專利名稱：?jiǎn)岱?氯胺酮膠體金法毒品檢測(cè)試卡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種二合一毒品檢測(cè)試卡。
背景技術(shù)：
近年來(lái)吸毒人數(shù)均呈上升趨勢(shì)，從我國(guó)公安部禁毒委員會(huì)了解到，截止到目前為 止，全國(guó)吸毒人數(shù)僅登記注冊(cè)的就達(dá)近100萬(wàn)人。其中70%—80%吸食嗎啡、海洛因、鴉片 類，其余20%-30%吸食氯胺酮和搖頭丸。保守估計(jì)我國(guó)吸毒人數(shù)在300-500萬(wàn)人。海洛因、 嗎啡等鴉片類毒品是罌粟膠質(zhì)中的提取物或衍生物，在體內(nèi)經(jīng)過(guò)代謝可以轉(zhuǎn)變成嗎啡和嗎 啡代謝物。因此尿液中嗎啡和嗎啡代謝物的存在表明尿樣提供者體內(nèi)存在鴉片類毒品。氯 胺酮用作毒品時(shí)稱為K粉，具有一定的精神依賴性。近年來(lái)在娛樂(lè)場(chǎng)所濫用日趨嚴(yán)重，嚴(yán)重 威脅健康。人體服用的氯胺酮有70%—90%在肝內(nèi)代謝并經(jīng)尿液排出，一般在吸食后2 -4小時(shí)內(nèi)即可被檢出。隨著我國(guó)禁毒工作的深入，需要接受毒品吸食普查人數(shù)也在成倍的增加。公安部 要求，吸毒人員進(jìn)戒毒所前必須做尿檢，治療期間需追蹤復(fù)查，出戒毒所后每人每年要復(fù)查 6次。以往單一檢測(cè)操作繁瑣、費(fèi)用昂貴的弊端，給緝毒人員在一線工作時(shí)帶來(lái)不便。傳統(tǒng) 的同位素法檢測(cè)對(duì)于操作者及環(huán)境的污染極為嚴(yán)重；酶免疫定量檢測(cè)法需要較復(fù)雜儀器， 不利于犯罪現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種嗎啡_氯胺酮膠體金法毒品檢測(cè)試卡，該毒品檢測(cè)試卡可同步檢 測(cè)氯氨酮、和嗎啡等兩種毒品，并且快速、準(zhǔn)確和節(jié)省檢材。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明由一個(gè)封閉的塑料外殼包裝而成，該外殼的上層開(kāi)有顯色孔和加樣孔，在外殼 內(nèi)腔裝有磁白板，磁白板上覆有膜結(jié)構(gòu)，膜結(jié)構(gòu)由下至上依次疊放樣品墊，吸水紙，玻璃纖 維素膜和硝酸纖維素膜。其中玻璃纖維素膜上包被有膠體金標(biāo)記鼠抗氯胺酮單克隆抗體和 膠體金標(biāo)記鼠抗嗎啡單克隆抗體。硝酸纖維素膜上含有嗎啡、氯胺酮抗原和一種羊抗鼠多 克隆抗體。與顯色孔對(duì)應(yīng)的硝酸纖維素膜上用點(diǎn)膜機(jī)分別劃定兩條檢測(cè)線和一條質(zhì)控線， 其中一條檢測(cè)線為氯胺酮完全抗原，另一條檢測(cè)線為嗎啡完全抗原；質(zhì)控線為純化后的羊 抗鼠IgG多抗。所述的玻璃纖維素膜上包被的膠體金標(biāo)記鼠抗氯胺酮單克隆抗體由如下方法制 成
1、氯胺酮結(jié)合抗原制備用重氮化法將半抗原氯胺酮偶聯(lián)于載體蛋白BSA，形成偶聯(lián) 抗原。制備過(guò)程如下，取5毫克氯胺酮溶于0. 1摩爾/升HCl，并預(yù)冷至0 5°C，加 入10毫克NaNO2, 4°C攪拌6小時(shí)。然后加入20毫克BSA(預(yù)先溶于0. 1摩爾/升磷酸鹽 緩沖液，PH8. 6)，4°C繼續(xù)攪拌6小時(shí)。用葡聚糖凝膠S印hadexG-25凝膠過(guò)濾純化偶聯(lián)物， 純化后凍干存于4°C備用。
