(jìn)食，該食物過敏原蛋白211包括為奶類、蛋類、肉類、谷物類、堅(jiān)果類、水果類、蔬菜類、水產(chǎn)類、豆類的之中的若干種。例如奶類食物過敏原可以包括牛奶、羊奶等提取蛋白；蛋類食物過敏原可以包括家禽蛋白、家禽蛋黃等提取蛋白；肉類食物過敏原可以包括豬肉、牛肉、羊肉、鴨肉、雞肉、鵝肉、火雞肉、驢肉等提取蛋白；谷物類食物過敏原蛋白可以包括玉米、小麥、燕麥、大麥、喬麥、大米、小米等提取蛋白；堅(jiān)果類食物過敏原蛋白可以包括杏仁、花生、榛子、腰果、核桃、開心果、巴西堅(jiān)果、芝麻等提取蛋白；水果類食物過敏原蛋白可以包括西瓜、菠蘿、橙子、芒果、香蕉、柑桔、胡袖、擰橡、蘋果、葡萄、梨、草莓、桃等提取蛋白；蔬菜類過敏原蛋白可以包括蘿卜、芹菜、菠菜、洋蔥、茄子、大蒜、辣椒、土豆、西紅柿等提取蛋白；水產(chǎn)類食物過敏原蛋白可以包括帶魚、黃魚、比目魚、三文魚、鯧鳊魚、鯽魚、草魚、鏈魚、龍蝦、河奸、蟹、蛘、貝類、牡蠣、黃鱔、鯉魚等提取的蛋白；豆類食物過敏原蛋白可以包括扁豆、蠶豆、黃豆、豌豆等提取的蛋白；一般情況所述過敏原蛋白應(yīng)盡可能種類全，以便搜尋出過敏原蛋白種類；當(dāng)然如果需要檢查某人對(duì)特定食物是否過敏，則只需包被該特定食物過敏原蛋白即可。食物過敏原的制備方法為將含過敏原蛋白的食物經(jīng)粉碎、脫脂、提取、濃縮、SDS-PAGE電泳鑒定、洗脫、然后冷凍貯存?zhèn)溆?。該試紙條上標(biāo)準(zhǔn)品區(qū)域220包被有若干人IgG標(biāo)準(zhǔn)品221,該人IgG標(biāo)準(zhǔn)品221分居于硝酸纖維膜試紙條200的不同位置，即硝酸纖維膜試紙條在特定位置還包被有若干不同濃度的人IgG標(biāo)準(zhǔn)品，此特定位置區(qū)域定義為標(biāo)準(zhǔn)品區(qū)域。人IgG標(biāo)準(zhǔn)品221由商品化的人IgG稀釋為不同濃度獲得。以上食物過敏原蛋白211的制備方法為奶類食物過敏原蛋白奶類必須新鮮,經(jīng)巴氏滅菌的奶類不能用于制作奶類食物過敏原蛋白。奶類過敏原蛋白分為乳清白蛋白(Iactalbumin)和酪蛋白(casein)兩類,具體制備方法包括以下步驟(a)先用離心法(2400轉(zhuǎn)/分鐘)離心15分鐘，用小匙除去上層脂肪，取400ml脫脂乳，加入5ml 1%凝乳酶或乳凍片，不攪拌，放入37°C恒溫水浴或孵箱內(nèi)30分鐘，如乳清白蛋白與酷蛋白分離，用干凈紗布過濾，再用普通濾紙過濾。按I : 2(W/V)的比例，用緩沖鹽水提取液(buffer saline solution)稀釋乳清蛋白即為乳清蛋白提取液。其中所述緩沖鹽水提取液(buffer saline solution) (pH = 8)具體配方為氯化鈉5. Og ;磷酸二氫鉀0. 36g ;磷酸氫二鈉7. Og ;結(jié)晶酚4. Og ;蒸餾水1000ml，將上述質(zhì)量的成分混合后水浴加熱至完全溶解后備用，如PH低于或高于8，可用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)正。(b)將含有乳清的濾液加3倍丙酮，放入冰箱24h，使乳清沉淀；用離心法除去上清液，再用丙酮浸洗幾次，干燥后研細(xì)成粉未貯存。提取時(shí)按I : 50 (W/V)用緩沖鹽水提取液在冰箱內(nèi)提取48小時(shí)，每日攪拌或振蕩2小時(shí)。酪蛋白用丙酮和乙醚反復(fù)脫脂、最后研磨，用3號(hào)或4號(hào)篩篩出，按I : 50(W/V)比例提取。蛋類食物過敏原蛋白取鮮蛋一個(gè)，用肥皂水洗刷干凈，兩端各打一個(gè)小孔，小端朝下使蛋白流出，與蛋黃分離。