本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種同時檢測金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)是最主要的食源性致病菌之一，在自然界中廣泛存在。由于金黃色葡萄球菌對多種理化因素具有較強(qiáng)抵抗力(耐熱)，易于污染肉制品乳制品，因此在世界各國，金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件占了很大比例。食品受金黃色葡萄球菌污染后，不僅容易導(dǎo)致腐敗變質(zhì)，而且部分菌株會產(chǎn)生腸毒素(Staphylococcal enterotoxin,SE)。腸毒素是引起金黃色葡萄球菌食物中毒的主要致病因子，是一種分子量低(約26-29kDa)且熱穩(wěn)定性高(100℃煮沸30min不被破壞)的毒素蛋白質(zhì)，能抵抗胃腸液中蛋白酶的水解作用。誤食污染腸毒素的食物后，腸毒素在腸道作用于內(nèi)脂神經(jīng)受體，傳入中樞，刺激嘔吐中樞，引起嘔吐，并產(chǎn)生急性胃腸炎癥狀。根據(jù)抗原性，SE分為約20個血清型，其中SE-A、SE-B、SE-C、SE-D和SE-E是最為常見的血清型(約95％金黃色葡萄球菌食物中毒事件是由SEA～SEE引起的)，尤以SE-A，SE-D最為顯著，隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的腸毒素包括SE(G-U)。A型的毒力最強(qiáng)，引起食物中毒最多的，而C型又可分為C1、C2和C3亞型。
目前檢測SE的方法按照檢測原理不同，分為動物實驗、免疫血清學(xué)方法、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)、高效液相色譜(HPLC)等。用于金黃色葡萄球菌檢測的傳統(tǒng)方法主要采用細(xì)菌分離培養(yǎng)及生化鑒別，該方法耗時長，一般需3～5d，且檢測靈敏度較低。免疫學(xué)檢測方法如ELISA，該法操作簡單，靈敏度較高；但一些試劑盒特異性較低，易出現(xiàn)假陽性。PCR技術(shù)具有快速、靈敏等特點，已廣泛應(yīng)用于致病菌的檢測，但多采用凝膠電泳法檢測PCR產(chǎn)物，步驟繁瑣，易造成污染。熒光PCR技術(shù)由于靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點越來越受到重視，從技術(shù)原理來看，熒光PCR借助熒光染料或熒光探針實現(xiàn)對把基因檢測，目前最為常見的是Taqman探針，市售的熒光PCR儀器主要包括4個(FAM、ROX、HEX、Cy5)熒光通道，而要實現(xiàn)在一個反應(yīng)管內(nèi)檢測5種腸毒素至少需要8條熒光探針(含雙色標(biāo)記)，極大的增加了檢測成本，同時，腸毒素基因序列富含AT堿基，序列Tm值偏低，設(shè)計難度大，容易引起非特異擴(kuò)增，造成假陽性結(jié)果，目前，對金黃色葡萄球菌腸毒素檢測仍以單色熒光PCR為主。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種同時檢測金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的檢測方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)在一個反應(yīng)管內(nèi)檢測5種腸毒素檢測成本大、探針設(shè)計難度高、容易造成假陽性結(jié)果的問題。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種同時檢測金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的試劑盒，包括一對通用引物、一條熒光探針和根據(jù)金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素特異性基因設(shè)計的雜交連接探針；其中，
所述通用引物的序列為SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；
所述熒光探針為ROX熒光探針，序列為SEQ ID NO：3所示；
所述根據(jù)金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素特異性基因設(shè)計的雜交連接探針如下：
金黃色葡萄球菌的雜交連接探針序列為SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示；
A型腸毒素的雜交連接探針序列為SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所示；
B型腸毒素的雜交連接探針序列為SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示；
C型腸毒素的雜交連接探針序列為SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示；
D型腸毒素的雜交連接探針序列為SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25所示；
E型腸毒素的雜交連接探針序列為SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27所示。
以及，一種同時檢測金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的檢測方法，包括以下步驟：
設(shè)計通用引物、熒光探針和根據(jù)金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素特異性基因設(shè)計的雜交連接探針，比檢測其雜交熔點溫度，制備上述的試劑盒；