2、小鼠免疫以BSA偶聯(lián)氯胺酮免疫8周齡BALB/C小鼠15只，免疫劑量50微 克/只，皮下分點(diǎn)注射。共免疫3次，每次免疫間隔3周。最后1次免疫10天后，斷尾 采血分離血清，用間接ELISA法檢測(cè)血清抗體效價(jià)。若效價(jià)>10_4即可用于細(xì)胞融合。3、脾細(xì)胞的制備末次免疫后3天摘眼球取血分離血清，并同時(shí)處死，浸泡碘酒5 分鐘，無(wú)菌解剖取脾，用RPMI1640培養(yǎng)液洗二次后，研磨通過(guò)100目不銹鋼網(wǎng)，獲得游離細(xì) 胞，再用氯化銨法溶解祛除紅細(xì)胞，然后計(jì)數(shù)脾細(xì)胞并用10% FBS-RPMI 1640培養(yǎng)液配制 成2X108個(gè)/毫升濃度用于細(xì)胞融合。4、SP2/0細(xì)胞的培養(yǎng)與細(xì)胞融合復(fù)蘇SP2/0細(xì)胞，于10% FBS-RPMI1640培養(yǎng)液 中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后配成4 XlO7個(gè)/ml細(xì)胞濃度；分別取配制的上述濃度的脾細(xì)胞和 SP2/0細(xì)胞各1毫升混合，使其比例為5 :1 ；然后加入50%PEG 1毫升，于37°C，5%C02孵箱內(nèi) 培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞融合。5、融合細(xì)胞的培養(yǎng)及陽(yáng)性雜交瘤的篩選與克隆融合后的細(xì)胞置37°C，5%C02培 養(yǎng)箱中以HAT、HT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)。用間接ELISA法以BSA偶聯(lián)氯胺酮微克/毫升包被酶 標(biāo)板進(jìn)行陽(yáng)性篩選。對(duì)強(qiáng)陽(yáng)性、細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的孔進(jìn)行3次有限稀釋克隆化。6、抗氯胺酮單克隆抗體的測(cè)定與制備給腹腔注射液體石蠟10天后的小鼠腹腔 注射克隆化細(xì)胞株IO7個(gè)細(xì)胞，7天后抽取腹水，以硫酸鈉鹽析法提純抗體，測(cè)其ELISA效 價(jià)。以檢測(cè)樣品于492納米波長(zhǎng)測(cè)得吸光值與陰性對(duì)照的比值> 2. 1定為陽(yáng)性，出現(xiàn)陽(yáng)性 結(jié)果的最大稀釋倍數(shù)為抗氯胺酮單克隆抗體的效價(jià)。測(cè)定后結(jié)果作為使用時(shí)稀釋倍數(shù)的依 據(jù)。7、膠體金制備將容積為1升三角燒瓶置于加熱磁力攪拌器上，加入500毫升蒸 餾水，加熱攪拌至90°C時(shí)，加入0.5毫升10%氯金酸溶液。將此溶液煮沸5分鐘，加入 1. 00毫升12%檸檬酸三鈉溶液，保持此溶液沸騰10分鐘，把此溶液從加熱磁力攪拌器上 取下。待溫度將至25°C時(shí)，裝到潔凈容器內(nèi)，4°C避光保存。8、膠體金-氯胺酮單克隆抗體結(jié)合物的制備已制備好的膠體金100毫升，用0. 1 摩爾/升碳酸鉀將溶液調(diào)至PH9. 0;在磁力快速攪拌下迅速加入抗氯胺酮單克隆抗體5毫 克，攪拌10分鐘后加入10%牛血清白蛋白1毫升，繼續(xù)攪拌10分鐘；高速冷凍離心機(jī)于 4°C，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘；棄上清，沉淀即為膠體金-氯胺酮單克隆抗體結(jié)合物。 用0. 01摩爾/升、pH8. 2 PBS緩沖液稀釋至一定濃度后，均勻浸在玻璃纖維膜上，37°C干 燥備用ο玻璃纖維素膜上包被的膠體金標(biāo)記鼠抗嗎啡單克隆抗體的制備按照上述步驟1-8 進(jìn)行。本發(fā)明采用高度特異性的抗原抗體反應(yīng)及免疫層析分析技術(shù)，通過(guò)單克隆抗體 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合原理，樣本中的嗎啡和氯胺酮分別與固相于硝酸纖維膜上嗎啡和氯胺酮的完全抗 原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合膠體金標(biāo)記的兩種相應(yīng)單克隆抗體，通過(guò)觀察檢測(cè)區(qū)的色帶情況判別樣本中 是否存在相應(yīng)毒品。