蛋白和蛋黃均按I : 20(W/V)的比例用緩沖鹽水提取液稀釋，充分混勻后直接過濾和除菌，不需提取，亦無(wú)需作毒性試驗(yàn)。蛋黃也可制成干粉，方法是加入丙酮脫脂2-3小時(shí)，傾去丙酮層，待揮發(fā)干燥后，用打碎機(jī)打碎，再用乙醚脫脂4小時(shí)備用。蛋黃干粉按I : 50比例(W/V)用緩沖鹽水提取液提取。肉類食物過敏原蛋白取新鮮瘦肉，去掉脂肪和結(jié)締組織，剁成碎末，或用絞肉機(jī)絞碎。交替用甲苯、二甲苯、丙酮及乙醚等不同溶劑反復(fù)脫脂，室溫下干燥，過篩，貯存于密閉玻璃瓶中備用。按I : 25(W/V)的比例用緩沖鹽水提取液提取48小時(shí)。粗濾后如濾液混濁，可用分液漏斗加乙醚再脫脂。谷物類食物過敏原蛋白將谷物類種子粉碎，過篩，乙醚脫脂2次(4小時(shí))備用。按I : 10(W/V)比例用緩沖鹽水提取液提取48小時(shí)，在此過程中，每日攪拌或振蕩2小時(shí)。先用布氏漏斗抽濾或用離心法分離沉淀粉，再用常壓過濾。堅(jiān)果類食物過敏原蛋白取生的未經(jīng)加工的原材料，取出皮殼，搗碎，以甲苯、丙酮和乙醚反復(fù)脫脂，過2號(hào)或3號(hào)篩，貯存于密閉的玻璃瓶中備用。按I : 25(W/V)的比例用緩沖鹽水液在冰箱中提取48小時(shí)，在此過程中，每日攪拌或振蕩2小時(shí)。濾液如果混濁，應(yīng)再用分液漏斗加乙醚脫脂。水果類食物過敏原蛋白新鮮材料洗凈，去外皮及枝葉，切碎或搗爛，擠出汁液，或制成果醬。果汁按2 I的比例(W/V)用緩沖鹽水提取液稀釋即可；果醬按I : I的比例(W/V)加入緩沖鹽水提取液在冰箱中提取48小時(shí)，在此過程中，每日振蕩2小時(shí)。蔬菜類食物過敏原蛋白新鮮材料洗凈，帶皮者去皮，切成細(xì)末，或用搗碎機(jī)打碎。按I : I的比例(W/V)用緩沖鹽水在冰箱中提取48小時(shí)，在此過程中，每日攪拌或振蕩2小時(shí)，普通濾紙過濾。如含脂肪的蔬菜，需用分液漏斗加乙醚脫脂。水產(chǎn)類食物過敏原蛋白材料清洗，去掉鱗、殼、內(nèi)臟，將肉取下，剁碎，在干燥器中干燥，交替用丙酮、甲苯、乙醚脫脂，干燥后研磨，3號(hào)或4號(hào)篩過篩備用。按I : 25(W/V)的比例用緩沖鹽水提取液提取48小時(shí)。粗濾后如濾液混濁，可用分液漏斗加乙醚再脫脂。豆類食物過敏原蛋干燥、去殼、脫皮、磨粉貯存；在索氏提取器中按粉正己烷=I 10(W/V)的比例脫脂6小時(shí)，干燥脫脂粉再磨細(xì)貯于_20°C下的密封容器中備用。脫脂粉用提取緩沖液(含20mmol NaH2P04, lmol/L NaCl，pH7.0)提取蛋白；脫脂粉提取緩沖液的比例為Ig 10ml(W/V)，室溫提取1.5小時(shí)，然后41下2000(^離心30分鐘，保存上清液?？乖?、標(biāo)準(zhǔn)條帶預(yù)包被硝酸纖維膜的制備方法如下
(a)選取提取的17種食物過敏原蛋白用抗原包被液(0. 01mol/L磷酸緩沖液，PH5. 5)分別稀釋到合適濃度(選取的過敏原蛋白分別為牛奶、蝦、雞蛋白、牛肉、羊肉、花生、腰果、蘋果、葡萄、芹菜、大蒜、鯽魚、草魚、蟹、蛘、蠶豆、辣椒)，以條帶方式包被硝酸纖維膜特定位置(但不限于條帶方式)；將實(shí)施例I得到的3種人IgG標(biāo)準(zhǔn)品以條帶方式包被于硝酸纖維膜特定位置(但不限于條帶方式)，晾干。當(dāng)然應(yīng)當(dāng)知道，提取的食物過敏原蛋白種類不限于17種；人IgG標(biāo)準(zhǔn)品不限于3種。其包被情況可參閱附圖I。