專利名稱：金黃色葡萄球菌檢測方法及其金標(biāo)快速診斷試劑盒和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測金黃色葡萄球菌的方法，以及用于該方法的金黃色葡萄 球菌金標(biāo)快速診斷試劑盒和制備方法。
背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌在自然界中無處不在，空氣、水、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中都可 找到金黃色葡萄球菌。因此，食品受其污染的機(jī)會(huì)很多。近年來，美國疾病控制中心報(bào)告顯 示，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌。金黃色葡萄球菌腸毒素的檢 測是世界性的衛(wèi)生難題。在美國，由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒，占整個(gè)細(xì)菌性 食物中毒的33%，加拿大則更多，占到45%，而我國每年發(fā)生的此類中毒事件也非常多。金黃色葡萄球菌的流行病學(xué)一般有如下特點(diǎn)金黃色葡萄球菌的感染多見于春夏 兩季；中毒食品種類多如奶、肉、蛋、魚及其制品。此外，因食剩飯、油煎蛋、糯米糕及涼粉 等引起的金黃色葡萄球菌中毒事件也有報(bào)道。上呼吸道感染患者鼻腔帶菌率高達(dá)83%，所 以人、畜化膿性感染部位，常成為污染源。一般情況，經(jīng)黃色葡萄球菌可通過以下途徑污染食品i因食品加工人員、炊事員 或銷售人員帶菌，而造成食品污染；ii食品在加工前本身帶菌，或在加工過程中受到了污 染，產(chǎn)生了腸毒素，引起食物中毒；iii熟食制品包裝部密封，或運(yùn)輸過程中所引起的污染 iv因奶?；蓟撔匀橄傺谆蚯菪缶植炕摃r(shí)，對肉體其它部位的污染。金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的病原菌。它可引起局部化膿感染，也 可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。同時(shí)，該菌的自然來 源非常廣泛，并且目前對其致病機(jī)制還不是很清楚。傳統(tǒng)的檢測方法主要有動(dòng)物試驗(yàn)、血清 學(xué)試驗(yàn)、免疫熒光檢測試驗(yàn)及酶聯(lián)免疫吸附等方法。雖然近年來相關(guān)檢測技術(shù)取得了很大 的進(jìn)展，但仍然存在一些缺陷。所以，進(jìn)一步研究該菌的快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測方法對食源 性致病菌感染的控制、疾病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查非常關(guān)鍵。本發(fā)明采用金黃色葡萄球菌免疫家兔或羊制備多表位抗體，免疫BALB/C小鼠制 備單克隆抗體，研制一種可適用于現(xiàn)場操作的金標(biāo)快速診斷試劑盒。本試劑盒可快速(5-20 分鐘出結(jié)果)特異性的檢測出金黃色葡萄球菌，可用于發(fā)病現(xiàn)場快速診斷。本發(fā)明的公開本發(fā)明的第一目的是提供一種金黃色葡萄球菌的檢測方法。該方法為一步檢測 法，靈敏度高、特異性強(qiáng)，反應(yīng)速度快、操作簡便，無需專門設(shè)備。該試劑盒可用于臨床檢測、 流行病學(xué)調(diào)查和場地檢疫等多種場合。本發(fā)明的第二目的是提供一種金黃色葡萄球菌金標(biāo)快速診斷試劑盒。