專利名稱：一種檢測金黃色葡萄球菌的膠體金檢測卡及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及金黃色葡萄球菌檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測金黃色葡萄球菌的膠體金檢測卡。
背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌是食品衛(wèi)生微生物常規(guī)檢測項目之一。由于致病金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生腸毒素，故一旦細菌污染食品，并在合適的溫度環(huán)境下，細菌可以大量繁殖并產(chǎn)生腸毒素，從而引起消費者食物中毒。金黃色葡萄球菌在自然界中無處不在，空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可找到。因而，食品受其污染的機會很多。據(jù)美國疾病控制中心報告，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌。金黃色葡萄球所引起的中毒事件已成為世界性的公 共衛(wèi)生問題，在美國由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒，占整個細菌性食物中毒的33%，加拿大則更多，占到45%，我國每年發(fā)生的此類中毒事件也非常多，由此造成的經(jīng)濟損失也相當慘重，所以目前世界各國都把金黃色葡萄球菌列為食品衛(wèi)生的法定檢測項目。常規(guī)方法檢測食品中金黃色葡萄球菌首先要根據(jù)樣品進行富集培養(yǎng)，使被檢測金黃色葡萄球菌的數(shù)量在樣品中達到可檢測的水平，然后才能根據(jù)食品微生物研究法進行金黃色葡萄球菌的分離，形態(tài)特征觀察及一系列生理生化特性鑒定，通常這種檢測時間需要5天-7天，操作繁瑣、檢測時間長，不能滿足食品衛(wèi)生監(jiān)管部門對食物中毒病原菌的快速檢測、預(yù)警及應(yīng)對突發(fā)公共衛(wèi)生事件的需要。因此，研究開發(fā)金黃色葡萄球菌快速檢測技術(shù)成為近年來的重點研究方向。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述中存在的問題與缺陷，本發(fā)明提供了一種檢測金黃色葡萄球菌的膠體金檢測卡，所述技術(shù)方案如下樣品墊、金標抗體結(jié)合墊、NC膜及吸水紙，所述樣品墊、金標抗體結(jié)合墊、NC膜及吸水紙設(shè)置在PVC膠板上。用于檢測金黃色葡萄球菌的膠體金檢測卡的制備方法，所述方法包括A測制膠體金；B制備膠體金標記抗體；C將金標抗體離心純化處理；D將樣品墊和金標抗體結(jié)合墊通過處理液進行水化和封閉處理；E將金標抗體點樣在金標抗體結(jié)合墊上；F將包被抗體金黃色葡萄球菌稀釋，點樣在NC膜上；G將NC膜、吸水紙、金標抗體結(jié)合墊及樣品墊依次粘貼在PVC膠板上。本發(fā)明提供的技術(shù)方案的有益效果是本發(fā)明提供的金黃色葡萄球菌免疫膠體金檢測卡，大大簡化了檢驗程序，縮短了檢測時間，可為食品企業(yè)質(zhì)量控制，工商、衛(wèi)生、質(zhì)監(jiān)等食品安全監(jiān)管部門現(xiàn)場執(zhí)法、日常監(jiān)管及應(yīng)對細菌性食物中毒突發(fā)公共衛(wèi)生事件提供有力技術(shù)支撐，對促進我國食品行業(yè)健康發(fā)展，保障人民健康方面具有重要意義。


圖I是用于檢測金黃色葡萄球菌的膠體金檢測卡的制備方法流程圖；圖2是檢測金黃色葡萄球菌的膠體金檢測卡結(jié)構(gòu)圖。
具體實施例方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明實施方式作進一步地詳細描述參見圖2，一種檢測金黃色葡萄球菌的膠體金檢測卡，包括樣品墊、金標抗體結(jié)合 墊、NC膜及吸水紙，所述樣品墊I、金標抗體結(jié)合墊3、NC膜9及吸水紙5設(shè)置在PVC膠板6上。所述NC膜上設(shè)置有控制線(C線)4和檢測線(T線)8。上述膠體金檢測卡在使用過程中，將樣品滴加在樣品墊上，樣品滴加方向2如圖I中所示，通過層析，層析方向7如圖I所示，層析后通過檢測線控制線(C線)和檢測線(T線)顯示檢測結(jié)果。