(b)封閉將已包被有過敏原抗原及人IgG標(biāo)準(zhǔn)品的硝酸纖維膜浸泡于含5%牛血清白蛋白的封閉液中，4 °C過夜，倒掉封閉液。(C)干燥將封閉后的硝酸纖維膜浸泡于含15%蔗糖和5%甘油的磷酸緩沖液中室溫保護(hù)3小時(shí)，倒掉保護(hù)液，至干燥室干燥。(d)將干燥后的硝酸纖維膜200粘貼于雙面帶膠的PVC膠板表面，將膠板切割成合適尺寸并粘貼于反應(yīng)槽100的底部，裝入含干燥劑的包裝中保存。 其他試劑的制備生物素標(biāo)記抗體的制備用長(zhǎng)臂活化生物素sulfo-NHS-LC-LC-biotin標(biāo)記純化的抗人IgG抗體；親和素-辣根過氧化物酶的制備用辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素；TMB底物顯色液配制采用商品化的TMB顯色劑。樣本稀釋液配制選取0. 01mol/L PBS,1% BSA, pH :7. 2。濃縮洗滌液的制備:將80gNaCl ；3. 8g KCl ；5. 85g Tris Base ；31. 75g Tris HCl ；5ml Tween-20,用1000ml蒸懼水配成濃縮洗漆液。試劑盒的組裝如下按每盒12份粘貼于反應(yīng)槽100底部的硝酸纖維膜試紙條200，一瓶生物素標(biāo)記抗體(4ml)瓶親和素-辣根過氧化物酶(4ml);—瓶TMB底物顯色液(4ml);—瓶(25X)濃縮清洗液(20ml)瓶樣本稀釋液(IOml)。本發(fā)明還揭示一種使用該檢測(cè)盒檢測(cè)食物過敏原的方法，其具體檢測(cè)步驟為步驟一提取血清制備樣本液，加入所述樣本液到帶硝酸纖維膜試紙條200的反應(yīng)槽100中室溫下孵育45分鐘，使樣本液中的食物不耐受IgG抗體與試紙條上固相過敏原蛋白結(jié)合成IgG抗體-過敏原蛋白復(fù)合物，清洗反應(yīng)槽100除去雜質(zhì)蛋白；步驟二 向反應(yīng)槽100中加入生物素標(biāo)記的抗人IgG抗體在室溫中孕育45分鐘后，使IgG抗體-過敏原蛋白復(fù)合物與生物素標(biāo)記的抗人IgG抗體結(jié)合成生物素標(biāo)記的抗人IgG抗體-IgG抗體-過敏原蛋白復(fù)合物；使人IgG標(biāo)準(zhǔn)品與生物素標(biāo)記的抗人IgG抗體結(jié)合成生物素標(biāo)記的抗人IgG抗體-人IgG標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)合物。清洗反應(yīng)槽100除去多余抗人IgG抗體；步驟三向反應(yīng)槽100中加入親和素-HRP室溫孵育20分鐘，使其與生物素標(biāo)記的抗人IgG抗體-IgG抗體-過敏原蛋白復(fù)合物及生物素標(biāo)記的抗人IgG抗體-人IgG標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)合物相結(jié)合，清洗反應(yīng)槽100除去多余的親和素-HRP ；步驟四向反應(yīng)槽100中加入TMB底物顯色液避光反應(yīng)15分鐘，根據(jù)試紙條標(biāo)準(zhǔn)品區(qū)域產(chǎn)生顏色的位置及顏色的深淺得到特定IgG濃度所對(duì)應(yīng)顏色的參考值?；蚴褂眠m配生物信號(hào)分析儀得到食物不耐受IgG濃度-顏色標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)試紙條檢測(cè)區(qū)域產(chǎn)生顏色的位置判斷樣本液中食物不耐受IgG的種類；根據(jù)紙條檢測(cè)區(qū)域顏色的深淺結(jié)合特定IgG濃度所對(duì)應(yīng)顏色的參考值半定量判斷樣本液中食物不耐受IgG的濃度?