該試劑盒 針對金黃色葡萄球菌檢測，提供一種簡便而且直接的一步法檢測試劑盒。利用該試劑盒檢 測金黃色葡萄球菌的靈敏度高、特異性強(qiáng)，反應(yīng)速度快、操作簡便，無需專門設(shè)備。本發(fā)明的第三目的是提供一種金黃色葡萄球菌金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法。該方法操作簡便、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好。本發(fā)明的第一目的可通過如下措施來實(shí)現(xiàn)一種金黃色葡萄球菌檢測方法包括以下步驟(1)將膠體金標(biāo)記的抗金黃色葡萄 球菌抗體，包括多抗或單抗載于玻璃纖維或無紡布載體上，然后與膠體金標(biāo)記抗體載體相 連，檢測載體上包被抗金黃色葡萄球菌抗體(單抗和多抗)形成的檢測線和由羊、兔抗鼠 IgG抗體形成的控制線；( 取樣品稀釋液滴于膠體金標(biāo)記抗體的載體上。如上述稀釋液含 有金黃色葡萄球菌，則在檢測載體上出現(xiàn)紫紅色檢測線和控制線雙線，該檢測結(jié)果判定為 陽性，若僅有一條紅色質(zhì)控線，則檢測結(jié)果為陰性。本發(fā)明的第二目的可通過如下措施來實(shí)現(xiàn)一種金黃色葡萄球菌金標(biāo)快速診斷試劑盒，內(nèi)設(shè)金黃色葡萄球菌金標(biāo)檢測卡組 成。檢測卡由檢測條和塑料卡盒組成，檢測條安裝在塑料卡內(nèi)。所述的金黃色葡萄球 菌金標(biāo)檢測條是在襯板上設(shè)有加樣端吸水層、檢測層和吸水端吸水層，在檢測層和加樣端 吸水層之間設(shè)有金標(biāo)抗金黃色葡萄球菌抗體層，在檢測層上包被有由抗金黃色葡萄球菌多 抗或單抗形成的檢測線和由羊、兔抗鼠IgG抗體形成的控制線。本發(fā)明的第三目的可通過如下措施來實(shí)現(xiàn)一種金黃色葡萄球菌金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法；主要包括制備金標(biāo)抗體層 和檢測層的控制線和檢測線。然后再襯板上組合金黃色葡萄球菌金標(biāo)測試條和檢測板。所述的金標(biāo)抗體層的制備方法包括下述步驟i膠體金的制備；在濃度為 0. 006-0. 012%的氯金酸中加入其體積的1. 5-2%、濃度為的檸檬酸三鈉，煮沸10-20 分鐘，可得到15-50納米的膠體金溶液；ii膠體金標(biāo)記抗金黃色葡萄球菌抗體在膠體金溶 液中用0. 2M碳酸鉀溶液調(diào)pH7. 8-8. 8，按Hmg/lOOml加入金黃色葡萄球菌抗體，攪拌后 在溶液中加入濃度為0. 1-0. 6G/100ml的動(dòng)物血清蛋白，4°C靜置2_4小時(shí)；iii將上述膠 體金溶液經(jīng)2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10-15分鐘，棄沉淀物，收集上清液；iv將上清液經(jīng)10000 轉(zhuǎn)/分鐘離心60-80分鐘，離心得沉淀物；ν將沉淀物溶于0. 02M、pH7. 4Tris-HCI的體積 為4-10ml的緩沖液，得膠體金溶液。該緩沖液中含體積比為0. 2-0. 6%的動(dòng)物血清蛋白和 0. 01-0. 06%疊氮鈉；Vi將玻璃纖維或無紡布浸入膠體金溶液至液體滲出為止，37°C干燥 過夜形成金標(biāo)抗體層。所述的檢測層的制備，是在硝酸纖維素膜上設(shè)有金黃色葡萄球菌抗 體構(gòu)成的檢測線和有羊、兔抗鼠IgG抗體形成的控制線。其制備方法是在濃度為1-ang/ ml的抗體溶液中加入1-3%的固定劑，再利用噴膜機(jī)將抗體噴在纖維素膜上，噴膜后37°C 干燥。