一種檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌活細(xì)胞的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種快速選擇性檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌活細(xì)胞的試劑盒及檢測(cè) 方法。 技術(shù)背景
[0002] 金黃色葡萄球菌是一種需氧或兼性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性菌，在空氣、土壤、水、灰塵 和食品中分布廣泛。奶類、肉類、魚(yú)及其制品等更是金黃色葡萄球菌污染的主要對(duì)象，當(dāng)誤 食該菌數(shù)量達(dá)到1〇 5~1〇6 CFU/g時(shí)可引起食物中毒，造成急性腸胃炎，主要癥狀表現(xiàn)為嘔吐。 據(jù)美國(guó)疾病控制中心報(bào)告，金黃色葡萄球菌引起的食物中毒嚴(yán)重程度僅次于大腸桿菌，占 細(xì)菌性食物中毒的33%，而在加拿大高達(dá)45%。美國(guó)每年由金黃色葡萄球菌引起的住院病例 平均為292000例，日本的調(diào)查結(jié)果也表明平均32. 5%的食品存在金黃色葡萄球菌的污染。 我國(guó)金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件也比較嚴(yán)重，全國(guó)各地均有報(bào)道，排在細(xì)菌性食 物中毒的第四位。
[0003] 目前金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法仍然是傳統(tǒng)培養(yǎng)法。傳統(tǒng)方法具有勞動(dòng)強(qiáng)度高、 耗時(shí)、費(fèi)用高等缺點(diǎn)，且特異性差，報(bào)告檢測(cè)結(jié)果大約需要4-7天，已不能滿足微生物快速 準(zhǔn)確檢測(cè)的現(xiàn)實(shí)需要。因此，迫切需要建立新的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)技術(shù)和方法。
[0004] 近年來(lái)，免疫學(xué)、分子生物學(xué)等方法的應(yīng)用使金黃色葡萄球菌的檢測(cè)有了長(zhǎng)足的 發(fā)展。但是，如ELISA和免疫熒光法等免疫學(xué)方法在操作程序及特異性方面還不理想；基于 PCR技術(shù)的分子生物學(xué)方法以其特異、快速等優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用，然而普通PCR方法容易造 成假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果，并且難以對(duì)實(shí)際污染濃度進(jìn)行定量。因此，開(kāi)發(fā)準(zhǔn)確且能定量檢測(cè)金黃 色葡萄球菌的方法至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種食品中金黃色葡萄球菌活細(xì)胞 檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)金黃色葡萄球菌活細(xì)胞快速、準(zhǔn)確、特異檢測(cè)。
[0006] 本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的。
[0007] 一種運(yùn)用PMA-qPCR選擇性檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌活細(xì)胞的試劑盒，主要包 括金黃色葡萄球菌陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品、DNA熒光染料、DNA聚合酶、PCR反應(yīng)液和PMA 溶液的六個(gè)離心管；所述PCR反應(yīng)液含有PCR緩沖液、dNTP，還含有金黃色葡萄球菌特異性 上游引物、下游引物，所述引物序列如下： 上游引物：5' -CGATTGATGGTGATACGGTT-3' 下游引物：5' -GCACTTGCTTCAGGACCAT-3' ； 所述金黃色葡萄球菌陽(yáng)性對(duì)照品為金黃色葡萄球菌重組質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品，序列如下： cgattgatggtgatacggttaaattaatgtacaaaggtca aacaatgacattcagactattattggttgatacacc tgaaacaaagcatcctaaaaaaggtgtagagaaatatggtcctgaagcaagtgc〇
[0008] 1、根據(jù)編碼金黃色葡萄球菌編碼耐熱核酸酶的nuc基因 （GenBank :DQ507382. 1) 設(shè)計(jì)并合成特異性引物，其序列如下： 上游引物：5' -CGATTGATGGTGATACGGTT-3' ； 下游引物：5' -GCACTTGCTTCAGGACCAT-3'。
[0009] 2、PMA處理待測(cè)樣品：用終質(zhì)量濃度為5 μ g/mL的PM和待測(cè)樣混勻后室溫避光 5 min，每隔30 s搖勾一次，鹵素?zé)羝毓? min，光照交聯(lián)時(shí)樣品置于冰上，交聯(lián)后的懸浮液 離心，所得沉淀用熱裂解煮沸法提取待測(cè)樣品DNA。
