專利名稱：食物致敏原，檢測(cè)食物過敏原的方法和檢測(cè)誘導(dǎo)食物過敏原的食物的方法
食物致敏原，檢測(cè)食物過敏原的方法和檢測(cè)誘導(dǎo)食物過敏原的食物的方法本發(fā)明申請(qǐng)是PCT專利申請(qǐng)PCT/JP02/09066，申請(qǐng)日為2002年9月5日發(fā)明名稱為“食物致敏原，檢測(cè)食物過敏原的方法和檢測(cè)誘導(dǎo)食物過敏原的食物的方法”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)，母案進(jìn)入中國的申請(qǐng)?zhí)枮?2822093. 5。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及一種包含食物過敏性病人體內(nèi)IgE抗體能夠識(shí)別的多種天然和/或變性過敏原的混合物、通過使用該混合物免疫動(dòng)物制備的抗體、利用所述抗體檢測(cè)食物過敏·原和誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的食物的方法。本發(fā)明給對(duì)食物過敏的病人提供了安全性，這是因?yàn)楸景l(fā)明有助于理解食物過敏反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制，開發(fā)和檢驗(yàn)低過敏原性的食物，檢測(cè)食物、食物原料和諸如食物制作機(jī)器及過程之類的食物制作環(huán)境中的過敏原。食物過敏反應(yīng)是易感個(gè)體攝取的食物中誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的物質(zhì)(以下稱為食物過敏原)所導(dǎo)致的有害免疫反應(yīng)。食物過敏反應(yīng)能夠?qū)е缕ぱ住⑾?、消化道障礙、過敏反應(yīng)性休克等。根據(jù)疾病發(fā)生的機(jī)制將過敏反應(yīng)分為I型至IV型。食物過敏反應(yīng)主要是I型過敏反應(yīng),其中IgE抗體和攝入體內(nèi)的食物過敏原發(fā)生反應(yīng)。近年來，食物過敏病人的數(shù)目一直在上升。這種現(xiàn)象導(dǎo)致了醫(yī)學(xué)和食品工業(yè)領(lǐng)域中的嚴(yán)重問題。為了預(yù)防這種危害，有必要通過標(biāo)簽給消費(fèi)者提供有關(guān)信息。FA0/WH0聯(lián)合食品標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(食品法規(guī)聯(lián)合委員會(huì)(Codex Alimentarius Commision))已經(jīng)認(rèn)識(shí)到食品標(biāo)簽上注明包含已知為食物過敏原的八種原料中任何一種的必要性，并建議各成員國實(shí)施該標(biāo)簽系統(tǒng)(1999年6月)。考慮到食物過敏原的嚴(yán)重性和經(jīng)常性，日本已頒布了 24條標(biāo)簽法規(guī)(2002年4月生效)。應(yīng)該注意的是這些規(guī)定不是要求注明過敏原性物質(zhì)或食物過敏原本身，而是要求注明包含過敏原性物質(zhì)和食物過敏原的食物，即誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的食物。誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的食物包括蛋、奶、肉、魚、甲殼動(dòng)物和軟體動(dòng)物、谷類、豆類和堅(jiān)果、水果、蔬菜、啤酒酵母或明膠。類似地，卵清蛋白、類卵粘蛋白、溶菌酶、酪蛋白、￠-乳球蛋白、a-乳清蛋白、面筋、a-淀粉酶抑制劑等都是誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的食物。另外，(I)不考慮現(xiàn)有的知識(shí)，必然還有許多其他食物和成分(食物過敏原)能夠?qū)е率澄镞^敏反應(yīng)；(2)誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的食物和成分(食物過敏原)是多樣的，對(duì)這些過敏原的反應(yīng)根據(jù)不同的食物過敏性病人而異；和(3)如后面的實(shí)施例中所述，在誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的單一食物中存在有多種已知和未知的過敏原。然而，使用傳統(tǒng)的方法不易于檢測(cè)如此眾多的誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的食物或食物過敏原。