本發(fā)明試卡采用同步檢測(cè)氯氨酮和嗎啡兩種毒品的方法，不但可以節(jié) 省檢材，可同時(shí)獲得更多的檢測(cè)信息，且試驗(yàn)可在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行，有利于實(shí)現(xiàn)檢案實(shí)踐對(duì)快速 和機(jī)動(dòng)的要求。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)迅速，目測(cè)判定結(jié)果，并可以在室溫長(zhǎng)期保存，將氯胺 酮、嗎啡兩種檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)于同一張?jiān)嚳ㄉ希Y(jié)果直觀，判別簡(jiǎn)捷，快速，可為國(guó)家的禁毒機(jī) 構(gòu)節(jié)省數(shù)目可觀的支出，為禁毒、查毒的普查工作提供技術(shù)支持。


圖1為本發(fā)明結(jié)構(gòu)剖面圖； 圖2為本發(fā)明陰性檢測(cè)結(jié)果圖3為本發(fā)明嗎啡陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果圖； 圖4為本發(fā)明氯胺酮陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果圖； 圖5為本發(fā)明無(wú)效檢測(cè)結(jié)果圖。附圖中部件標(biāo)號(hào)為1為磁白板；2為樣品墊；3為吸水紙；4為玻璃纖維素膜；5為 硝酸纖維素膜；6為加樣孔；7為顯色孔；8為塑料外殼。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例見(jiàn)圖1至圖5，一種嗎啡_氯胺酮膠體金法毒品檢測(cè)試卡，由一個(gè)封閉的塑料外殼 8包裝而成，該外殼的上層開(kāi)有顯色孔7和加樣孔6，在外殼內(nèi)腔裝有磁白板1，磁白板上 覆有膜結(jié)構(gòu)，膜結(jié)構(gòu)由下至上依次疊放樣品墊2，吸水紙3，玻璃纖維素膜4和硝酸纖維素 膜5。其中玻璃纖維素膜上包被有膠體金標(biāo)記鼠抗氯胺酮單克隆抗體和膠體金標(biāo)記鼠抗嗎 啡單克隆抗體。硝酸纖維素膜上含有嗎啡、氯胺酮抗原和一種羊抗鼠多克隆抗體。與顯色 孔對(duì)應(yīng)的硝酸纖維素膜上用點(diǎn)膜機(jī)分別劃定兩條檢測(cè)線和一條質(zhì)控線，其中一條檢測(cè)線為 氯胺酮完全抗原，另一條檢測(cè)線為嗎啡完全抗原；質(zhì)控線為純化后的羊抗鼠IgG多克隆 抗體。所述的玻璃纖維素膜上包被的膠體金標(biāo)記鼠抗氯胺酮單克隆抗體由如下方法制 成
1、氯胺酮結(jié)合抗原制備用重氮化法將半抗原氯胺酮偶聯(lián)于載體蛋白BSA，形成偶聯(lián) 抗原。制備過(guò)程如下，取5毫克氯胺酮溶于0. 1摩爾/升HCl，并預(yù)冷至0 5°C，加 入10毫克NaNO2, 4°C攪拌6小時(shí)。然后加入20毫克BSA(預(yù)先溶于0. 1摩爾/升磷酸鹽 緩沖液，PH8. 6)，4°C繼續(xù)攪拌6小時(shí)。用葡聚糖凝膠S印hadexG-25凝膠過(guò)濾純化偶聯(lián)物， 純化后凍干存于4°C備用。2、小鼠免疫以BSA偶聯(lián)氯胺酮免疫8周齡BALB/C小鼠15只，免疫劑量50微 克/只，皮下分點(diǎn)注射。共免疫3次，每次免疫間隔3周。最后1次免疫10天后，斷尾 采血分離血清，用間接ELISA法檢測(cè)血清抗體效價(jià)。若效價(jià)>10_4即可用于細(xì)胞融合。3、脾細(xì)胞的制備末次免疫后3天摘眼球取血分離血清，并同時(shí)處死，浸泡碘酒5 分鐘，無(wú)菌解剖取脾，用RPMI1640培養(yǎng)液洗二次后，研磨通過(guò)100目不銹鋼網(wǎng)，獲得游離細(xì) 胞，再用氯化銨法溶解祛除紅細(xì)胞，然后計(jì)數(shù)脾細(xì)胞并用10% FBS-RPMI 1640培養(yǎng)液配制 成2X108個(gè)/毫升濃度用于細(xì)胞融合。