本實施例還提供了一種用于檢測金黃色葡萄球菌的膠體金檢測卡的制備方法，(如圖2所示)該方法包括步驟10測制膠體金；步驟20制備膠體金標記抗體；步驟30將金標抗體離心純化處理；步驟40將樣品墊和金標抗體結(jié)合墊通過處理液進行水化和封閉處理；步驟50將金標抗體點樣在金標抗體結(jié)合墊上；步驟60將包被抗體金黃色葡萄球菌稀釋，點樣在NC膜上；步驟70將NC膜、吸水紙、金標抗體結(jié)合墊及樣品墊依次粘貼在PVC膠板上。上述步驟可以通過下述具體實施例實現(xiàn)實施例I測制膠體金在冷凝回流裝置中的圓底燒瓶中加入IOOml超純水和lmll%的氯金酸溶液，加熱至沸騰后加入lmll%濃度的檸檬酸三鈉溶液，觀察顏色變化，待顏色穩(wěn)定時繼續(xù)反應(yīng)lOmin，冷卻靜置一天，利用粒度儀檢測制得粒徑為40nm膠體金，其最大吸收峰在526nm。制備股體金標記抗體最少穩(wěn)定蛋白量再增加10%左右為最佳標記蛋白用量。月父體金用O. lmol/L的HCl和K2CO3調(diào)至pH8. 2，取最佳用量金黃色葡萄球菌PBP2a單克隆抗體16μ g/ml、終質(zhì)量濃度為1%的海藻糖同時加入IOOml膠體金溶液，在磁力攪拌器下混合IOmin后，加入終質(zhì)量濃度為O. 5%的BSA，4°C保存過夜后冷凍超速離心純化。將金標抗體離心純化處理首先將金標抗體溶液常溫低速(1500rpm)離心20min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀，取紅色上清溶液于4°C再8000 r/min離心30min。溶液分為三層透明上清，管底可流動的暗紅色沉淀及管底壁上黑色致密的金顆粒層。將可流動的暗紅色沉淀轉(zhuǎn)移到另外一個離心管中，用重懸液重懸至原量，重懸液終質(zhì)量濃度為O. 1%吐溫20、1%海藻糖、O. 5% BSA,O. 01mol/L PBS ρΗ7· 4溶液。重復(fù)離心3次，最后重懸至原體積的1/20，加入O. 1%的疊氮鈉4°C保存?zhèn)溆?。將樣品墊和金標抗體結(jié)合墊通過處理液進行水化和封閉處理樣品墊和結(jié)合墊經(jīng)剪裁后通過浸蘸前處理液進行水化和封閉處理，浸泡30min后37°C、2小時烘干，結(jié)合墊處理液為含有終質(zhì)量濃度為O. 3%%吐溫20、2%海藻糖、10%蔗糖及pH值為7. 4濃度為
0.01mol/L 的 PBS 溶液。將金標抗體點樣在金標抗體結(jié)合墊上金標抗體調(diào)濃度至OD526為5,點樣機將金標抗體在結(jié)合墊上均勻點樣，點樣量在30 μ I/cm2, 37°C真空干燥。 檢測線抗體和控制線二抗的包被將包被抗體金黃色葡萄球菌PBP2a檢測單抗稀釋到O. 7mg/ml，二抗稀釋度為商品化稀釋O. 7 mg/ml倍，點樣在NC膜上分別劃T線和C線，間距為5謹，37°C干燥。試紙條的組裝將2cmX0. 3cmNC膜、I. 8cmX O. 3cm吸水紙、IcmX O. 3cm金標墊、
1.5cmX0. 3cm樣品墊按圖I方式依次粘貼在PVC膠板上，即成金黃色葡萄球菌膠體金試紙條。將金黃色葡萄球菌競標準品按I倍稀釋5倍稀釋10倍稀釋50倍稀釋的濃度依次滴加在金黃色葡萄球菌膠體金試紙條上，用緩沖液作為對照組，觀察實驗結(jié)果。實施例2測制膠體金與上述第一實施例雷同，這里不再詳細描述。制備13父體金標記抗體最少穩(wěn)定蛋白量再增加10%左右為最佳標記蛋白用量。月父體金用O. lmol/L的HCl和K2CO3調(diào)至pH9. 2，取最佳用量金黃色葡萄球菌單克隆抗體16 μ g/ml、終質(zhì)量濃度為0. 5%的海藻糖同時加入IOOml膠體金溶液，在磁力攪拌器下混合IOmin后，加入終質(zhì)量濃度為0. 5%的BSA，4°C保存過夜后冷凍超速離心純化。金標抗體離心純化處理金標抗體溶液常溫低速(1500rpm)離心20min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀，取紅色上清溶液于4°C再10000 r/min離心30min。溶液分為三層透明上清液，管底可流通的暗紅色沉淀及管底壁上黑色致密的金顆粒層。將可流動的暗紅色沉淀轉(zhuǎn)移到另外一個離心管中，用重懸液重懸至原量，重懸液終質(zhì)量濃度為0. 2%吐溫20、2%海藻糖、1%BSA及pH值為7. 4濃度為0. 01mol/L的PBS溶液。重復(fù)離心3次，最后重懸液至原體積的1/20，加入0. 1%的疊氮鈉4°C保存?zhèn)溆?。