本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一個影響豬生長和PRRSV抗性的SLA-DRB1啟動子區(qū)分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是一種高度傳染的病毒性疾病，主要以母豬繁殖障礙和仔豬的呼吸道疾病為特征，造成懷孕母豬的流產(chǎn)、死胎以及仔豬生長緩慢、高死亡率等。該病于20世紀(jì)80年代末在美國發(fā)現(xiàn)，隨后在荷蘭、西班牙、英國等養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)國家相繼爆發(fā)，造成了巨大的經(jīng)濟損失。1991年荷蘭科學(xué)家Wensvoort博士第一次從感染的豬體內(nèi)分離出這種病毒，并將其命名為Lelystad病毒(LV)。1992年美國科學(xué)家Collins等在CL2621細(xì)胞中分離到能夠?qū)е孪嗨婆R床癥狀的病毒，并將其命名為VR-2332毒株。1992年，世界動物衛(wèi)生組織正式將該病毒統(tǒng)一命名PRRSV。我國初次發(fā)生該病是在1995年，郭寶清等人在1996年首次分離到該病毒，命名為CH-1a株。2006年在我國爆發(fā)的豬高熱病其主要病原即為高致病性PRRSV。目前，PRRS嚴(yán)重威脅著全球養(yǎng)豬業(yè)，并給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。由于PRRSV具有高度變異性、抗體依賴性病毒復(fù)制增強等特征，現(xiàn)有的疫苗并不能很好地控制該疾病的流行，通過遺傳抗性的選擇，培育PRRSV抗性豬新品種(系)成為重要的方向?？共⌒誀顚儆陂撔誀?，生長性狀屬于數(shù)量性狀，二者都是重要的經(jīng)濟性狀，同時也是表型選擇準(zhǔn)確性差、遺傳進展慢的性狀，開發(fā)相應(yīng)的分子標(biāo)記，進行標(biāo)記輔助選擇，可以實現(xiàn)超早期選種，提高選擇的準(zhǔn)確性，加快育種進程。
豬白細(xì)胞抗原DRB1(Swine leukocyte antigen DRB1，SLA-DRB1)，又名主要組織相容性抗原DRB1(MHC-DRB1)。SLA定位于7p12-q12，按其抗原結(jié)構(gòu)和功能主要分為3大類，即I類、Ⅱ類和III類基因，其中Ⅱ類基因位于SLA-D區(qū)，主要包括DRA、DRB、DQA、DQB、DOB、DPA、TAP、LMP等，控制著機體的免疫應(yīng)答與調(diào)控。其中，存在于DR亞區(qū)的DRB基因第2外顯子編碼區(qū)是SLA抗原分子最重要的功能區(qū)，即抗原結(jié)合區(qū)。SLA-DRB1與抗原遞呈中Ia分子相關(guān)的不變鏈(Ia-associated invariant chain,Ii鏈)、伴侶分子SLA-DM及TCR一起完成抗原的遞呈與識別。
研究顯示,DRB基因第2外顯子區(qū)具有高度多態(tài)性。如鞠慧萍等以藏豬為研究材料對SLA-DRB基因第2外顯子多態(tài)性進行了研究，發(fā)現(xiàn)藏豬SLA-DRB基因外顯子2存在著高度的多態(tài)性，在RsaⅠ-RFLP位點上存在7種基因型，以雜合子BC型居多，等位基因B的頻率最高，這一結(jié)果與談永松等研究五指山、二花臉和皮特蘭豬的SLA-DRB基因外顯子2多態(tài)性時僅檢測到4種帶型(AA，BB，AB和BD)，且A為優(yōu)勢等位基因有一定的差異。徐如海(2004)采用直接測序法研究表明，SLA-DRB外顯子2中的多態(tài)位點高達(dá)62個,SLA-DRB外顯子2中位點29與仔豬大腸桿菌K88ad粘附表型存在顯著的關(guān)聯(lián)(p＜0.01),位點29,149,170對0-28日齡仔豬血清IgG含量有顯著影響(p＜0.05)；同時在SLA-DRB近端調(diào)控區(qū)發(fā)現(xiàn)了24個多態(tài)位點,但這些多態(tài)位點與仔豬大腸桿菌K88ab,K88ac,K88ad粘附表型沒有顯著的關(guān)聯(lián)(p＞0.05)。