食物通過加熱、冷凍、干燥、鹽化、發(fā)酵、酶處理等方法(以下稱為食物加工方法)制作，以改善和穩(wěn)定它們的可消化性、保存期限、口感、物理特性等。雖然食物加工方法影響蛋白質(zhì)，改變它們的分子結(jié)構(gòu)(如使蛋白質(zhì)變性)，但是很少論及這些食物加工方法是否能夠?qū)е率澄镞^敏原的形成。本發(fā)明闡明了以下一些事實(shí)(1)一些加熱過的食物成分表現(xiàn)出變應(yīng)原性；(2)取決于該食物加熱與否，誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的單一食物中誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的組分或表位可能發(fā)生改變。即，制備了 a)未加熱過的蛋類抗原，b)通過對(duì)a)中的抗原加熱制作的加熱過的蛋類抗原，C)通過將從多個(gè)食物過敏性病人匯集(pooled)的血清(稱為匯集的病人血清)和a)(去除了(cbpleted)未加熱過的蛋類抗原的血清)相混合制備的血清，和d)通過將匯集的病人血清和b)(去除了加熱過的蛋類抗原的血清)相混合制備的血清。a)和c)或a)和d)之間，和b)和c)或b)和d)之間反應(yīng)的結(jié)果表明，去除了未加熱過的蛋類抗原的血清不能和未加熱過的蛋類抗原發(fā)生免疫反應(yīng)，但能夠和加熱過的蛋類抗原發(fā)生反應(yīng)；類似地，去除了加熱過的蛋類抗原的血清不能和加熱過的蛋類抗原發(fā)生免疫反應(yīng)，但能夠和未加熱過的蛋類抗原發(fā)生反應(yīng)?？傊澄镞^敏性病人攜帶有對(duì)加工和未加工食物都特異的IgE抗體，導(dǎo)致食物過敏反應(yīng)。但是目前為止，還沒有簡單的方法能夠檢測(cè)加工后食物中的過敏原或其成分。篩選雞蛋、花生、酪蛋白、￠-乳球蛋白、面筋中食物過敏原的方法能夠由商業(yè)途徑獲得(食品與開發(fā)，Vol.35，pl0_ll)。但是，所有這些方法或其中的一些具有以下一種或多種缺陷(1)這些方法不能總是檢測(cè)到食物過敏性病人對(duì)之敏感的抗原。也就是說，它們不能夠總是檢測(cè)到病人IgE抗體所能識(shí)別的物質(zhì)；(2)這些方法能夠檢測(cè)已知抗原，且每種方法僅能檢測(cè)到一種過敏原(單一的抗原)；(3)這些利用檢測(cè)單一抗原的抗體的方法不適用 于含抑制性物質(zhì)的食物；(4)如下面的實(shí)施例中所示，這些利用檢測(cè)單一抗原的抗體的方法不能對(duì)誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的食物進(jìn)行精確的定量；(5)這些利用檢測(cè)單一抗原的抗體的方法不適用于檢查不含抗原的誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的食物(如利用通過和卵白中的卵清蛋白相接觸制備的單一抗體的方法不適用于檢查蛋黃、蛋黃醬等。而已知食物過敏反應(yīng)由蛋黃所致);(6)這些利用檢測(cè)單一抗原的抗體的方法不適用于檢查加工過的食物，這是因?yàn)樗鼈儾荒軌驒z測(cè)變性或分子修飾過的過敏原；和(7)抗天然和變性￠-乳球蛋白、卵清蛋白和a-酪蛋白的單克隆抗體已有報(bào)道(Allergy，Vol. 50，p309)。但如果食物加工方法去除或改變了其表位，則這些方法的用途就會(huì)減小，這是因?yàn)閱慰寺】贵w僅能檢測(cè)食物過敏原分子中的單一表位。雖然利用從對(duì)大米(日本專利公開2000-65820)、蛋和奶(日本肉類科學(xué)，vol. 39, pl66-169)過敏的病人體內(nèi)獲得的血清篩選食物過敏原的方法已有報(bào)道，并在醫(yī)院里得以應(yīng)用，但是不適用于檢查團(tuán)體，也不適用于食品加工廠，這是因?yàn)檫@些方法需要從病人體內(nèi)獲得大量血清。雖然依賴于過敏反應(yīng)的食物抗原檢測(cè)法已有報(bào)道(FFIJ.，No. 180，p77-82)，但是復(fù)雜的方法學(xué)和實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物飼養(yǎng)使得該方法在多數(shù)食品加工廠里不適用。雖然已經(jīng)建立了利用流式系統(tǒng)和酶標(biāo)抗體和利用微電極的過敏原感受器的方法(日本食品工業(yè)，Vol. 42，p53-56)，在這些方法投入實(shí)際應(yīng)用之前有許多問題尚待解決。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的完成是為了解決上述傳統(tǒng)方法中的問題。本發(fā)明的目的是提供(I)包含食物敏感性病人的IgE抗體能夠識(shí)別的多種已知和/或未知以及天然和/或變性食物過敏原的混合物(為方便起見，稱為本發(fā)明的第一項(xiàng)發(fā)明)，(2)通過用混合物免疫動(dòng)物而制備的抗體(稱為本發(fā)明的第二項(xiàng)發(fā)明)，和(3)利用所述抗體檢測(cè)食物過敏原和誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的食物的方法(稱為本發(fā)明的第三項(xiàng)發(fā)明)。附圖簡述