然后用0. 01M、pH7. O含10%小牛血清的PBS。在37°C下封閉30分鐘，0. 01M、pH7. O 的PBS漂洗，37 °C干燥。所述的固定劑選用甲醛、丙酮中的一種。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明檢測、診斷金黃色葡萄球菌的方法為一步法。具有較高的特異性和靈敏 性，且操作簡便，無需專門設(shè)備與設(shè)施。2、本發(fā)明的診斷試劑盒檢測金黃色葡萄球菌時(shí)具有較高的特異性和靈敏性。檢測 過程操作迅速、快捷、方便，本試劑盒適用于臨床檢驗(yàn)、流行病學(xué)調(diào)查和場地檢疫等多種場合。
3.本發(fā)明的診斷試劑盒的制備方法簡便、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好。圖面說明

圖1是發(fā)明檢測板的外觀結(jié)構(gòu)示意圖1-檢測板 2-加樣孔 3-檢視窗圖2是本發(fā)明檢測板的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖4-加樣端吸水層 5-金標(biāo)抗體層 6-控制線 7-檢測線8-檢測層 9-吸水端吸水層 10-襯板本發(fā)明的實(shí)施方式本發(fā)明還將結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步詳述實(shí)施例一一種金黃色葡萄球菌檢測方法包括以下步驟(1)將膠體金標(biāo)記的抗金黃色葡萄 球菌抗體載于玻璃纖維或無紡布載體上，將膠體金標(biāo)記的抗體載體相連的檢測載體上，并 在與膠體金標(biāo)記抗體載體相連的檢測載體上包被金黃色葡萄球菌抗體形成的檢測線和由 羊、兔抗鼠IgG抗體形成的控制線；( 取樣品稀釋液滴于膠體金標(biāo)記抗體的載體上，如上 述稀釋液含有金黃色葡萄球菌，則在檢測載體上形成紫紅色檢測線、控制線雙線；顯雙線結(jié) 果判定為陽性，僅控制線顯色結(jié)果判定為為陰性。參照圖1，一種金黃色葡萄球菌金標(biāo)快速診斷試劑盒，內(nèi)設(shè)金黃色葡萄球菌抗標(biāo)檢 測卡1。參照圖2，本權(quán)利要求書中說書的金黃色葡萄球菌金標(biāo)檢測卡1，是在襯板10上設(shè) 有加樣端吸水層4、檢測層8和吸水端吸水層9。在檢測層和加樣端吸水層9之間設(shè)有金標(biāo) 金黃色葡萄球菌抗體層5，在檢測層8上包被有檢測線7和控制線6。其中加樣端吸水層4 和吸水端吸水層9是由多層濾紙制成；檢測層8為纖維素膜，纖維素膜可為硝酸纖維素膜、 醋酸纖維素膜；金標(biāo)抗體層為玻璃纖維或無紡布浸取膠體金標(biāo)記抗體制成。一種金黃色葡萄球菌金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法主要包括制備金標(biāo)抗體層 (5)和檢測層(8)、控制線(6)和檢測線(7)的包被，然后再襯板(10)上組合金黃色葡萄球 菌金標(biāo)測試條和檢測卡(1)。在塑料墊板10的兩端分別粘貼加樣端吸水層4和吸水端吸 水層9 ；在其中段粘貼包被檢測線和控制線的纖維素膜層8，在加樣端吸水層4與纖維素膜 層8的交接部位，夾貼含金標(biāo)抗體5的玻璃纖維，玻璃纖維的4/5部分在加樣端吸水層4中 間，1/5部分在纖維素膜層8上。然后按4毫米寬、8厘米長規(guī)格切條，在組裝于塑料盒內(nèi)。 盒蓋上加樣孔2正對測試條的加樣端吸水層4，觀察孔3正對纖維素膜的檢測層8。所述的金標(biāo)抗體層的制備方法包括下述步驟i膠體金的制備取IOOmg氯金酸溶 于IOOOml三蒸水中，然后加入15ml、濃度為的檸檬酸三鈉，煮沸15分鐘，冷卻后得到 15-50納米的膠體金溶液；ii膠體金標(biāo)記金黃色葡萄球菌抗體；量取IOOml膠體金溶液，用 0. 