提取待測樣本所含可疑菌的DNA；
以所述DNA作為模板，使用所述雜交連接探針識別并與待測的目的基因進(jìn)行雜交連接反應(yīng)，雜交連接酶催化與所述模板互補(bǔ)的待檢位點的上下游雜交探針之間形成3’-5’磷酸二酯鍵，獲得一條完整的單鏈雜交連接產(chǎn)物，將待測目的基因序列中的信息轉(zhuǎn)移到所述雜交連接產(chǎn)物中；
通過一對通用引物和一條熒光探針進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增所述雜交連接產(chǎn)物，同時進(jìn)行熔解曲線分析，由低到高的變化過程中出不同的Tm值，完成熔解曲線分析，通過產(chǎn)物溶解峰的溫度和形狀差異，判斷是否含有金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素，其中，所述熒光探針與金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素中的多種匹配程度不同的靶序列雜交，形成穩(wěn)定性不同的雙鏈雜交體。
本發(fā)明提供的同時檢測金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的試劑盒，含有針對金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素設(shè)計的雜交連接探針、熒光探針和引物，使得本發(fā)明試劑盒能夠在多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用實時熒光PCR熔解曲線法同時檢測金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素，從而有效縮短了金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的檢測周期，提高了金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的檢測效率和準(zhǔn)確性。此外，本發(fā)明同時檢測金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的試劑盒，在保證準(zhǔn)確性的前提下，只需要一條熒光探針和一對通用引物就能實現(xiàn)6個靶基因的檢測。
本發(fā)明提供的同時檢測金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的檢測方法，將多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)和熒光探針熔解曲線技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行檢測，通過溶解曲線分析可同時實現(xiàn)金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的高通量檢測，從而有效縮短了金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的檢測周期，提高了金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的檢測效率和準(zhǔn)確性，靈敏度高。具體的，本發(fā)明先進(jìn)行雜交連接反應(yīng)，將靶基因的信息轉(zhuǎn)移至雜交鏈接探針上，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測和熔解曲線分析，由于雜交鏈接探針用量極低(10nM)大大減少了非特異擴(kuò)增產(chǎn)物，能夠僅使用一對通用引物和一條熒光探針就實現(xiàn)了6個靶基因的檢測。
附圖說明
圖1是本發(fā)明實施例提供的金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素經(jīng)熒光探針熔解曲線分析處理后的曲線圖。
具體實施方式
為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
本發(fā)明實施例提供了一種同時檢測金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的試劑盒，包括一對通用引物、一條熒光探針和根據(jù)金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素特異性基因設(shè)計的雜交連接探針；其中，
所述通用引物的序列為SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；
所述熒光探針為ROX熒光探針，序列為SEQ ID NO：3所示；
所述根據(jù)金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素特異性基因設(shè)計的雜交連接探針如下：
金黃色葡萄球菌的雜交連接探針序列為SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示；
A型腸毒素的雜交連接探針序列為SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所示；
B型腸毒素的雜交連接探針序列為SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示；
C型腸毒素的雜交連接探針序列為SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示；
D型腸毒素的雜交連接探針序列為SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25所示；
E型腸毒素的雜交連接探針序列為SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27所示。