圖1所示為標(biāo)準(zhǔn)抗原和病人IgE抗體之間的反應(yīng)，以及標(biāo)準(zhǔn)抗原和本發(fā)明中的抗標(biāo)準(zhǔn)抗原抗體的抗體之間的反應(yīng)。圖2所示為攜帶有對(duì)天然和變性蛋類蛋白特異的IgE抗體的病人血清。實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明的第一項(xiàng)發(fā)明可以這樣完成(l_i)從食物過敏性病人匯集的血清中分離IgE抗體，和(1-1i)利用親和層析和免疫沉淀之類的免疫學(xué)方法，從經(jīng)過或不經(jīng)過食物制作方法處理的食物或其成分(下面總稱為食物)中分離上述IgE抗體能夠識(shí)別的多種物質(zhì)(換句話說，食物過敏性病人的IgE抗體能夠識(shí)別的多種食物過敏原)。本發(fā)明的第一項(xiàng)發(fā)明也可以這樣完成 (2-1)按常規(guī)方法對(duì)食物成分進(jìn)行SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)移到膜上，(2-1i)利用膜、匯集的病人血清、抗人IgE的偶聯(lián)抗體和顯色試劑進(jìn)行Western印跡分析(換句話說，制作食物過敏性病人的IgE抗體能夠識(shí)別的多種食物過敏原的圖譜)，(2-1ii)類似地，利用膜、按常規(guī)方法將食物成分免疫動(dòng)物制備的動(dòng)物血清、偶聯(lián)的抗動(dòng)物IgG的抗體和顯色試劑進(jìn)行Western印跡分析,然后(2-1v)比較二者的Western印跡分析圖譜，測(cè)定前者中不存在而后者中存在的條帶(換句話說，就是食物過敏性病人的IgE不能夠識(shí)別的多種物質(zhì))的分子大小，并(2-v)根據(jù)上述結(jié)果，通過凝膠過濾層析之類的傳統(tǒng)方法從食物成分中分離食物過敏性病人的IgE抗體能夠識(shí)別的多種食物過敏原。本發(fā)明的第二項(xiàng)發(fā)明是抗食物過敏原的動(dòng)物抗體(被稱為識(shí)別多種抗原的抗體)，該抗體通過將多種食物過敏原(包括加工和/或未加工的食物過敏原)免疫動(dòng)物而制備，其中的食物過敏原通過上述的第一項(xiàng)發(fā)明制備，且能夠被食物過敏性病人的IgE抗體所識(shí)別。本發(fā)明的第三項(xiàng)發(fā)明是檢測(cè)食物過敏原和誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的食物的方法，該方法的特征在于利用識(shí)別多種抗原的抗體。上述的食品制作方法中熱處理的溫度范圍和食品加工方法的溫度范圍相同，優(yōu)選在40和250攝氏度之間，更優(yōu)選在60和120攝氏度之間。通過將原料抗原和在兩個(gè)至六個(gè)不同的溫度下加熱過的抗原相混合，制備抗原。食物過敏性病人的IgE抗體能夠識(shí)別的食物過敏原組分根據(jù)本發(fā)明的第一項(xiàng)發(fā)明從混合物制備，并用其接種動(dòng)物。如果檢測(cè)的目標(biāo)僅限于加熱過的食物，則食物過敏性病人的IgE抗體能夠識(shí)別的食物過敏原組分用本發(fā)明的第一項(xiàng)發(fā)明從加熱過的食物制備，并用其接種動(dòng)物。舉例來說，接種的動(dòng)物可以是兔、山羊、綿羊、大鼠、小鼠、豚鼠、馬、豬、雞等。在免疫期間，需要部分采血，測(cè)定抗食物過敏原抗體的滴度。本發(fā)明的抗體可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。如下面所述的實(shí)施例所示，即使在一種食物過敏反應(yīng)誘導(dǎo)性食物中也存在食物過敏性病人的IgE抗體能夠識(shí)別的多種已知和未知食物過敏原。通過使用多種食物過敏原免動(dòng)物，易于制備識(shí)別多種食物過敏原的多價(jià)抗體，即識(shí)別多種抗原的抗體。作為針對(duì)食物過敏性病人IgE抗體能夠識(shí)別的食物過敏原的動(dòng)物抗體，動(dòng)物的抗血清可以直接使用。對(duì)于含食物過敏性病人IgE抗體不能識(shí)別的組分，進(jìn)行吸收處理及傳統(tǒng)的IgG純化后使用抗血清。