2ml碳酸鉀溶液調(diào)pH8. 6，加入^ig金黃色葡萄球菌抗體，攪拌20分鐘，然后加入MOmg 牛血清白蛋白，繼續(xù)攪拌5分鐘，4°C靜置2-4小時(shí)；iii將上述膠體金溶液經(jīng)2000轉(zhuǎn)/分 鐘離心10分鐘，棄沉淀物，收集上清液；iv將上清液經(jīng)10000轉(zhuǎn)/分鐘離心60分鐘，收集 沉淀物；ν將沉淀物按4-10ml/100ml溶于0. 02M、pH7. 4Tris_HCI緩沖液得膠體金溶液，該 緩沖液中含0. 25%的牛血清白蛋白和0. 02%疊氮鈉；vi將玻璃纖維或無紡布浸入膠體金 溶液至其表面有液體滲出為止；在37°C下干燥2小時(shí)而形成金標(biāo)抗體層5。本權(quán)利要求書所述膠體金標(biāo)記抗體為羊、兔抗金黃色葡萄球菌抗體。所述的檢測層8是在硝酸纖維素膜上設(shè)有金黃色葡萄球菌抗體構(gòu)成的檢測線7和 有羊或兔抗鼠IgG抗體形成的控制線6。其制備方法是取抗金黃色葡萄球菌抗體，調(diào)濃度至 lmg/ml，加入2%的甲醛，用噴膜機(jī)在纖維素膜中段噴檢測線7;再取兔、羊抗鼠IgG，然后調(diào) 濃度至2mg/ml，再加入2%的甲醛。用噴膜機(jī)在纖維素膜中段，距檢測線0. 5cm處，噴控制 線6，按ul/lOcm設(shè)置噴膜量，噴膜后置于37°C干燥2小時(shí)，再用0. 01M、pH7. O含10%小牛 血清的PBS，在37°C下封閉30分鐘，0. 01M、pH7. O的PBS漂洗，37 °C干燥。實(shí)施例二 金黃色葡萄球菌檢測方法及其金標(biāo)快速診斷試劑盒與例一同。該試劑盒的制備方法除制備膠體金標(biāo)記的抗體為抗金黃色葡萄球菌單克隆抗體 外，其他條件與例一同。
權(quán)利要求
1.一種金黃色葡萄球菌檢測方法，其特征在于(1)將膠體金標(biāo)記的金黃色葡萄球菌 抗體載于玻璃纖維或無紡布載體上，并與膠體金標(biāo)記抗體載體相連的檢測載體上包被抗金 黃色葡萄球菌抗體(多抗或單抗)，所形成的檢測線和由羊或兔抗鼠IgG抗體形成的控制 線。( 取檢測樣本稀釋液滴于膠體金標(biāo)記抗體的載體上。如果被檢測物含有金黃色葡萄 球菌則含在檢測載體上形成檢測線和控制線雙線，則檢測結(jié)果判定為陽性，若僅有控制線 顯色則檢測結(jié)果為陰性。
2.一種金黃色葡萄球菌金標(biāo)快速診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒內(nèi)設(shè)金黃色葡萄球 菌金標(biāo)檢測卡，檢測卡由檢測條和塑料卡盒組成，檢測條安裝在塑料卡內(nèi)。
3.如權(quán)利要求2所述的金黃色葡萄球菌金標(biāo)快速診斷試劑卡，其特征在于所述的金黃 色葡萄球菌抗原金標(biāo)檢測卡(1)是在襯板(10)上設(shè)有加樣端吸水層G)、檢測層(8)和吸 水端吸水層(9)，在檢測層(8)和加樣端吸水層(4)之間設(shè)有金標(biāo)金黃色葡萄球菌抗體層 (5)，在檢測層(8)上包被有檢測線(7)和控制線(6)。
4.如權(quán)利要求( 所述的金黃色葡萄球菌金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在 于制備金標(biāo)抗體層(5)和檢測層(8)的控制線(6)、檢測線(7)的包被，然后在襯板(10)上 組合金黃色葡萄球菌金標(biāo)測試條和檢測卡(1)。