樣品墊和金標抗體結(jié)合墊通過處理液進行水化和封閉處理樣品墊和結(jié)合墊經(jīng)剪裁后通過浸蘸前處理液進行水化和封閉處理，浸泡30min后37°C、2小時烘干，結(jié)合墊處理液為含有終質(zhì)量濃度為0. 2%吐溫20、1%海藻糖、8%蔗糖及pH值為7. 4濃度為0. Olmol/L的PBS溶液。金標抗體點樣在金標抗體結(jié)合墊上、檢測線抗體和控制線二抗的包被及試紙條的組裝與上述第一實施例雷同，這里不再詳細描述。實施例3測制膠體金與上述第一實施例雷同，這里不再詳細描述。制備膠體金標記抗體最少穩(wěn)定蛋白量再增加10%左右為最佳標記蛋白用量。膠體金用0. lmol/L的HCl和K2CO3調(diào)至pH9. 2，取最佳用量金黃色葡萄球菌單克隆抗體16 μ g/ml、終質(zhì)量濃度為2%的海藻糖同時加入IOOml膠體金溶液,在磁力攪拌器下混合IOmin后，加入終質(zhì)量濃度為O. 5%的BSA，4°C保存過夜后冷凍超速離心純化。金標抗體離心純化處理首先將金標抗體溶液常溫低速(1500rpm)離心20min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀，取紅色上清溶液于4°C在12000 r/min離心30min。溶液分為三層透明上清，管底可流動的暗紅色沉淀及管底壁上黑色致密的金顆粒層。將可流動的暗紅色沉淀轉(zhuǎn)移到另外一個離心管中，用重懸液重懸至原量，重懸液終質(zhì)量濃度為O. 5%吐溫20、3%海藻糖、2% BSA及pH值為7. 4濃度為O. 01mol/L的PBS溶液。重復(fù)離心3次，最后重懸至原體積的1/20，加入O. 1%的疊氮鈉4°C保存?zhèn)溆?。樣品墊和金標抗體結(jié)合墊通過處理液進行水化和封閉處理樣品墊和結(jié)合墊經(jīng)剪裁后通過浸蘸前處理液進行水化和封閉處理，浸泡30min后37°C、2小時烘干，結(jié)合墊處理
液為含有終質(zhì)量濃度為O. 5%吐溫20、3%海藻糖、6%蔗糖及pH值為7. 4濃度為O. Olmol/L的PBS溶液。金標抗體點樣在金標抗體結(jié)合墊上、檢測線抗體和控制線二抗的包被及試紙條的組裝與上述第一實施例雷同，這里不再詳細描述。實施例4測制膠體金與上述第一實施例雷同，這里不再詳細描述。制備13父體金標記抗體最少穩(wěn)定蛋白量再增加10%左右為最佳標記蛋白用量。月父體金用O. lmol/L的HCl和K2CO3調(diào)至pH9. 2，取最佳用量金黃色葡萄球菌單克隆抗體16 μ g/ml、終質(zhì)量濃度為I. 5%的海藻糖同時加入IOOml膠體金溶液,在磁力攪拌器下混合IOmin后，加入終質(zhì)量濃度為O. 5%的BSA，4°C保存過夜后冷凍超速離心純化。金標抗體離心純化處理金標抗體溶液常溫低速(1500rpm)離心20min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀，取紅色上清溶液于4°C再12000 r/min離心30min。溶液分為三層透明上清液，管底可流通的暗紅色沉淀及管底壁上黑色致密的金顆粒層。將可流動的暗紅色沉淀轉(zhuǎn)移到另外一個離心管中，用重懸液重懸至原量，重懸液終質(zhì)量濃度為O. 3%吐溫20、2. 5%海藻糖、I. 5%BSA及pH值為7. 4濃度為O. 01mol/L的PBS溶液。重復(fù)離心3次，最后重懸液至原體積的1/20，加入0. 1%的疊氮鈉4°C保存?zhèn)溆?。樣品墊和金標抗體結(jié)合墊通過處理液進行水化和封閉處理樣品墊和結(jié)合墊經(jīng)剪裁后通過浸蘸前處理液進行水化和封閉處理，浸泡30min后37°C、2小時烘干，結(jié)合墊處理液為含有終質(zhì)量濃度為0. 3%吐溫20、2. 5%海藻糖、5%蔗糖及pH值為7. 4濃度為0. Olmol/L的PBS溶液。金標抗體點樣在金標抗體結(jié)合墊上、檢測線抗體和控制線二抗的包被及試紙條的組裝與上述第一實施例雷同，這里不再詳細描述。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種檢測金黃色葡萄球菌的膠體金檢測卡，其特征在于，所述膠體金檢測卡包括樣品墊、金標抗體結(jié)合墊、NC膜及吸水紙，所述樣品墊、金標抗體結(jié)合墊、NC膜及吸水紙設(shè)置在PVC膠板上。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測金黃色葡萄球菌的膠體金檢測卡，其特征在于，所述NC膜上設(shè)置有控制線和檢測線。