本發(fā)明中檢測(cè)食物過敏原和誘導(dǎo)食物過敏反應(yīng)的食物的方法無限制地適用于包含過敏原的食物。舉例來說，誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的食物的例子是蛋、奶、肉、魚、甲殼動(dòng)物和軟體動(dòng)物、谷類、豆類和堅(jiān)果、水果、蔬菜、啤酒酵母和明膠。更具體地說，蛋的蛋白和蛋黃、奶及其奶酪、肉類的豬肉、牛肉、雞肉和羊肉，魚類的鯖魚、日本花鯖、沙丁魚、金槍魚、鮭魚、鱈魚、平魚和鮭魚魚子醬，甲殼動(dòng)物和軟體動(dòng)物類的蟹、小蝦、貽貝、魷魚、章魚、龍蝦和鮑魚，谷類的小麥、米、蕎麥、黑麥、大麥、燕麥、玉米、黍、谷子和稗，豆類和堅(jiān)果類的大豆、花生、可可豆、豌豆、腰果、榛子、巴西堅(jiān)果、杏仁、椰子果和核桃，水果類的蘋果、香蕉、橘、桃、獼猴桃、草莓、瓜、鱷梨、葡萄、芒果、梨、芝麻和芥菜，蔬菜類的西紅柿、蘿卜、土豆、菠菜、洋蔥、大蒜、竹筍、南瓜、地瓜、芹菜、歐芹、山藥、松蘑，含有它們的食物及其成分(如卵清蛋白、類卵粘蛋白、溶菌酶、酪蛋白、￠-乳球蛋白、a-乳清蛋白、面筋、a-淀粉酶抑制劑)。這些食物可以通過加熱、冷凍、干燥、鹽化、發(fā)酵、酶加工等進(jìn)行處理。一般說來，食物過敏性病人的IgE抗體的識(shí)別可能性為50%或更大的過敏原被稱作主要過敏原,否則稱作次要過敏原。有些病人對(duì)主要過敏原不敏感,而對(duì)次要過敏原敏感。因此，篩選食物過敏原的方法應(yīng)該既檢測(cè)主要過敏原，又檢測(cè)次要過敏原。本發(fā)明的篩選方法能夠檢測(cè)食物過敏性病人能夠識(shí)別的天然和變性的多種過敏原。
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為了制備符合這種要求的抗體，本發(fā)明作了研究并有以下發(fā)現(xiàn)。即，按常規(guī)方法對(duì)食物成分進(jìn)行SDS-PAGE分析，并將凝膠轉(zhuǎn)移到膜上(i)利用膜、匯集的病人血清、抗人IgE的偶聯(lián)抗體和顯色試劑進(jìn)行Western印跡分析；(ii)類似地，利用膜、通過常規(guī)地將食物成分免疫動(dòng)物制備的動(dòng)物血清、偶聯(lián)的抗動(dòng)物IgG的抗體和顯色試劑進(jìn)行Western印跡分析；(iii)比較二者的Western印跡分析圖譜，有以下發(fā)現(xiàn)(I)存在有在兩塊膜上都得以染色的條帶，(2)存在有在前者未得以染色，而在后者得以染色的條帶(換句話說，就是食物過敏性病人的IgE能夠識(shí)別的多種非過敏原性物質(zhì))，和(3)和前者染色條帶相比，僅后者染色條帶分布在更大和/或更小分子量位置上；(iv)根據(jù)上述結(jié)果，通過凝膠過濾層析方法從食物成分中分離食物過敏性病人的IgE抗體能夠識(shí)別的多種食物過敏性組分，并用之接種動(dòng)物，制備抗多種食物過敏原的抗體?？梢詫?duì)兔、山羊、綿羊、大鼠、小鼠、豚鼠、馬、豬和雞等恒溫動(dòng)物進(jìn)行接種。可以采用本技術(shù)領(lǐng)域的熟練人員所掌握的任何一種接種方法。如上所述制備的抗體可在本發(fā)明的食物過敏原檢測(cè)方法中使用?？贵w可以固定在微量滴定板、PVDF膜、硝酸纖維素膜、層析條、試管、小珠、尼龍膜等上面，應(yīng)用在酶免分析、免疫印跡分析、點(diǎn)印跡分析、免疫層析和抗體芯片等免疫學(xué)方法中。如上所述，本發(fā)明的食物過敏原檢測(cè)方法旨在檢測(cè)食物和食品制作機(jī)器和加工過程之類的環(huán)境中的多種食物過敏原。優(yōu)選使用從食物獲得的液體提取物進(jìn)行分析。雖然提取介質(zhì)通常是水、磷酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液、酒精等，但并不局限于這些，只要過敏原能夠得以提取即可。為了提高過敏原從食物中的提取效率，可以根據(jù)需要加入蛋白質(zhì)變性劑(如SDS或脲)、含有SH的抗氧化劑(如2-巰基乙醇)等?？梢酝ㄟ^擦拭(用拭子等拭抹)環(huán)境獲取的液體和用洗瓶捕獲的氣體進(jìn)行測(cè)定，確定在機(jī)器或加工過程等食品制作環(huán)境中存在的多種過敏原。只要本發(fā)明中食物過敏原檢測(cè)方法的原理是酶免分析、免疫印跡分析和熒光多免疫珠法等免疫學(xué)方法即可，并不局限于一種特定的方法。舉例來說，三明治ELISA、競爭法、直接法等都是酶免分析方法。如果對(duì)抗體加以標(biāo)記，可以使用酶(如過氧化物酶、堿性磷酸酶和3 -半乳糖苷酶)、熒光物質(zhì)(如異硫氰酸熒光素)、生物發(fā)光物質(zhì)(如熒光素-熒光素酶)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)(如發(fā)光氨，吖啶衍生物和金剛烷衍生物)、生物素、抗生物素蛋白、膠體金、放射活性物質(zhì)(如32P)等。