；蚴褂眠m配生物信號(hào)分析儀分析樣本液中食物不耐受IgG的種類及定量檢測(cè)樣本液中食物不耐受IgG的濃度。步驟一前所述反應(yīng)槽100在室溫下平衡10分鐘，用稀釋的清洗液快速濕潤(rùn)。本發(fā)明的第一方面，由于反應(yīng)槽100內(nèi)底部設(shè)有硝酸纖維膜試紙條200，該硝酸纖維膜試紙條200包被有若干種過敏原蛋白211及若干種人IgG標(biāo)準(zhǔn)品221，試劑盒中還盛放有檢測(cè)所需的其他試劑組分，加入檢測(cè)者的血清樣本于反應(yīng)槽100中，按照本發(fā)明第二方面的步驟檢測(cè)，即可方便的檢測(cè)出檢測(cè)者食物過敏原的種類及程度，靈敏度高，使用方便、安全。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種食物過敏原檢測(cè)試劑盒，其特征在于食物過敏原檢測(cè)試劑盒包括包被有過敏原蛋白及人IgG標(biāo)準(zhǔn)品的硝酸纖維膜試紙條及反應(yīng)槽，所述試紙條位于反應(yīng)槽的底部。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述食物過敏原檢測(cè)試劑盒還包括生物素標(biāo)記的抗人IgG抗體試劑瓶，親和素-辣根過氧化物酶試劑瓶，TMB底物顯色瓶，樣本稀釋液瓶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述硝酸纖維膜試紙條不同位置包被有若干種食物過敏原蛋白，此不同位置區(qū)域定義為檢測(cè)區(qū)域。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述食物過敏原蛋白為奶類、蛋類、肉類、谷物類、堅(jiān)果類、水果類、蔬菜類、水產(chǎn)類、豆類的之中的若干種。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述硝酸纖維膜試紙條在特定位置還包被有若干不同濃度的人IgG標(biāo)準(zhǔn)品，此特定位置區(qū)域定義為標(biāo)準(zhǔn)品區(qū)域。
6.一種運(yùn)用如權(quán)利要求I 5所述試劑盒檢測(cè)食物過敏原的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟 步驟一提取血清制備樣本液并加以稀釋，加入所述樣本液到帶有硝酸纖維膜試紙條的反應(yīng)槽中，使樣本液中的食物不耐受IgG抗體與試紙條上固相過敏原蛋白結(jié)合成IgG抗體-過敏原蛋白復(fù)合物； 步驟二 向反應(yīng)槽中加入生物素標(biāo)記的抗人IgG抗體，使IgG抗體-過敏原蛋白復(fù)合物與生物素標(biāo)記的抗人IgG抗體結(jié)合成生物素標(biāo)記的抗人IgG抗體-IgG抗體-過敏原蛋白復(fù)合物；同時(shí)，生物素標(biāo)記的抗人IgG抗體與試紙條上固相人IgG標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)合成生物素標(biāo)記的抗人IgG抗體-人IgG標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)合物； 