3.檢測金黃色葡萄球菌的膠體金檢測卡的制備方法，其特征在于，所述方法包括 A測制膠體金； B制備膠體金標記抗體； C將金標抗體離心純化處理； D將樣品墊和金標抗體結(jié)合墊通過處理液進行水化和封閉處理； E將金標抗體點樣在金標抗體結(jié)合墊上； F將包被抗體金黃色葡萄球菌稀釋，點樣在NC膜上； G將NC膜、吸水紙、金標抗體結(jié)合墊及樣品墊依次粘貼在PVC膠板上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測金黃色葡萄球菌的膠體金檢測卡的制備方法，其特征在于，所述步驟A具體包括將純水和氯金酸溶液加熱至沸后加入檸檬酸三鈉溶液進行反應(yīng)并冷卻，檢測制取粒徑為40nm膠體金。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測金黃色葡萄球菌的膠體金檢測卡的制備方法，其特征在于，所述步驟B具體包括取金黃色葡萄球菌單克隆抗體16ug/ml、終質(zhì)量濃度為O.5 3%的海藻糖及IOOmL膠體金溶液進行混合，在混合后的溶液中加入終質(zhì)量濃度為O.5%的BSA，獲得金標抗體溶液，并進行冷凍離心純化處理。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測金黃色葡萄球菌的膠體金檢測卡的制備方法，其特征在于，所述步驟C具體包括將金標抗體溶液在常溫低速離心20min,取溶液中的上清液并離心30min ;所述溶液包括三層透明上清液、管底暗紅色沉淀液及管底壁上黑色金顆粒層； 取管底暗紅色沉淀液，并在暗紅色沉淀液中加入重懸液重懸；所述重懸液為終質(zhì)量濃度為O. 1% O. 5%吐溫20、1% 3%海藻糖、O. 5% 2%BSA及pH值為7. 4濃度為O. Olmol/L的PBS溶液； 對重懸液進行離心處理，并在離心處理后的重懸液中加入O. 1%的疊氮鈉，且溫度為4°C條件下保存。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測金黃色葡萄球菌的膠體金檢測卡的制備方法，其特征在于，所述步驟D中對樣品墊和金標抗體結(jié)合墊通過處理液進行水化和封閉處理包括將處理液在溫度為37°C環(huán)境下浸泡2小時并烘干；所述處理液為含有終質(zhì)量濃度為O.2% O. 5%吐溫20、1% 3%海藻糖、5% 10%蔗糖及pH值為7. 4濃度為O. 01mol/L的PBS溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測金黃色葡萄球菌的膠體金檢測卡的制備方法，其特征在于，所述步驟E具體包括將濃度至OD526為5的金標抗體均勻點樣在結(jié)合墊上，并在溫度為37°C下真空干燥；所述點樣量為30 μ 1/cm2。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測金黃色葡萄球菌的膠體金檢測卡的制備方法，其特征在于，所述步驟F中包被抗體金黃色葡萄球菌稀釋包括單抗稀釋和二抗稀釋，其中，單抗稀釋到O. 7 mg/ml，二抗稀釋到O. 7 mg/ml，并將單抗稀釋和二抗稀釋后的金黃色葡萄球菌點樣在NC膜上，分別劃T線和C線，在溫度為37°C下干燥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測金黃色葡萄球菌的膠體金檢測卡及其制備方法，所述方法包括測制膠體金；制備膠體金標記抗體；將金標抗體離心純化處理；將樣品墊和金標抗體結(jié)合墊通過處理液進行水化和封閉處理；將金標抗體點樣在金標抗體結(jié)合墊上；將包被抗體金黃色葡萄球菌稀釋，點樣在NC膜上；將NC膜、吸水紙、金標抗體結(jié)合墊及樣品墊依次粘貼在PVC膠板上。本發(fā)明大大簡化了檢驗程序，縮短了檢測時間，可為食品企業(yè)質(zhì)量控制，工商、衛(wèi)生、質(zhì)監(jiān)等食品安全監(jiān)管部門現(xiàn)場執(zhí)法、日常監(jiān)管及應(yīng)對細菌性食物中毒突發(fā)公共衛(wèi)生事件提供有力技術(shù)支撐，對促進我國食品行業(yè)健康發(fā)展，保障人民健康方面具有重要意義。
文檔編號G01N33/577GK102818894SQ20121023635
公開日2012年12月12日 申請日期2012年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月9日
發(fā)明者賈東芬, 韓琰旭, 崔德鵬, 陳發(fā)榮 申請人:北京六角體科技發(fā)展有限公司