下面列舉本發(fā)明檢測(cè)方法的實(shí)例，說明三明治ELISA、競爭法和直接法程序的要點(diǎn)。為了實(shí)施三明治ELISA，制備 本發(fā)明中識(shí)別多種過敏原的標(biāo)記抗體(識(shí)別多種抗原的抗體)。通過吸附或化學(xué)結(jié)合將識(shí)別本發(fā)明中多種抗體的非標(biāo)記抗體固定在ELISA板上。然后，使用不干擾反應(yīng)體系的蛋白質(zhì)如明膠和兔血清白蛋白封閉板上未固定有抗體的區(qū)域。將從食物、食物成分或食物制作環(huán)境中獲得的提取物(此后稱為樣品)或標(biāo)準(zhǔn)抗原加到板上，進(jìn)行第一次抗原-抗體反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，洗板。為了進(jìn)行第二次抗原-抗體反應(yīng)，往板上加入上述的標(biāo)記抗體，固定在板上的抗體能夠捕捉過敏原。洗板，去除過量的標(biāo)記抗體，加入檢測(cè)試劑(如過氧化物酶的情況下加入1，2_苯二胺和H2O2，堿性磷酸酶的情況下加入對(duì)-硝基苯磷酸鹽)。通過檢測(cè)標(biāo)記物和檢測(cè)試劑之間反應(yīng)物的量對(duì)過敏原進(jìn)行檢測(cè)或定量。改變往ELISA板上加入的標(biāo)準(zhǔn)抗原或誘導(dǎo)食物過敏反應(yīng)的食物(如蛋和奶)的量來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)食物過敏原或誘導(dǎo)食物過敏反應(yīng)的食物進(jìn)行定量。如果定量的值是Ippm或更多，則樣品可能是誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的食物。由于利用檢測(cè)單一抗原的抗體的方法必須將通過檢測(cè)單一抗原的抗體得到的值轉(zhuǎn)化為誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的食物的含量，這樣會(huì)產(chǎn)生定量誤差。單一抗原以類卵粘蛋白和卵清蛋白為例，整個(gè)蛋中類卵粘蛋白和卵清蛋白的濃度分別約為4%和2%。然而，蛋黃既不含類卵粘蛋白，也不含卵清蛋白。相應(yīng)地，(I)僅檢測(cè)類卵粘蛋白或卵清蛋白的方法不適用于檢測(cè)蛋黃蛋白質(zhì)；(2)如果通過整蛋繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線用于檢測(cè)蛋白，則進(jìn)行兩次或更多次定量，而非一次；和(3)如果實(shí)際值超出了定量范圍，則確定為極高的定量值。類似地，由于酪蛋白和￠-乳球蛋白在全部奶類蛋白中的含量分別約為80%和10%，因此存在一個(gè)問題，就是識(shí)別單一抗原的抗體不能對(duì)利用酪蛋白鈉、乳清蛋白等進(jìn)行強(qiáng)化加工的奶類進(jìn)行精確定量，本發(fā)明中識(shí)別多種抗原的抗體就不存在或較少存在這種問題。對(duì)于競爭法，將定量的標(biāo)準(zhǔn)抗原直接固定在用非反應(yīng)性蛋白封閉的固相上。然后，將識(shí)別過敏原的酶聯(lián)抗體和樣品同時(shí)加到板上。將板靜置一定時(shí)間，然后洗板，去除未結(jié)合的物質(zhì)。往板上加入顯色底物，隨后終止反應(yīng)。對(duì)固定的過敏原和經(jīng)樣品預(yù)處理的酶聯(lián)抗體之間的反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于直接法，使樣品直接吸附在用非反應(yīng)性蛋白封閉的固相上，使樣品和識(shí)別過敏原的酶聯(lián)抗體反應(yīng)。隨后，應(yīng)用上述的同樣步驟檢測(cè)樣品中的過敏原。對(duì)于上述的三明治ELISA、競爭法和直接法中的任何一種方法，都可以使用熒光、生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行顯色。根據(jù)該測(cè)定的目的、樣品性質(zhì)、原理等，本技術(shù)領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明方法的其他條件作相應(yīng)變動(dòng)。