另外，有報道SLA-DRB1編碼區(qū)多態(tài)性與免疫偽狂犬病毒疫苗產(chǎn)生的抗體滴度有關(guān)。但SLA-DRB1多態(tài)性與PRRSV抗性的關(guān)聯(lián)尚未見報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服豬育種中生長和PRRSV抗性表型選擇準(zhǔn)確性低，成本高，遺傳進展慢的缺點，提供一個影響豬體重和PRRSV抗性的分子標(biāo)記。
本發(fā)明的另一目的是提供一種豬生長性狀和PRRSV抗性性狀的SLA-DRB1基因啟動子區(qū)分子標(biāo)記選擇方法，用于豬分子育種，可以提高豬生長性狀和PRRSV抗性性狀選擇的準(zhǔn)確性，降低育種成本，加快豬PRRSV抗性新品種(系)培育進程。
本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：
一個影響豬體重和PRRSV抗性的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記位于豬SLA-DRB1基因啟動子區(qū)-28位點，且具有C/T多態(tài)性，TT型體重高于CT型和TT型，仔豬感染PRRSV后TT型仔豬血液中病毒載量低于CT型仔豬和CC型仔豬。
本發(fā)明所述的分子標(biāo)記在豬分子育種中的應(yīng)用。
一種用于檢測本發(fā)明所述的分子標(biāo)記的引物對，上游引物P1如序列表中SEQ ID NO：1所示，下游引物P2如序列表中SEQ ID NO：2所示。
本發(fā)明所述的引物對在豬分子育種中的應(yīng)用。
一種檢測本發(fā)明所述的分子標(biāo)記的方法，包含PCR擴增豬基因組中含有本發(fā)明所述的分子標(biāo)記的一段序列，對擴增產(chǎn)物進行測序，判讀豬SLA-DRB1基因啟動子區(qū)-28位點的C/T多態(tài)性。
一種篩選高生長性狀和具有PRRSV抗性的豬品系的方法，包括檢測豬SLA-DRB1基因啟動子區(qū)-28位點的多態(tài)性，選擇TT型個體留種。
本發(fā)明所述的方法，優(yōu)選包括以下步驟：
1)提取豬基因組DNA；
2)利用本發(fā)明所述的引物對PCR擴增SLA-DRB1基因啟動子區(qū)序列(序列NC_010449.4，20088～20305bp區(qū)域)，得到218bp擴增產(chǎn)物；
3)利用本發(fā)明所述的引物P2對218bp擴增產(chǎn)物進行測序分型，分為CC型、CT型、TT型；
4)選擇TT型個體留種。
其中，所述PCR擴增的反應(yīng)總體系優(yōu)選為20μL，模板DNA 15-100ng，5U/μL Taq聚合酶0.2μL，10mM的dNTP0.5μL，引物P1和P2各5pmol，25mM的MgCl2 1.2-1.6μL，10×緩沖液2μL，加滅菌雙蒸水至20μL；所述PCR擴增的反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，53-60℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃延伸7min。
有益效果