4、SP2/0細(xì)胞的培養(yǎng)與細(xì)胞融合復(fù)蘇SP2/0細(xì)胞，于10% FBS-RPMI1640培養(yǎng)液 中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后配成4 XlO7個(gè)/ml細(xì)胞濃度；分別取配制的上述濃度的脾細(xì)胞和 SP2/0細(xì)胞各1毫升混合，使其比例為5 :1 ；然后加入50%PEG 1毫升，于37°C，5%C02孵箱內(nèi) 培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞融合。
5、融合細(xì)胞的培養(yǎng)及陽(yáng)性雜交瘤的篩選與克隆融合后的細(xì)胞置37°C，5%C02培 養(yǎng)箱中以HAT、HT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)。用間接ELISA法以BSA偶聯(lián)氯胺酮5微克/毫升包被 酶標(biāo)板進(jìn)行陽(yáng)性篩選。對(duì)強(qiáng)陽(yáng)性、細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的孔進(jìn)行3次有限稀釋克隆化。6、抗氯胺酮單克隆抗體的測(cè)定與制備給腹腔注射液體石蠟10天后的小鼠腹腔 注射克隆化細(xì)胞株IO7個(gè)細(xì)胞，7天后抽取腹水，以硫酸鈉鹽析法提純抗體，測(cè)其ELISA效 價(jià)。以檢測(cè)樣品于492納米波長(zhǎng)測(cè)得吸光值與陰性對(duì)照的比值> 2. 1定為陽(yáng)性，出現(xiàn)陽(yáng)性 結(jié)果的最大稀釋倍數(shù)為抗氯胺酮單克隆抗體的效價(jià)。測(cè)定后結(jié)果作為使用時(shí)稀釋倍數(shù)的依 據(jù)。7、膠體金制備將容積為1升三角燒瓶置于加熱磁力攪拌器上，加入500毫升蒸 餾水，加熱攪拌至90°C時(shí)，加入0.5毫升10%氯金酸溶液。將此溶液煮沸5分鐘，加入 1. 00毫升12%檸檬酸三鈉溶液，保持此溶液沸騰10分鐘，把此溶液從加熱磁力攪拌器上 取下。待溫度將至25°C時(shí)，裝到潔凈容器內(nèi)，4°C避光保存。8、膠體金-氯胺酮單克隆抗體結(jié)合物的制備已制備好的膠體金100毫升，用0. 1 摩爾/升碳酸鉀將溶液調(diào)至PH9. 0;在磁力快速攪拌下迅速加入抗氯胺酮單克隆抗體5毫 克，攪拌10分鐘后加入10%牛血清白蛋白1毫升，繼續(xù)攪拌10分鐘；高速冷凍離心機(jī)于 412000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘；棄上清，沉淀即為膠體金-氯胺酮單克隆抗體結(jié)合物。 用0. 01摩爾/升、pH8. 2 PBS緩沖液稀釋至一定濃度后，均勻浸在玻璃纖維膜上，此為膠 體金_氯胺酮單克隆抗體結(jié)合物，37°C干燥備用。所述的玻璃纖維素膜上包被的膠體金標(biāo)記鼠抗嗎啡單克隆抗體由如下方法制 成
1、嗎啡結(jié)合抗原制備用重氮化法將半抗原氯胺酮偶聯(lián)于載體蛋白BSA，形成偶聯(lián)抗 原。制備過(guò)程如下，取5毫克嗎啡溶于0. 1摩爾/升HCl，并預(yù)冷至0 5°C，加入10 毫克NaNO2, 4°C攪拌6小時(shí)。然后加入20毫克BSA(預(yù)先溶于0. 1摩爾/升磷酸鹽緩沖 液，pH8. 6)，4°C繼續(xù)攪拌6小時(shí)。用葡聚糖凝膠S印hadexG-25凝膠過(guò)濾純化偶聯(lián)物，純化 后凍干存于4°C備用。2、小鼠免疫以BSA偶聯(lián)氯胺酮免疫8周齡BALB/C小鼠15只，免疫劑量50微 克/只，皮下分點(diǎn)注射。