本發(fā)明中檢測(cè)食物過敏原的方法能夠靈敏地檢測(cè)食物和食物原料的提取物中0.1或1. Ong/ml或更多的過敏原。工業(yè)適用性包含食物過敏性病人IgE抗體能夠識(shí)別的多種天然和/或變性過敏原和本發(fā)明抗體的混合物有助于理解食物過敏反應(yīng)發(fā)生的機(jī)制，開發(fā)降低食物過敏原變應(yīng)原性的技術(shù)。本發(fā)明中檢測(cè)食物過敏原的方法有助于驗(yàn)證低過敏反應(yīng)性技術(shù)的實(shí)用性，檢測(cè)食物中的食物過敏原、誘導(dǎo)食物過敏反應(yīng)的食物和諸如食物制作機(jī)器和方法之類的食物制作環(huán)境。相應(yīng)地，本發(fā)明有助于為保障食物過敏性病人的安全性，解決最近食物過敏性病人的增加引發(fā)的醫(yī)療和工業(yè)問題。
實(shí)施例下面的實(shí)施例更具體地解釋了本發(fā)明，但對(duì)本發(fā)明的范圍不作限制。本說明書中的縮略詞是本技術(shù)領(lǐng)域中常用的。 實(shí)施例1 (制備各種食物的標(biāo)準(zhǔn)抗原)(I)雞蛋、鵪鶉蛋和鴨蛋Ikg雞蛋去殼,勻楽；,凍干,研細(xì)，制備標(biāo)準(zhǔn)雞蛋抗原。10-g抗原懸于10倍體積的pH7. O磷酸鹽緩沖液(以下縮寫為PBS)后，分在5個(gè)試管中，不加熱或分別在60、80、100、120攝氏度加熱30分鐘。然后，混合在一起，混勻制備樣品。以類似方法制備鵪鶉蛋和鴨蛋的樣品。(2)牛奶IL奶在低溫下攪拌，使之固化，沉積奶類脂肪，并通過能吸收的棉花將之過濾。該程序重復(fù)3次，將濾液凍干，研細(xì)，制備標(biāo)準(zhǔn)牛奶抗原。類似地，如(I)中所述制備樣品。(3)小壽和大米室溫下，Ikg小麥粉用5倍量的加有4M尿素的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8. 6)提取2小時(shí)，并同時(shí)加以攪拌，然后離心。對(duì)上清液進(jìn)行透析，凍干，然后研細(xì)，制備標(biāo)準(zhǔn)小麥抗原。類似地，如(I)中所述制備樣品。類似地，從大米粉中制備樣品。(4)養(yǎng)麥?zhǔn)覝叵?，Ikg蕎麥粉用5倍量的加有l(wèi)%NaCl的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8. 4)提取2小時(shí)，并同時(shí)加以攪拌，然后離心。對(duì)上清液進(jìn)行透析，凍干，然后研細(xì)，制備標(biāo)準(zhǔn)蕎麥抗原。類似地，如(I)中所述制備樣品。(5)花牛Ikg花生研細(xì)，用5倍量的正己烷脫脂2小時(shí)，并同時(shí)加以攪拌。將該程序重復(fù)3次后，去除正己烷，室溫下將制備物用5倍量的加有l(wèi)%NaCl的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8. 4)提取2小時(shí)，并同時(shí)加以攪拌，然后離心。對(duì)上清液進(jìn)行透析，凍干，然后研細(xì)，制備標(biāo)準(zhǔn)花生抗原。類似地，如(I)中所述制備樣品。(6)大豆如(5)中所述制備大豆標(biāo)準(zhǔn)抗原。類似地，如(I)中所述制備樣品。實(shí)施例2 (各種純化的食物過敏原)(I)純化的雞蛋過敏原
將雞蛋中的主要過敏原之一——卵清蛋白懸于10倍體積的pH7. 0磷酸鹽緩沖液(以下縮寫為PBS)后，分在5個(gè)試管中，不加熱或分別在60、80、100、120攝氏度加熱30分鐘。然后，混合在一起，混勻制備樣品。以類似方法制備類卵粘蛋白樣品。已知卵清蛋白和類卵粘蛋白是位于蛋清中的蛋白質(zhì)。(2)鈍化的牛奶討敏原如實(shí)施例2(1)所述類似方法制備酪蛋白、￠-乳球蛋白和a-乳清蛋白樣品。已知乳球蛋白和a-乳清蛋白是位于奶類乳清蛋白中的蛋白質(zhì)。實(shí)施例3 (抗體的制備)( I)抗各種標(biāo)準(zhǔn)食物抗原的兔抗體的制備實(shí)施例1中制備的各種樣品用弗氏完全佐劑(用于第一次接種)和非完全佐劑(用
于第二次及其后的接種)進(jìn)行乳化，接種日本白兔4至6次。在接種期間，部分采血，確定針對(duì)抗原的抗體的產(chǎn)生，然后采集全部血液。這樣，抗體即得以制備。(2)抗各種純化食物抗原的抗體的制備類似地，如上所述制備抗各種純化食物抗原的抗體。實(shí)施例4 (用免疫印跡法檢測(cè)各種食物過敏原)( I)匯集的病人血■清和兔抗體將20例RAST (放射變應(yīng)原吸附試驗(yàn))評(píng)分為2或以上(特異性IgE抗體>0. 7UA/ml)的病人體內(nèi)獲得的、抗蛋、奶或小麥的血清等量相混合，制備匯集的血清?？沟啊⒛毯托←湹耐每贵w是實(shí)施例3 (I)中制備的。