具體的，本發(fā)明實施例根據(jù)金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素特異性基因設(shè)計的特異性雜交連接探針進(jìn)行雜交連接反應(yīng)，進(jìn)一步實現(xiàn)PCR擴(kuò)增和溶解曲線的分析，且使得所述雜交連接探針的用量極低，大大減少了非特異擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)而能夠通過一條熒光探針和一組通用引物的實現(xiàn)6個靶基因的檢測。
進(jìn)一步優(yōu)選的，本發(fā)明實施例所述熒光探針ROX能夠同時檢測金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素基因，且其Tm值分別為，E型腸毒素：Tm值54.0±1℃，D型腸毒素：Tm值57.5±1℃，金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶編碼基因：Tm值62.5±1℃，C型腸毒素：Tm值66.0±1℃，B型腸毒素：Tm值70.0±1℃，A型腸毒素：Tm值74.5±1℃。優(yōu)選的，所述熒光探針ROX的3’端連接有BHQ淬滅基團(tuán)。選用上述熒光探針不僅可以提高實時定量PCR結(jié)果的效率、靈敏度和特異性，可以僅通過一條熒光探針實現(xiàn)多個目標(biāo)基因的同時檢測。
本發(fā)明實施例最終設(shè)計的熒光探針和通用引物的濃度可以根據(jù)實際條件和需要而定，如探針熔解曲線體系所用熒光探針和通用引物的濃度可以是表1中所述的濃度。
表1
上述的5種腸毒素如下文表2或5中的A型腸毒素、B型腸毒素、C型腸毒素、D型腸毒素、E型腸毒素。所述金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的特異性基因分別為：金黃色葡萄球菌是nuc，A型腸毒素是SEA、B型腸毒素是SEB、C型腸毒素是SEC、D型腸毒素是SED、E型腸毒素是SEE。所述金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的各自特異性基因可以直接查閱相關(guān)文獻(xiàn)獲得。上述所述金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素各自特異性基因序列如下述表2中所示。具體的，
金黃色葡萄球菌的特異性性基因序列為SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；
A型腸毒素的特異性性基因序列為SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示；
B型腸毒素的特異性性基因序列為SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示；
C型腸毒素的特異性性基因序列為SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示；
D型腸毒素的特異性性基因序列為SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示；
E型腸毒素的特異性性基因序列為SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示。
表2
本發(fā)明實施例根據(jù)上述金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的如上述表2所述的特異性性基因序列而分別設(shè)計的雜交連接探針如下文表5中所示的SEQ ID NO：16至SEQ ID NO：27。
上述金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的雜交連接探針序列能夠有效識別并雜交待測目的基因，而且在雜交連接酶催化與待測模板DNA互補(bǔ)的待檢位點的上下游雜交探針之間形成3’-5’磷酸二酯鍵，以能獲得一條完整的單鏈雜交連接產(chǎn)物。
進(jìn)一步的，本發(fā)明實施例所述試劑盒中，為了檢測時雜交連接反應(yīng)和熒光探針溶解曲線檢測的進(jìn)行，還會用到其他試劑。因此，為了本發(fā)明實施例試劑盒使用的方便，在一實施例中，本發(fā)明實施例試劑盒還包括雜交連接酶緩沖液、雜交連接酶，或進(jìn)一步的包括ddH2O。且該雜交連接酶緩沖液(Ligase buffer)、雜交連接酶(Ligase)與上述序列為SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的通用引物以及去離子水構(gòu)成雜交連接反應(yīng)試劑體系，如表3所示。其中，表3中的模板DNA為待測目標(biāo)菌提取的DNA。
表3
在另一實施例中，本發(fā)明實施例試劑盒還包括PCR緩沖液、MgCl2、dNTP、rTaq酶和ddH2O。且該P(yáng)CR緩沖液、MgCl2、dNTP和rTaq酶與上述序列為SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的通用引物和上述所示熒光探針以及去離子水構(gòu)成熒光探針溶解曲線檢測試劑體系，如表4所示。其中，表4中的模板為按照上述表3中的雜交連接反應(yīng)體系反應(yīng)所得的雜交連接反應(yīng)產(chǎn)物。
表4
由上所述，本發(fā)明實施例試劑盒含有針對金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素特異基因設(shè)計的雜交連接探針、熒光探針和引物，使得本發(fā)明實施例試劑盒能夠在多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用實時熒光PCR熔解曲線法同時檢測金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素，從而有效縮短了金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的檢測周期，提高了金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的檢測效率。