[0010] 3、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品即陽(yáng)性對(duì)照的制備：上述引物的PCR陽(yáng)性產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電 泳，切下目的條帶并回收純化，將產(chǎn)物連接到T載體上構(gòu)建成質(zhì)粒。提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，稀 釋到適當(dāng)?shù)臐舛燃醋鳛殛?yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。
[0011] 4、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：為了達(dá)到定量檢測(cè)的效果，將上述陽(yáng)性質(zhì)粒5 μ L，按10倍梯 度稀釋，依次稀釋5-7個(gè)梯度。以梯度陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品及PMA處理后的待測(cè)樣DNA在相同條件 下進(jìn)行qPCR反應(yīng)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，循環(huán)數(shù)（Ct值）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線。根據(jù)待測(cè)樣測(cè)得的Ct值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得待測(cè)樣中金黃色葡萄球菌活細(xì)胞的準(zhǔn)確 濃度。
[0012] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌活細(xì)胞的方法，其 步驟如下： (1)取食品樣品，加無(wú)菌IXPBS緩沖液研磨成混合物，離心除去大的食物殘?jiān)?，取上?得到菌懸液，整個(gè)過(guò)程均為無(wú)菌操作。
[0013] (2)取制備好的菌懸液加疊氮溴化丙錠溶液，使疊氮溴化丙錠PM的終質(zhì)量濃度 為5 μ g/mL，混勾后室溫避光5 min，每隔30 s搖勾一次，鹵素?zé)羝毓? min，光照交聯(lián)時(shí)樣 品置于冰上，交聯(lián)后的懸浮液離心，所得沉淀用熱裂解煮沸法提取待測(cè)樣品DNA ; (3) 取DNA熒光染料、DNA聚合酶和PCR反應(yīng)液混合，分別加入PMA處理過(guò)的待測(cè)樣品 DNA或者陰性對(duì)照品配成PCR反應(yīng)體系，于同等條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)管置于ABI 7900HT熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光檢測(cè)； 所述PCR反應(yīng)液含有特異性上游引物、下游引物，所述引物序列如下： 上游引物：5' -CGATTGATGGTGATACGGTT-3' 下游引物：5' -GCACTTGCTTCAGGACCAT-3' (4) 設(shè)定閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)；若待測(cè)樣品熒光增長(zhǎng)曲線超過(guò)閾值 線，并呈良好的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，而且Ct值少于35,則判斷為金黃色葡萄球菌陽(yáng)性，即樣本中存在 金黃色葡萄球菌活細(xì)胞。
[0014] 所述步驟（3)中qPCR反應(yīng)體系為：2 UL的DNA熒光染料、2. 5 yL PCR緩沖液、 上、下游引物各0.8 yL、0. 2 yL的DNA聚合酶、2.0 yL的dNTPs、2 yL的模板，雙蒸水補(bǔ) 齊 20 yL。
[0015] 所述步驟（3)中qPCR反應(yīng)體系為：95°C預(yù)變性30 s、95°C變性5 s、58°C退火1 min，40個(gè)循環(huán)。
[0016] 發(fā)明建立了利用qPCR技術(shù)融合核酸交聯(lián)劑特性的方法，檢測(cè)了食品中金黃色葡 萄球菌活細(xì)胞，并經(jīng)檢測(cè)實(shí)際樣本，表明該方法切實(shí)可行。由于本方法使用了能選擇性透過(guò) 死細(xì)胞細(xì)胞膜并與DNA交聯(lián)的PMA，使得檢測(cè)的準(zhǔn)確性大大提高，消除了由于死細(xì)胞導(dǎo)致的 假陽(yáng)性結(jié)果；由于使用了 ABI 7900HT實(shí)時(shí)熒光定量PCR，使得目的菌的檢測(cè)靈敏性更高，而 且可以對(duì)食品中金黃色葡萄球菌活細(xì)胞做到精確定量。
[0017] 綜上所述，本發(fā)明可以快速、準(zhǔn)確、高特異地檢測(cè)食品中的金黃色葡萄球菌活細(xì) 胞，不需要復(fù)雜的儀器，為金黃色葡萄球菌活細(xì)胞的檢測(cè)提供了新的技術(shù)平臺(tái)，可用于基層 醫(yī)療衛(wèi)生單位、食品企業(yè)和各疾病預(yù)防控制中心篩查和檢測(cè)，具有較大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益， 適于大范圍推廣應(yīng)用。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有如下有益效果： 1、 能特異性檢測(cè)金黃色葡