(2)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯釀胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上述的標(biāo)準(zhǔn)蛋抗原、奶抗原和小麥抗原和2-巰基乙醇一起加熱3分鐘，在濃度為10%的微型平板膠上進(jìn)行電泳。凝膠電轉(zhuǎn)移至PVDF (聚偏二氟乙烯)膜上。使用膠體金染色試劑盒(BioRad)檢測(cè)部分膜上的蛋白質(zhì)。(3)免疫染色用1%人血清白蛋白(HSA)對(duì)上述的PVDF膜進(jìn)行封閉。然后，將膜用包含0. 05%吐溫20的PBS (PBST)洗，和匯集的病人血清(100倍稀釋液)或兔抗體(1000倍稀釋液)于室溫下反應(yīng)2小時(shí)。洗膜，和二級(jí)抗體，即堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗人IgE-e鏈山羊抗體(2500倍稀釋)或堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗兔IgG抗體(4000倍稀釋液)于室溫下反應(yīng)I小時(shí)。用PBST洗膜，和化學(xué)發(fā)光底物4-甲基-4 (3-憐酸苯基)螺[I，2-二氧環(huán)燒-3，2-金剛燒]鈉鹽于室溫下反應(yīng)30分鐘，使之在感光片上曝光，檢測(cè)堿性磷酸酶的去磷酸化反應(yīng)產(chǎn)生的光子。結(jié)果如圖1所示。如圖1所示，匯集的病人血清產(chǎn)生了多條帶(圖1的泳道1、4和7)和存在于各食物中病人IgE能夠識(shí)別的多種過敏原。然而，兔抗體檢測(cè)到了病人IgE能夠識(shí)別的食物過敏原(圖1的泳道2、5和8)。兩種血清都能夠識(shí)別的物質(zhì)如下蛋中的卵清蛋白、類卵粘蛋白、溶菌酶和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白；奶中的酪蛋白、P -乳球蛋白和a-乳清蛋白；小麥中的glyadine和a -淀粉酶抑制劑；蕎麥的 132-kDa、84-kDa、27-kDa 和 ll_kDa 物質(zhì)；花生的 107-kDa、72_kDa、35_kDa 和28-kDa 物質(zhì)。另外，兔抗體不能檢測(cè)病人IgE不能識(shí)別的非食物性過敏原。
(4)過敏原的濃縮和分離不能識(shí)別過敏原之外物質(zhì)的抗體如以下方法制備將用匯集的病人血清染色的條帶分子量分布和用動(dòng)物抗體染色的條帶分子量分布相比較，發(fā)現(xiàn)與前者相比后者中有些條帶分布在更高或更低分子量位置(圖1 )。通過凝膠過濾層析，從標(biāo)準(zhǔn)抗原中收集和食物過敏性病人IgE能夠識(shí)別的食物過敏原分子量相當(dāng)?shù)慕M分(以下稱為過敏原組分)。樣品如實(shí)施例1所述制備，并將之免疫動(dòng)物，制備抗過敏原組分的抗體。利用抗體如上所述進(jìn)行Western印跡分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗體通常識(shí)別收集的病人血清能夠識(shí)別的食物抗原(圖1的泳道3、6和9)。通過免疫沉淀、利用病人IgE抗體的親和層析和離子交換層析，完成這些過敏原的濃縮和分離。實(shí)施例5 (點(diǎn)印跡法檢測(cè)主要過敏原和其加熱過的制備物)在PBS中浸泡的PVDF膜置于點(diǎn)印跡裝置后，使純化的主要過敏原(卵清蛋白、類 卵粘蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、溶菌酶、酪蛋白、￠-乳球蛋白、a-乳清蛋白、a-淀粉酶抑制劑和glyadine)和其加熱過的制備物吸附在膜上，用添加有3%RSA的TBS封閉，并用TBST洗膜?？沟?過敏原組分、奶過敏原組分和小麥過敏原組分的抗體(稀釋2000倍)加到膜上，室溫下反應(yīng)I小時(shí)。然后，將生物素偶聯(lián)的抗兔IgG綿羊抗體和HRP偶聯(lián)的抗生物素蛋白(4000倍)加到膜上，洗膜，將膜和化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)，并通過感光片檢測(cè)產(chǎn)生的光子。上述的抗體檢測(cè)到了卵清蛋白、類卵粘蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、溶菌酶、酪蛋白、￠-乳球蛋白、a -乳清蛋白、a -淀粉酶抑制劑和glyadine等主要過敏原。這些抗體還檢測(cè)到了上述純化敏原的加熱制備物。實(shí)施例6 (通過三明治ELISA檢測(cè)蛋、奶和小麥過敏原)( I)抗體下面實(shí)驗(yàn)程序使用實(shí)施例4 (4)中制備的抗蛋、奶和小麥中過敏原組分的抗體，和根據(jù)傳統(tǒng)方法制備的偶聯(lián)有生物素的抗體。