共免疫3次，每次免疫間隔3周。最后1次免疫10天后，斷尾 采血分離血清，用間接ELISA法檢測(cè)血清抗體效價(jià)。若效價(jià)>10_4即可用于細(xì)胞融合。3、脾細(xì)胞的制備末次免疫后3天摘眼球取血分離血清，并同時(shí)處死，浸泡碘酒5 分鐘，無(wú)菌解剖取脾，用RPMI1640培養(yǎng)液洗二次后，研磨通過(guò)100目不銹鋼網(wǎng)，獲得游離細(xì) 胞，再用氯化銨法溶解祛除紅細(xì)胞，然后計(jì)數(shù)脾細(xì)胞并用10% FBS-RPMI 1640培養(yǎng)液配制 成2X108個(gè)/毫升濃度用于細(xì)胞融合。4、SP2/0細(xì)胞的培養(yǎng)與細(xì)胞融合復(fù)蘇SP2/0細(xì)胞，于10% FBS-RPMI1640培養(yǎng)液 中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后配成4 XlO7個(gè)/ml細(xì)胞濃度；分別取配制的上述濃度的脾細(xì)胞和 SP2/0細(xì)胞各1毫升混合，使其比例為5 :1 ；然后加入50%PEG 1毫升，于37°C，5%C02孵箱內(nèi) 培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞融合。5、融合細(xì)胞的培養(yǎng)及陽(yáng)性雜交瘤的篩選與克隆融合后的細(xì)胞置37°C，5%C02培 養(yǎng)箱中以HAT、HT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)。用間接ELISA法以BSA偶聯(lián)嗎啡5微克/毫升包被酶 標(biāo)板進(jìn)行陽(yáng)性篩選。對(duì)強(qiáng)陽(yáng)性、細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的孔進(jìn)行3次有限稀釋克隆化。
6、抗氯胺酮單克隆抗體的測(cè)定與制備給腹腔注射液體石蠟10天后的小鼠腹腔 注射克隆化細(xì)胞株IO7個(gè)細(xì)胞，7天后抽取腹水，以硫酸鈉鹽析法提純抗體，測(cè)其ELISA效 價(jià)。以檢測(cè)樣品于492納米波長(zhǎng)測(cè)得吸光值與陰性對(duì)照的比值>2. 1定為陽(yáng)性，出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié) 果的最大稀釋倍數(shù)為抗嗎啡單克隆抗體的效價(jià)。測(cè)定后結(jié)果作為使用時(shí)稀釋倍數(shù)的依據(jù)。7、膠體金制備將容積為1升三角燒瓶置于加熱磁力攪拌器上，加入500毫升蒸 餾水，加熱攪拌至90°C時(shí)，加入0.5毫升10%氯金酸溶液。將此溶液煮沸5分鐘，加入 1. 00毫升12%檸檬酸三鈉溶液，保持此溶液沸騰10分鐘，把此溶液從加熱磁力攪拌器上 取下。待溫度將至25°C時(shí)，裝到潔凈容器內(nèi)，4°C避光保存。8、膠體金-嗎啡單克隆抗體結(jié)合物的制備已制備好的膠體金100毫升，用0. 1 摩爾/升碳酸鉀將溶液調(diào)至PH9. 0 ；在磁力快速攪拌下迅速加入抗嗎啡單克隆抗體5毫克， 攪拌10分鐘后加入10%牛血清白蛋白1毫升，繼續(xù)攪拌10分鐘；高速冷凍離心機(jī)于4°C， 12000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘；棄上清，沉淀即為膠體金-嗎啡單克隆抗體結(jié)合物。用0.01 摩爾/升、PH8.2 PBS緩沖液稀釋至一定濃度后，均勻浸在玻璃纖維膜上，此為膠體金-嗎 啡單克隆抗體結(jié)合物，37°C干燥備用。檢測(cè)方法測(cè)試前應(yīng)將試卡置于室溫，將尿液收集在干凈尿杯中；吸取尿樣至吸 管的刻度線(約0. 2毫升)，然后滴入檢測(cè)卡的加樣孔6中，在2分鐘左右開(kāi)始于顯色孔7 顯色，10分鐘之內(nèi)判讀結(jié)果。