本發(fā)明實施例提供的同時檢測金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的試劑盒，含有針對金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素設(shè)計的雜交連接探針、熒光探針和引物，使得本發(fā)明試劑盒能夠在多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用實時熒光PCR熔解曲線法同時檢測金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素，從而有效縮短了金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的檢測周期，提高了金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的檢測效率和準(zhǔn)確性。此外，本發(fā)明實施例同時檢測金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的試劑盒，在保證準(zhǔn)確性的前提下，只需要一條熒光探針和一對通用引物就能實現(xiàn)6個靶基因的檢測。
對應(yīng)的，基于上文所述的基于熒光探針熔解曲線法同時檢測金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的試劑盒的基礎(chǔ)上，本發(fā)明實施例還提供了一種同時檢測金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的檢測方法，包括以下步驟：
S01.設(shè)計通用引物、熒光探針和根據(jù)金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素特異性基因設(shè)計的雜交連接探針，比檢測其雜交熔點溫度，制備上述的試劑盒；
S02.提取待測樣本所含可疑菌的DNA；
S03.以所述DNA作為模板，使用所述雜交連接探針識別并與待測的目的基因進(jìn)行雜交連接反應(yīng)，雜交連接酶催化與所述模板互補(bǔ)的待檢位點的上下游雜交探針之間形成3’-5’磷酸二酯鍵，獲得一條完整的單鏈雜交連接產(chǎn)物，將待測目的基因序列中的信息轉(zhuǎn)移到所述雜交連接產(chǎn)物中；
S04.通過一對通用引物和一條熒光探針進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增所述雜交連接產(chǎn)物，同時進(jìn)行熔解曲線分析，由低到高的變化過程中出不同的Tm值，完成熔解曲線分析，通過產(chǎn)物溶解峰的溫度和形狀差異，判斷是否含有金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素，其中，所述熒光探針與金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素中的多種匹配程度不同的靶序列雜交，形成穩(wěn)定性不同的雙鏈雜交體。
具體地，上述步驟S01中，所述通用引物和雜交連接探針基于金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素特異性基因設(shè)計。經(jīng)過發(fā)明人的反復(fù)研究、對比，獲得不與待測基因系列相似、不與引物序列互補(bǔ)雜交的特異性熒光探針。本發(fā)明實施例所述熒光探針ROX能夠同時檢測金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素基因，且其Tm值分別為，E型腸毒素：Tm值54.0±1℃，D型腸毒素：Tm值57.5±1℃，金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶編碼基因：Tm值62.5±1℃，C型腸毒素：Tm值66.0±1℃，B型腸毒素：Tm值70.0±1℃，A型腸毒素：Tm值74.5±1℃。優(yōu)選的，所述熒光探針ROX的3’端連接有BHQ淬滅基團(tuán)。
上述步驟S02中待測樣本可以是食用原料、食品，還可以設(shè)計公共衛(wèi)生安全的使用物品等。也即是說，該步驟S02中測樣本RNA提取的來源還可以是為衛(wèi)生安全為目的樣品為來源，即非僅僅以疾病判斷為目標(biāo)的來源。當(dāng)然，也可以是脫離人體物，如糞便等。提取待測樣本所含可疑菌的DNA方式可以按照本領(lǐng)域DNA常規(guī)提取方式，如下文實施例1中核算DNA的提取方法。
上述步驟S03的雜交連接反應(yīng)是以步驟S02中提取的DNA為模板，在上文表3中所示雜交連接反應(yīng)體系中進(jìn)行雜交連接反應(yīng)，在該雜交反應(yīng)過程中，表5中的雜交探針識別并雜交待測的目的基因，雜交連接酶催化與模板互補(bǔ)的待檢位點的上下游雜交探針之間形成3’-5’磷酸二酯鍵，獲得一條完整的單鏈雜交連接產(chǎn)物，待測目的基因序列中的信息由此被轉(zhuǎn)移到雜交連接產(chǎn)物中。而雜交連接產(chǎn)物將替代目的基因序列在后續(xù)的反應(yīng)中被擴(kuò)增和檢測。
在一實施例中，該雜交連接反應(yīng)的條件為：95℃預(yù)變性5min，60℃連接80min，98℃高溫變性5min。