5.如權(quán)利要求4所述的金黃色葡萄球菌金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在 于所述的金標(biāo)抗體層(5)的制備方法包括下述步驟i膠體金的制備，在濃度為0.006 0. 012%的氯金酸中加入其體積的1. 5 2%、濃度為1 3%的檸檬酸三鈉，煮沸10 20 分鐘，可得到15 50納米的膠體金溶液；ii膠體金標(biāo)記抗金黃色葡萄球菌單克隆抗體，在 膠體金溶液中用0. 2m碳酸鉀溶液調(diào)pH7. 8 8. 8，按1 ％ig/100ml加入抗人金黃色葡萄 球菌單克隆抗體，攪拌后，再在溶液中按0. 1 0. 6g/100ml加入動(dòng)物血清蛋白，4°C靜置2_4 小時(shí)；iii將上述膠體金溶液經(jīng)2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10 15分鐘，棄沉淀物，得上清液；iv 將上清液經(jīng)10000轉(zhuǎn)/分鐘離心60 80分鐘離心得沉淀物；ν將沉淀物按4-10ml/100ml 溶于0. 02M、pH7. 4Tris-HCI緩沖液得膠體金溶液，該緩沖液中含0. 2-0. 6%的動(dòng)物血清蛋 白和0. 01-0. 06%疊氮鈉；vi將上述膠體金溶液浸入玻璃纖維或無紡布至液體開始滲出為 止，37 °C干燥過濾形成金標(biāo)抗體層。
6.如權(quán)利要求4或5所述的金黃色葡萄球菌金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法，其特征 在于所述膠體金標(biāo)記抗體為羊或兔抗金黃色葡萄球菌抗體或金黃色葡萄球菌單克隆抗體。
7.如權(quán)利要求4所述的金黃色葡萄球菌金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于 所述的檢測層(8)是在纖維素膜上設(shè)有羊或兔金黃色葡萄球菌抗體或金黃色葡萄球菌單 克隆抗體構(gòu)成的檢測線(7)和由抗羊或兔抗鼠IgG抗體形成的控制線(6)。
8.如權(quán)利要求7所述的金黃色葡萄球菌金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于 所述的固定劑為甲醛或丙酮。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測金黃色葡萄球菌的方法，以及用于該方法的金標(biāo)快速診斷試劑盒和其制備方法，其檢測方法包括(1)將膠體金標(biāo)記的抗金黃色葡萄球菌抗體載于玻璃纖維或無紡布載體上，并在與膠體金標(biāo)記抗體載體相連的檢測載體上包被抗金黃色葡萄球菌抗體形成的檢測線和由羊、兔抗鼠IgG抗體形成的控制線；(2)取樣品稀釋液滴于膠體金標(biāo)記抗體的載體上，如上述稀釋液含有金黃色葡萄球菌，則在檢測載體上形成檢測線和控制線雙線，結(jié)果判定為陽性；僅控制線顯色，結(jié)果判定為陰性。該試劑盒由檢測卡組成，檢測卡由檢測條和塑料卡盒組成，檢測條安裝在塑料卡內(nèi)，檢測條是在襯板上設(shè)有加樣端吸水層、檢測層和吸水端吸水層，在檢測層和加樣端吸水層之間設(shè)有金標(biāo)金黃色葡萄球菌抗體層，在檢測層上包被有由抗金黃色葡萄球菌單抗形成的檢測線和由羊、兔抗鼠IgG抗體形成的控制線。
文檔編號G01N33/543GK102135540SQ201010272889
公開日2011年7月27日 申請日期2010年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月3日
發(fā)明者周海飛, 張遠(yuǎn)興, 李克生, 李志遠(yuǎn), 杜惠芬, 鄭悅, 馬國榮 申請人:李克生