陰性顯示三條紅線(9，10，11)，三條紅線的強(qiáng)度可以不一致，見(jiàn)圖2 ；嗎啡陽(yáng)性 顯示兩條紅線(9，11)，由于樣品中嗎啡與膠體金標(biāo)記抗體結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)抑制了顯色孔內(nèi)包被 的嗎啡抗原與膠體金標(biāo)記抗體結(jié)合，因此10線無(wú)顯示，見(jiàn)圖3 ；氯胺酮陽(yáng)性顯示兩條紅線 (9，10)，由于樣品中氯胺酮與膠體金標(biāo)記抗體結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)抑制了顯色孔內(nèi)包被的氯胺酮抗 原與膠體金標(biāo)記抗體結(jié)合，因此11線無(wú)顯示，見(jiàn)圖4 ；無(wú)效9，10，11均無(wú)顯示，見(jiàn)圖5。制得的檢測(cè)試卡的靈敏度為當(dāng)被檢對(duì)象體內(nèi)嗎啡濃度大于300納克/毫升時(shí)，氯 胺酮濃度大于1000納克/毫升時(shí)為陽(yáng)性，低于此濃度為陰性。
權(quán)利要求
1.一種嗎啡-氯胺酮膠體金法毒品檢測(cè)試卡，其特征是本發(fā)明由一個(gè)封閉的塑料外 殼包裝而成，該外殼的上層開(kāi)有顯色孔和加樣孔，在外殼內(nèi)腔裝有磁白板，磁白板上覆有 膜結(jié)構(gòu)，膜結(jié)構(gòu)由下至上依次疊放樣品墊，吸水紙，玻璃纖維素膜和硝酸纖維素膜；其中 玻璃纖維素膜上包被有膠體金標(biāo)記鼠抗氯胺酮單克隆抗體和膠體金標(biāo)記鼠抗嗎啡單克隆 抗體；硝酸纖維素膜上含有嗎啡、氯胺酮抗原和一種羊抗鼠多克隆抗體；與顯色孔對(duì)應(yīng)的 硝酸纖維素膜上用點(diǎn)膜機(jī)分別劃定兩條檢測(cè)線和一條質(zhì)控線，其中一條檢測(cè)線為氯胺酮完 全抗原，另一條檢測(cè)線為嗎啡完全抗原；質(zhì)控線為純化后的羊抗鼠IgG多抗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種嗎啡-氯胺酮膠體金法毒品檢測(cè)試卡，其特征是所 述的玻璃纖維素膜上包被的膠體金標(biāo)記鼠抗氯胺酮單克隆抗體由如下方法制成(1)、氯 胺酮結(jié)合抗原制備用重氮化法將半抗原氯胺酮偶聯(lián)于載體蛋白BSA，形成偶聯(lián)抗原；制 備過(guò)程如下，取5毫克氯胺酮溶于0. 1摩爾/升HCl，并預(yù)冷至0 5°C，加入10毫 克NaNO2, 4°C攪拌6小時(shí)；然后加入20毫克BSA(預(yù)先溶于0. 1摩爾/升磷酸鹽緩沖 液，pH8. 6)，4°C繼續(xù)攪拌6小時(shí)；用葡聚糖凝膠kphadexG-25凝膠過(guò)濾純化偶聯(lián)物，純化 后凍干存于4°C備用；(2)、小鼠免疫以BSA偶聯(lián)氯胺酮免疫8周齡BALB/C小鼠15只， 免疫劑量50微克/只，皮下分點(diǎn)注射；共免疫3次，每次免疫間隔3周；最后1次免疫10 天后，斷尾采血分離血清，用間接ELISA法檢測(cè)血清抗體效價(jià)；若效價(jià)>10_4即可用于細(xì) 胞融合；(3)、脾細(xì)胞的制備末次免疫后3天摘眼球取血分離血清，并同時(shí)處死，浸泡碘酒 5分鐘，無(wú)菌解剖取脾，用RPMI1640培養(yǎng)液洗二次后，研磨通過(guò)100目不銹鋼網(wǎng)，獲得游離細(xì) 胞，再用氯化銨法溶解祛除紅細(xì)胞，然后計(jì)數(shù)脾細(xì)胞并用10% FBS-RPMI 1640培養(yǎng)液配制 成2X108個(gè)/毫升濃度用于細(xì)胞融合；(4)、SP2/0細(xì)胞的培養(yǎng)與細(xì)胞融合復(fù)蘇SP2/0細(xì)胞， 于10% FBS-RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后配成4 