上述步驟S04中，以步驟S03中的雜交連接反應(yīng)產(chǎn)物為模板，在上文表4中所示熒光探針熔解曲線檢測體系中進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增處理和溶解曲線分析處理。
本發(fā)明實施例所述熒光PCR擴(kuò)增處理和溶解曲線分析處理是通過一對通用引物和一個探針實現(xiàn)對雜交連接產(chǎn)物的擴(kuò)增，從而完成對目的產(chǎn)物的富集，然后，根據(jù)熒光檢測探針可與多種匹配程度不同的靶序列雜交，形成穩(wěn)定性不同的雙鏈雜交體，由低到高的變化過程中出不同的Tm值，完成溶解曲線分析。
在一實施例中，該熒光PCR擴(kuò)增處理的條件為：所述PCR擴(kuò)增處理的條件為：95℃預(yù)變性3min；然后經(jīng)95℃變性5s，退火58℃，15s同時采集熒光信號，延伸74℃，15s,40個循環(huán)。
在另一實施例中，所述溶解曲線分析處理的條件為：95℃變性30s，40℃雜交1min，從40℃-82℃逐步升溫每上升0.5℃采集一次熒光信號。
上述步驟S04中的熒光PCR擴(kuò)增處理結(jié)束后，將產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析處理，并根據(jù)產(chǎn)物溶解峰的溫度和形狀差異，確定是哪一種金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素。
在具體實施例中，經(jīng)熔解曲線分析處理后的上述金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素檢測結(jié)果如圖1所示。本發(fā)明實施例所述熒光探針可以檢測6個基因，熒光探針熔解曲線體系各個通道檢測基因名稱和Tm值范圍如下：
ROX通道共檢測6個基因，分別是E型腸毒素：Tm值54.0±1℃，D型腸毒素：Tm值57.5±1℃，nuc基因：Tm值62.5±1℃，C型腸毒素：Tm值66.0±1℃，B型腸毒素：Tm值70.0±1℃，A型腸毒素：Tm值74.5±1℃。
以上Tm值的測定是以BIORAD CFX96real time PCR儀器為準(zhǔn)。檢測結(jié)果判定時，Tm值以儀器自動判讀為準(zhǔn)，當(dāng)儀器給出一個以上Tm值時，需參考陽性對照和陰性對照的峰值選擇有效的Tm值，如果樣品濃度較低，出現(xiàn)峰值較低而儀器無法判讀時，通過調(diào)整基線或人工判讀的方法獲得Tm值。其中，陽性對照為致病金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素常用的陽性對照品，陰性對照為滅菌水。
本發(fā)明實施例提供的同時檢測金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的檢測方法，將多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)和熒光探針熔解曲線技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行檢測，通過溶解曲線分析可同時實現(xiàn)金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的高通量檢測，從而有效縮短了金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的檢測周期，提高了金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的檢測效率和準(zhǔn)確性，靈敏度高。具體的，本發(fā)明實施例先進(jìn)行雜交連接反應(yīng)，將靶基因的信息轉(zhuǎn)移至雜交鏈接探針上，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測和熔解曲線分析，由于雜交鏈接探針用量極低(10nM)大大減少了非特異擴(kuò)增產(chǎn)物，能夠僅使用一對通用引物和一條熒光探針就實現(xiàn)了6個靶基因的檢測。
現(xiàn)以具體的基于熒光探針熔解曲線法同時檢測金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的試劑盒和同時檢測金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的方法為例，對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
實施例1
一種基于熒光探針熔解曲線法同時檢測金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的試劑盒。該試劑盒包括：
1.通用引物，如表1中的所述Q ID NO：1和SEQ ID NO：2；
2.熒光探針，如表1中的Q ID NO：3；
3.根據(jù)金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素特異性基因設(shè)計的雜交連接探針，其中，金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素、各金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素特異性基因和各金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素雜交連接探針序列分別如表2中所示。
實施例2
一種基于熒光探針熔解曲線法同時檢測金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的試劑盒。該試劑盒包括：
1.通用引物，如表1中的所述Q ID NO：1和SEQ ID NO：2；
2.熒光探針，如表1中的Q ID NO：3；