步驟三向反應(yīng)槽中加入親和素-HRP，使其與生物素標(biāo)記的抗人IgG抗體-IgG抗體-過敏原蛋白復(fù)合物及生物素標(biāo)記的抗人IgG抗體-人IgG標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)合物相結(jié)合； 步驟四向反應(yīng)槽中加入TMB底物顯色液，根據(jù)試紙條標(biāo)準(zhǔn)品區(qū)域產(chǎn)生顏色的位置及顏色的深淺得到特定IgG濃度所對(duì)應(yīng)顏色的參考值；或使用適配生物信號(hào)分析儀得到食物不耐受IgG濃度-顏色標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)試紙條檢測(cè)區(qū)域產(chǎn)生顏色的位置判斷樣本液中食物不耐受IgG的種類；根據(jù)紙條檢測(cè)區(qū)域顏色的深淺結(jié)合特定IgG濃度所對(duì)應(yīng)顏色的參考值半定量判斷樣本液中食物不耐受IgG的濃度；或使用適配生物信號(hào)分析儀分析樣本液中食物不耐受IgG的種類及定量檢測(cè)樣本液中食物不耐受IgG的濃度。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)食物過敏原方法，其特征在于所述步驟一前所述反應(yīng)槽在室溫下平衡10分鐘，用稀釋的清洗液快速濕潤(rùn)，在所述步驟一中所述樣本液在帶硝酸纖維膜試紙條的反應(yīng)槽中室溫下孵育45分鐘后清洗反應(yīng)槽除去雜質(zhì)蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)食物過敏原方法，其特征在于在所述步驟二中反應(yīng)槽中加入生物素標(biāo)記的抗人IgG抗體在室溫中孵育45分鐘后清洗反應(yīng)槽除去多余抗人IgG抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測(cè)食物過敏原方法，其特征在于在所述步驟三中親和素-HRP在反應(yīng)槽中室溫孵育20分鐘，清洗反應(yīng)槽除去多余的親和素-HRP。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測(cè)食物過敏原方法，其特征在于在所述步驟四中向反應(yīng)槽中加入TMB底物顯色液后避光反應(yīng)15分鐘。
全文摘要
本發(fā)明提供一種食物過敏原檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，第一方面提供一種靈敏度高，使用方便、安全的食物過敏原檢測(cè)試劑盒；第二方面提供了使用該檢測(cè)盒檢測(cè)食物過敏原的方法。食物過敏原檢測(cè)試劑盒包括包被有過敏原蛋白及人IgG標(biāo)準(zhǔn)品的硝酸纖維膜試紙條及反應(yīng)槽，所述試紙條位于反應(yīng)槽的底部。由于反應(yīng)槽內(nèi)底部設(shè)有試紙條，該試紙條包被有若干種過敏原蛋白，試劑盒中還盛放有檢測(cè)所需的其他試劑組分，加入檢測(cè)者的血清樣本于反應(yīng)槽中，按照本發(fā)明第二方面的步驟檢測(cè)，即可方便的檢測(cè)出檢測(cè)者食物過敏原的種類及程度，靈敏度高，使用方便、安全。
文檔編號(hào)G01N33/558GK102798721SQ20121017108
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月28日
發(fā)明者王永昌, 李光星 申請(qǐng)人:上虞常春生物技術(shù)有限公司