XlO7個(gè)/ml細(xì)胞濃度；分別取 配制的上述濃度的脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞各1毫升混合，使其比例為5 :1 ；然后加入50%PEG 1 毫升，于37°C，5%C02孵箱內(nèi)培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞融合；(5)、融合細(xì)胞的培養(yǎng)及陽(yáng)性雜交瘤的篩選 與克隆融合后的細(xì)胞置37°C，5%C02培養(yǎng)箱中以HAT、HT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)；用間接ELISA 法以BSA偶聯(lián)氯胺酮微克/毫升包被酶標(biāo)板進(jìn)行陽(yáng)性篩選；對(duì)強(qiáng)陽(yáng)性、細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的孔進(jìn) 行3次有限稀釋克隆化；(6)、抗氯胺酮單克隆抗體的測(cè)定與制備給腹腔注射液體石蠟10 天后的小鼠腹腔注射克隆化細(xì)胞株IO7個(gè)細(xì)胞，7天后抽取腹水，以硫酸鈉鹽析法提純抗 體，測(cè)其ELISA效價(jià)；以檢測(cè)樣品于492納米波長(zhǎng)測(cè)得吸光值與陰性對(duì)照的比值彡2. 1定 為陽(yáng)性，出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的最大稀釋倍數(shù)為抗氯胺酮單克隆抗體的效價(jià)；測(cè)定后結(jié)果作為使 用時(shí)稀釋倍數(shù)的依據(jù)；(7)、膠體金制備將容積為1升三角燒瓶置于加熱磁力攪拌器上， 加入500毫升蒸餾水，加熱攪拌至90°C時(shí)，加入0. 5毫升10%氯金酸溶液；將此溶液煮沸5 分鐘，加入1. 00毫升1 檸檬酸三鈉溶液，保持此溶液沸騰10分鐘，把此溶液從加熱磁 力攪拌器上取下；待溫度將至25°C時(shí)，裝到潔凈容器內(nèi)，4°C避光保存；(8)、膠體金-氯胺 酮單克隆抗體結(jié)合物的制備已制備好的膠體金100毫升，用0. 1摩爾/升碳酸鉀將溶液 調(diào)至PH9. 0;在磁力快速攪拌下迅速加入抗氯胺酮單克隆抗體5毫克，攪拌10分鐘后加入 10%牛血清白蛋白1毫升，繼續(xù)攪拌10分鐘；高速冷凍離心機(jī)于4°C，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心 30分鐘；棄上清，沉淀即為膠體金-氯胺酮單克隆抗體結(jié)合物；用0. 01摩爾/升、pH8. 2 PBS緩沖液稀釋至一定濃度后，均勻浸在玻璃纖維膜上，37°C干燥備用。
全文摘要
一種嗎啡-氯胺酮膠體金法毒品檢測(cè)試卡，由一個(gè)封閉的塑料外殼包裝而成,該外殼的上層開(kāi)有顯色孔和加樣孔,在外殼內(nèi)腔裝有磁白板，磁白板上覆有膜結(jié)構(gòu)，膜結(jié)構(gòu)由下至上依次疊放樣品墊，吸水紙,玻璃纖維素膜和硝酸纖維素膜；其中玻璃纖維素膜上包被有膠體金標(biāo)記鼠抗氯胺酮單克隆抗體和膠體金標(biāo)記鼠抗嗎啡單克隆抗體；硝酸纖維素膜上含有嗎啡、氯胺酮抗原和一種羊抗鼠多克隆抗體。本發(fā)明所說(shuō)的檢測(cè)試卡可同步檢測(cè)氯氨酮、和嗎啡等兩種毒品，并且快速、準(zhǔn)確和節(jié)省檢材。
文檔編號(hào)G01N33/64GK102128930SQ20101057868
公開(kāi)日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2010年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月8日
發(fā)明者姜燕 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)大學(xué)