3.根據(jù)金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素特異性基因設(shè)計的雜交連接探針，其中，金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素、各自特異性基因和各自雜交連接探針序列分別如表2中所示。
4.雜交連接反應(yīng)試劑體系，如上文表3中所示；
5.熒光探針熔解曲線檢測試劑體系，如上文表4中所示。
實施例3
一種基于熒光探針熔解曲線法同時檢測金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的試劑盒。該試劑盒包括：
1.通用引物，如表1中的所述Q ID NO：1和SEQ ID NO：2；
2.熒光探針，如表1中的Q ID NO：3；
3.根據(jù)金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素特異性基因設(shè)計的雜交連接探針，其中，金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素、各自特異性基因和各自雜交連接探針序列分別如表5中所示。
4.雜交連接反應(yīng)試劑體系，如上文表3中所示；
5.熒光探針熔解曲線檢測試劑體系，如上文表4中所示。
表5
實施例4
一種同時檢測金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的方法。該方法包括如下步驟：
S11.引物和探針制備：
首先篩選出熔點溫度差異明顯的標(biāo)簽序列，根據(jù)表5中所示的金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的特異性基因序列按照多重連接反應(yīng)探針設(shè)計原則設(shè)計雜交連接探針，設(shè)計完成的引物和探針均用blast比對保證其特異性，所有引物探針序列均由上海生工生物工程有限公司合成，引物和探針序列見表1和表5所示，如上文實施例3中基于熒光探針熔解曲線法同時檢測金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的試劑盒。
S12.提取可疑菌落的核酸DNA：
采用熱裂解法提取待測物中可疑菌的DNA。向1.5mlEP管中加入200μL tris-HCLEDTA(TE,pH 8.8)，從金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素顯色平板上挑選可疑菌落到EP管中，震蕩混勻，于沸水浴中熱裂解5min。12,000rpm離心3min,取上清液作為模板。
S13.雜交鏈接反應(yīng)：
連接體系總體積為10μL，反應(yīng)體系如上文表3示，首先用移液槍吸取1.5μL雜交連接探針混合液到八聯(lián)管中，取待測樣本數(shù)為n，向八聯(lián)管中加入n+1份，將八聯(lián)管移至模板加樣區(qū)，并向管內(nèi)加入樣本DNA 5μL，其中一份加入5μL滅菌水作為陰性對照，整個反應(yīng)在Biometra T3PCR儀上運(yùn)行，反應(yīng)程序如下：98℃5min，75℃pause，75℃暫停取出，然后再加入含有Ligase即Ligase buffer的反應(yīng)體系，每管內(nèi)3.5μL(包括：Ligase：1μL Ligase buffer:1μL滅菌水：1.5μL)，震蕩混勻，放置在于在Biometra T3PCR儀上，于60℃反應(yīng)80min,98℃變性5min，產(chǎn)物作為后續(xù)PCR反應(yīng)模板。
S14.PCR和熔解曲線分析：
熒光探針熔解曲線體系總體積50μL，具體見表4所示，反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3min；然后經(jīng)95℃變性5s，退火58℃，15s同時采集熒光信號，延伸74℃，15s,40個循環(huán)，熔解曲線程序為：95℃變性30s，40℃雜交1min,從40℃-82℃逐步升溫每上升0.5℃采集一次熒光信號，整個反應(yīng)在BIO RAD CFX96real time PCR儀器上運(yùn)行。
Tm值的測定是以BIORAD CFX96real time PCR儀器為準(zhǔn)。檢測結(jié)果判定時，Tm值以儀器自動判讀為準(zhǔn)，當(dāng)儀器給出一個以上Tm值時，需參考陽性對照和陰性對照的峰值選擇有效的Tm值，如果樣品濃度較低，出現(xiàn)峰值較低而儀器無法判讀時，通過調(diào)整基線或人工判讀的方法獲得Tm值。
結(jié)果判讀：
根據(jù)產(chǎn)物溶解峰的溫度和形狀差異，確定是哪一種金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素。
熒光探針熔解曲線體系各個通道檢測基因名稱和Tm值范圍如下：
ROX通道共檢測6個基因，分別是E型腸毒素：Tm值54.0±1℃，D型腸毒素：Tm值57.5±1℃，nuc基因：Tm值62.5±1℃，C型腸毒素：Tm值66.0±1℃，B型腸毒素：Tm值70.0±1℃，A型腸毒素：Tm值74.5±1℃。
本實施例4利用上述實施例3提供的基于熒光探針熔解曲線法同時檢測金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的試劑盒在多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)的基礎(chǔ)上采用實時熒光PCR熔解曲線法實現(xiàn)快速、簡便和高通量的對金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素同時檢測，從而有效提高了從而有效縮短了金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的檢測周期，提高了金黃色葡萄球菌及其5種腸毒素的檢測效率，靈敏度高。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。