豬的生長性狀是一個重要的經(jīng)濟性狀，屬于數(shù)量性狀，傳統(tǒng)的表型選擇準(zhǔn)確性低，周期長，無法進行超早期選擇，遺傳進展緩慢。而常規(guī)的PRRSV抗性選擇需要進行PRRSV攻毒實驗，需要建立專門的試驗場所，攻毒實驗嚴(yán)重影響豬生長，部分攻毒豬死亡，代價很高，周期長，選擇準(zhǔn)確性低，遺傳進展緩慢。本發(fā)明采用測序法檢測SLA-DRB1基因啟動子區(qū)-28C/T位點的多態(tài)性，并將基因型與豬體重、豬對PRRSV的抗性進行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)SLA-DRB1基因啟動子區(qū)-28C/T位點的多態(tài)性與豬體重、豬對PRRSV的抗性相關(guān)，TT型體重高于CT型和TT型，于46、53、60、67日齡達(dá)到顯著或極顯著水平，仔豬感染PRRSV后TT型豬血液中病毒載量低于CT型和CC型，并且在接種PRRSV后第4、42天TT型顯著低于CC型，接種后第7、11、14、21天TT型顯著或者極顯著低于CT型和CC型(表2)，表明TT型豬對PRRSV具有更高的抗性。該多態(tài)位點可用于豬生長和PRRSV抗性的輔助選擇，提高選擇的準(zhǔn)確性，同時可以在豬出生時就通過檢測基因型進行選擇，無需攻毒測試，加快育種進程，降低育種成本，對PRRSV抗性新品種(系)培育具有重要的價值。
附圖說明
圖1豬SLA-DRB1基因啟動子區(qū)-28C/T突變位點測序圖
1a為CC型，1b為CT型，1c為TT型。
具體實施方式
下述實施例中提到的實驗方法，如無特別說明均為常規(guī)方法，內(nèi)切酶和熒光定量PCR試劑購自大連寶生物有限公司，高純總RNA快速提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，其余試劑購自南京生興生物技術(shù)有限公司。
實施例1、豬生長和PRRSV抗性的SLA-DRB1基因啟動子區(qū)-28C/T SNPs分子標(biāo)記選擇方法
材料與方法：
(一)豬群
88頭健康的大白姜曲海雜交豬(不接種任何疫苗)來自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，經(jīng)PCR檢測血液中無PRRSV，經(jīng)ELISA檢測血液中無PRRSV抗體。
(二)方法
1、豬對PRRSV抗性的測試方法
25日齡仔豬測體溫、稱重、采血，每頭豬耳根肌肉注射高致病性PRRSV NJGC株(TCID50為10-6.88/0.1mL)2mL，分別在29(接毒后4天)、32(接毒后7天)、36(接毒后11天)、39(接毒后14天)、46(接毒后21天)、53(接毒后28天)、60(接毒后35天)、67日齡(接毒后42天)測量體溫、體重、采集血液(肝素鈉抗凝)2mL，提取總RNA，以管家基因β‐actin為內(nèi)參，實時熒光定量PCR測定PRRSV-N基因的絕對量或者相對量，本案例中以ln2-△△CT表示病毒載量。
2、DNA的提取
采用常規(guī)酚、氯仿法提取DNA，采用電泳及測定OD260/280檢測DNA質(zhì)量。
3、總RNA提取
本案例中以全血提取總RNA，采用北京百泰克生物技術(shù)有限公司高純總RNA快速提取試劑盒。提取方法參照試劑盒使用手冊，略作修改。200μL抗凝血加入600μL裂解液RL混勻，其余操作同試劑盒說明書。采用電泳及測定OD260/280檢測RNA質(zhì)量。
4、實時熒光定量PCR(Real-time PCR)
總RNA參照RT Master Mix(TAKARA公司)試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)GenBank中PRRSV NJGC株序列(EF534357)利用引物設(shè)計軟件Primer5.0設(shè)計一對特異性引物(序列為P3：TCGCCCAACAAAACCAGT(SEQ ID NO.3)，P4：TTACCCTCCCTGAATCTGACA(SEQ ID NO.4))，根據(jù)GenBank中β-actin序列(AY550069)設(shè)計一對特異性引物(序列為P5：CCAAAGCCAACCGTGAGAA(SEQ ID NO.5)，P6：CCAGAGGCGTACAGGGACA(SEQ ID NO.6))，使用SYBR Premix Ex Taq II試劑盒(TAKARA公司)，以管家基因β-actin為內(nèi)參，進行實時熒光定量PCR，對PRRSV N基因的mRNA水平表達(dá)量進行檢測。