(2)包被和封閉微孔板上的抗體IOOu I上述抗體(IOii g/ml)分別加到ELISA板(Nunc)的各孔中，4攝氏度靜置過夜，洗板(添加有150mM-NaCl和0. 05%吐溫20的20mM Tris-HCl緩沖液，pH7. 4)，25攝氏度下用0. 1%RSA (Sigma)封閉I小時(shí)。(3)蛋、奶及小麥過敏原的檢測(cè)去除孔中的封閉溶液，每孔各加95iU稀釋液(添加有0. l%RSA、150mM NaCl和0. 05%吐溫20的20mM Tris-HCl緩沖液，pH7. 4)和5 U I各食物的PBS提取物，25攝氏度下靜置2小時(shí)。類似地，每孔各加實(shí)施例1中所述的5 u I蛋、奶和小麥標(biāo)準(zhǔn)抗原的懸液，25攝氏度下靜置2小時(shí)。用300ia洗液洗5次后，每孔各加IOOiU生物素偶聯(lián)的抗體(10000倍稀釋液)，25攝氏度下靜置lh。然后每孔各加IOOiU過氧化物酶偶聯(lián)的抗生物素蛋白(2500倍稀釋液)，25攝氏度下靜置30分鐘。洗板后，每孔各加IOOiU 3，3，，5，5，-四聯(lián)苯胺溶液，25攝氏度下避光反應(yīng)30分鐘。通過微孔板讀數(shù)儀讀取各孔的光密度值(檢測(cè)波長450nm,參照波長630nm)。結(jié)果如表I所示。表I表明各種食物提取物中的蛋、奶和小麥過敏原能夠得以檢測(cè)。
表1.檢測(cè)各種食物中的蛋、奶和小麥過敏原

權(quán)利要求
1.包含多克隆動(dòng)物血清的抗體混合物，其包含識(shí)別食物過敏性病人的IgE抗體能夠識(shí)別并且通過攝取導(dǎo)致食物過敏反應(yīng)的下述天然的和加熱變性的食物過敏原的抗體，其中食物過敏性病人具有2或更高的RAST評(píng)分(1)蛋中的卵清蛋白、類卵粘蛋白、溶菌酶和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白；(2)奶中的酪蛋白、乳球蛋白和α-乳清蛋白；(3)小麥中的gliadin和α-淀粉酶抑制劑；(4)蕎麥的132-kDa、84-kDa、27-kDa 和 11-kDa 物質(zhì)；或(5)花生的107-kDa、72-kDa、35-kDa 和 28_kDa 物質(zhì)。
2.利用權(quán)利要求1的抗體混合物檢測(cè)食物過敏原的方法。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述食物過敏原是蛋中的卵清蛋白、類卵粘蛋白、溶菌酶和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述食物過敏原是奶中的酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳清蛋白。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述食物過敏原是小麥中的gliadin和α-淀粉酶抑制劑。
6.權(quán)利要求2的方法，其中所述食物過敏原是蕎麥的132-kDa、84-kDa、27-kDa和 11-kDa 物質(zhì)。
7.權(quán)利要求2的方法，其中所述食物過敏原是花生的107-kDa、72-kDa、35-kDa和 28-kDa 物質(zhì)。
8.利用權(quán)利要求1的抗體混合物檢測(cè)誘導(dǎo)食物過敏反應(yīng)的食物的方法。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述誘導(dǎo)食物過敏反應(yīng)的食物是蛋、奶、小麥、蕎麥或花生或包含其中一項(xiàng)或多項(xiàng)的食物。
全文摘要
本發(fā)明涉及食物致敏原，檢測(cè)食物過敏原的方法和檢測(cè)誘導(dǎo)食物過敏原的食物的方法。本發(fā)明提供一種檢測(cè)食物過敏原的方法、抗體和用于制備該抗體的抗原。本發(fā)明的抗原是包含食物過敏性病人的IgE能夠識(shí)別的多種未變性和/或變性的食物過敏原的混合物。本發(fā)明的抗體通過利用上述的抗原接種動(dòng)物制備。本發(fā)明中檢測(cè)食物過敏原的方法涉及到上述抗體。該方法能夠?qū)κ澄镞^敏原和誘導(dǎo)食物過敏反應(yīng)的食物進(jìn)行檢測(cè)，因此有助于確保食物過敏性病人的安全性。
文檔編號(hào)G01N33/02GK102993299SQ201210311198
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2002年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月5日
發(fā)明者森松文毅, 高畑能久, 松本貴之, 宮澤伊都美, 清水宗茂 申請(qǐng)人:日本肉類批發(fā)商株式會(huì)社