在避光環(huán)境、冰上進行操作，20μL Real-time PCR反應(yīng)體系為：10μL 2×SYBR Premix ExTaq、0.8μL上游引物(10μM)、0.8μL下游引物(10μM)、0.4μLROX Reference Dye II(50×)、2μL cDNA模板、6μL ddH2O。每組設(shè)3個重復(fù)，反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火34s，40個循環(huán)；每個循環(huán)結(jié)束后收集熒光信號。每個樣本三次重復(fù)取平均值，使用ln2-△△CT法計算PRRSV N基因的相對量作為病毒載量。
5、SLA-DRB1基因啟動子區(qū)-28C/T位點序列的擴增
根據(jù)genebank序列NC_010449.4，利用Primer Primer 5設(shè)計一對特異性引物(序列為P1：TTGAGTGGGACTTGCCTGCT(SEQ ID NO.1)，P2：AGTGAAATGGCAACTCCCCTC(SEQID NO.2))，PCR擴增SLA-DRB1基因啟動子區(qū)序列(序列NC_010449.4，20088～20305bp區(qū)域)。
PCR反應(yīng)總體系20μL，模板DNA 15-100ng，5U/μL Taq聚合酶0.2μL，10mM的dNTP0.5μL，引物P1和P2各5pmol，25mM的MgCl2 1.4μL，10×緩沖液2μL，加滅菌雙蒸水至20μL；所述PCR擴增的反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，53-60℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃延伸7min。
6、PCR擴增產(chǎn)物利用引物P2進行sanger測序分型。
7、SLA-DRB1基因啟動子區(qū)-28C/T位點不同基因型豬群間體重、PRRSV抗性的差異顯著性分析，采用SPSS 10中的One-way ANOVA方法進行。
(三)結(jié)果與分析
1、SLA-DRB1基因啟動子區(qū)-28C/T位點多態(tài)性
88個樣本的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)測序出現(xiàn)3種基因型，CC型(圖1a)，CT型(圖1b)，TT型(圖1c)。
2、SLA-DRB1基因啟動子區(qū)-28C/T位點不同基因型豬群間體重差異顯著性分析
采用單因素方差分析比較不同基因型豬群間體重的差異發(fā)現(xiàn)，TT型豬群25、29、32、36、39、46、53、60、67日齡體重均高于CT型和CC型，且在46、53、60、67日齡達(dá)到顯著或者極顯著水平(表1)。
表1SLA-DRB1基因啟動子區(qū)-28bp位點不同基因型雜交豬群體重變化
注:同行不同小寫字母上標(biāo)表示差異顯著(p<0.05)；同行不同大寫字母上標(biāo)表示差異極顯著(p<0.01)，下同。
3、SLA-DRB1基因啟動子區(qū)-28C/T位點不同基因型豬群間PRRSV抗性的差異顯著性分析
采用單因素方差分析比較不同基因型豬群接毒后血液中PRRSV相對量的差異發(fā)現(xiàn)，TT型豬群接種PRRSV后不同時間點血液中PRRSV相對量均低于CT型和CC型，并且在接種PRRSV后第4、42天TT型顯著低于CC型，接種后第7、11、14、21天TT型顯著或者極顯著低于CT型和CC型(表2)，表明TT型豬對PRRSV具有更高的抗性。
表2SLA-DRB1基因啟動子區(qū)-28bp位點不同基因型雜交豬群接毒后血液中PRRSV相對量
綜合分析以上結(jié)果可以看出，TT型豬在體重和對PRRSV的抗性方面均具有優(yōu)勢，可以作為豬生長和PRRSV抗性性狀選擇的分子標(biāo)記，在留種時選擇TT型個體。